[논문]RWPE-1 전립선세포에서 eritadenine을 함유한 신령버섯균사체 액체배양물의 항염증효과 및 항산화효과에 의한 전립선비대증 관련 biochemical marker 개선 효과

하영래; 문연규; 김나현; 허정두; 조민정; 김예라; 김영숙; 김정옥

doi:10.5352/jls.2018.28.10.1147

RWPE-1 전립선세포에서 eritadenine을 함유한 신령버섯균사체 액체배양물의 항염증효과 및 항산화효과에 의한 전립선비대증 관련 biochemical marker 개선 효과
Agaricus blazei Mycelial Liquid Culture Extract Containing Eritadenine Improves Benign Prostatic Hyperplasia-related Biochemical Markers in RWPE-1 Cells through Anti-inflammatory and Anti-oxidative Actions 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.10 = no.222, 2018년, pp.1147 - 1155

하영래 (HKBiotech 항노화연구소) , 문연규 (한국독성연구소 경남환경독성본부) , 김나현 (한국독성연구소 경남환경독성본부) , 허정두 (한국독성연구소 경남환경독성본부) , 조민정 (HKBiotech 항노화연구소) , 김예라 (HKBiotech 항노화연구소) , 김영숙 (HKBiotech 항노화연구소) , 김정옥 (HKBiotech 항노화연구소)

초록
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신령버섯균사체 액체배양 추출물(Agaricus blazei mycelial liquid culture extract, ABMLCE)은 TM-3 mouse Leydig 고환세포에서 testosterone (TS)의 생성을 촉진하였다. 이번 연구에서는 eritadenine (EA, 15.3 mg/100 g)을 함유한 ABMLCE가 RWPE-1 전립선세포에서 전립선비대증(Benign prostatic hyperplasia, BPH) 관련 핵심 효소인 $5{\alpha}-reductase$ 2 ($5{\alpha}-R2$) 활성과 dihydrotestosterone (DHT) 함량을 감소시켰음을 보고한다. RWPE-1 전립선 세포는 24-well plate에서 ABMLCE (0~50 ppm), EA (0~10 ppm,), finasteride (FS $10{\mu}M$: positive Control)를 함유한 Keratinocyte serum-free medium (K-SFM)에서 24시간 배양하였다. 시료처리 세포배양액에 대해 $5{\alpha}-R2$, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), cyclooxygenase-2 (COX-2) 효소활성, TS, DHT, tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$)와 $interleukin-1{\beta}$ ($IL-1{\beta}$)를 assay kit를 사용하여 분석하였다. $5{\alpha}-R2$ 활성과 DHT 함량은 ABMLCE의 농도 의존적으로 유의성(p<0.05) 있게 감소되었고, SOD와 CAT 효소활성은 유의성(p<0.05) 있게 증가되었다. 반면에 COX-2 활성과 $TNF-{\alpha}$ 및 $IL-1{\beta}$의 함량은 감소되었다(p<0.05). 마찬가지로 EA의 효과도 ABMLCE 효과와 유사하였다. ABMLCE 50 ppm과 EA 10 ppm의 $5{\alpha}-R2$ 및 DHT 감소효과는 FS $10{\mu}M$ 효과와 유사하였다. 이들 결과는 ABMLCE와 EA는 항염증효과와 항산화효과를 통하여 BPH 유발 핵심 인자인 $5{\alpha}-R2$ 효소활성과 DHT 함량을 감소시켰다. 또한 이 결과는 EA를 함유하는 ABMLCE는 인체 BPH 개선 소재로 활용할 수 있음을 의미한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Agaricus blazei mycelial liquid culture extract (ABMLCE) promoted the production of testosterone (TS) in TM-3 mouse Leydig testis cells. Now, we report that ABMLCE containing eritadenine (EA) as a minor constituent (15.3 mg/100 g) reduced $5{\alpha}-reductase$ 2 ($5{\alpha}-R2$) enzyme activity and dihydrotestosterone (DHT) content which are key constituents for the benign prostatic hyperplasia (BPH) inductions. RWPE-1 prostate cells were grown in a Keratinocyte serum-free medium (K-SFM) containing ABMLCE (0~50 ppm), EA (0~10 ppm,), and finasteride (FS $10{\mu}M$: a positive control) in a 24-well plate for 24 hr. Supernatants collected from cell-cultured media were used for the assay of $5{\alpha}-R2$, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and cyclooxygenase-2 (COX-2) enzyme activities, and for TS, DHT, tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$) and $interleukin-1{\beta}$ ($IL-1{\beta}$) contents by their assay kits. The $5{\alpha}-R2$ activity and DHT content were proportionally reduced (p<0.05) to concentrations of ABMLCE. The SOD and CAT enzyme activities were significantly (p<0.05) elevated concomitant with ABMLCE concentrations, while COX-2, $TNF-{\alpha}$ and $IL-1{\beta}$ showed reverse results (p<0.05). Similarly, the effects of EA were similar to those of ABMLCE. Efficacies of ABMLCE 50 ppm and EA 10 ppm in $5{\alpha}-R2$ and DHT reduction were similar to those of $10{\mu}M$ FS. These results suggest that ABMLCE and EA reduced $5{\alpha}-R2$ and DHT through their anti-inflammatory and anti-oxidative actions. This implies that ABMLCE containing EA could be a beneficial material in the cure of BPH in humans.

주제어

표/그림 (7)

$Table 1. Relative survival rate of RWPE-1 cells treated with ABMLCE fractions$ 표 Table 1. Relative survival rate of RWPE-1 cells treated with ABMLCE fractions
$Table 2. Relative 5α-R2 enzyme activity of RWPE-1 cells treated with ABMLCE fractions$ 표 Table 2. Relative 5α-R2 enzyme activity of RWPE-1 cells treated with ABMLCE fractions
그림 Fig. 1. Influence of a hot-water extract of ABMLCE on some biochemical markers related to BPH in RWPE-1 cells. Means with different small superscripts in the same panel represent significantly difference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 2. Influence of a hot-water extract of ABMLCE on some anti-oxidative enzyme activity and inflammatory cytokines re-lated to BPH in RWPE-1 cells. Means with different small superscripts in the same panel represent significantly dif-ference at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 3. Influence of EA on some biochemical markers related to BPH in RWPE-1 cells. Means with different small superscripts on the same line represent significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
그림 Fig. 4. Typical HPLC chromatograms of authentic EA (A) and EA from ABMLCE sample (A). Chromatograms were obtained using the Agilent Technologies 1200 series HPLC equipped with a ZORBAX Eclipse XDB-C18 column (4.6x250 mm, 5 μm particle size) and detected at 260 nm [25].
그림 Fig. 5. Proposed mechanisms of BPH suppression by ABMLCE containing EA.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 EA를 함유한 ABMLCE의 RWPE-1 전립선 세포에서 BPH와 관련된 biochemical marker 개선효과를 연구하였다.

제안 방법

Table 1은 ABMLCE (원액, 상등액, 침전물)의 RWPE- 1 세포에 대한 생존율을 나타내고 있다. ABMLCE 분획물을 배양배지에 0, 10, 50, 250 ppm 되게 처리하고 24 hr 배양한 다음 CCK-8로 세포 생존율을 조사하였다. 원액, 상등액 및 침전물은 농도 의존적으로 세포생존율을 감소시켰다.
ABMLCE 시료 처리는 RWPE-1 전립선세포의 항산화 효소인 SOD와 CAT 활성을 증가시켰고, 염증 관련 COX-2 효소활성과 TNF-α 및 IL-1β 함량을 감소시켰다(Fig. 2).
AB균사체를 삼각플라스크[500 ml; 배지(탈지대두분 1.5%, 황백당 0.5% MgSO4 0.05%, KH2PO4 0.01%) 200 ml 함유]에서 7일간 배양(25℃, 200 rpm; Lab Tech LSI-3016R, Namyangju,Korea)하고, 고압추출(121℃, 15 min)하였다. 이 추출물을 원심분리(4℃, 7,000 rpm, 20 min; Labgene 1580R, Seoul, Korea)하여 상등액을 회수하여 진공농축(<65℃, Brix 45; Rotavapor R-300, Buchi, Flawil, Switzerland)하여 ABMLCE 원액 시료를 조제하였다.
EA 시료 처리는 RWPE-1 전립선세포에서 BPH 유발 핵심 인자인 5α-R2 효소의 활성 억제와 DHT 함량을 감소시켰으며 항산화 효소 인 CAT 효소활성을 증가시켰고, 염증인자 인TNF-α 함량을 감소시켰다(Fig. 3).
RWPE-1 전립선세포에 ABMLCE 시료 처리와 FS (positive control) 처리는 BPH 유발 핵심 효소인 5α-R2 효소활성과 핵심 물질인 DHT 함량을 감소시켰고, TS 함량과 HSD3B4 효소 활성을 증가시켰다(Fig. 1).
SOD와 CAT 효소활성 및 TNF-α와 IL-1 β 함량은 external standard curve로부터 계산하였다.
TS 및 DHT assay kit의 well에 시료 100 μl 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
TS 및 DHT assay kit의 well에 시료 100 μl 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다. TS 및 DHT 함량은 external standard curve로부터 계산하였다.
각 assay kit의 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
각 assay kit의 well에 100 μl 시료를 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다. 각 효소활성은 external standard curve로부터 계산하였다.
따라서 이후 BPH 개선 연구에서는 RWPE-1 세포 생존율에 영향 가장 우수한 효과를 보였고(Table 1), 5α-R2의 활성을 효율적으로 억제(Table 2)한 ABMLCE 원액(이후 ABMLCE) 50 ppm 이하의 농도를 사용하였다.
배양한 각 well에 CCK-8 시약 10 μl를 첨가하고 2 hr 더 배양(37℃, 5% CO₂ incubator; Thermo Fisher Scientific)하였다. 생성된 DCF fluorescence를 490 nm (Synergy H1 Multi reader; BioTek, St, Louis, MO)에서 측정하여 cell viability를 계산하였다. 시료는ABMLCE (0, 5, 10, 50, 250 ppm)와 EA (0, 1, 5, 10 ppm)였다.
시료를 RWPE-1 cell에 처리하여 얻은 K-SFM (1% P/S) 배양액의 TS 및 DHT 함량은 TS assay kit (BioVision Inc., Mountain View, CA) 및 DHT assay kit (BioVision Inc.)로 분석하였다. TS 및 DHT assay kit의 well에 시료 100 μl 첨가하고 제조사의 manual에 따라 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
시료를 처리한 RWPE-1 cell로부터 얻은 K-SFM (1% P/S) 배양물 시료 100 μl에 대한 SOD, CAT, TNF-α 및 IL-1 β 측정은 각각의 assay kit (BioVision Inc.)를 사용하여 제조사의 manual에 준하여 분석하여 450 nm에서 흡광도(Synergy H1 Multi reader)를 측정하였다.
시료를 처리한 RWPE-1 cell로부터 얻은 K-SFM (1% P/S) 배양물의 5α-R2 효소 및 HSD3B4 활성은 5α-R2 assay kit (MyBioSource, San Diego, CA) 및 HSD3B4 assay kit (MyBioSource)로 분석하였다.
이 추출물을 원심분리(4℃, 7,000 rpm, 20 min; Labgene 1580R, Seoul, Korea)하여 상등액을 회수하여 진공농축(<65℃, Brix 45; Rotavapor R-300, Buchi, Flawil, Switzerland)하여 ABMLCE 원액 시료를 조제하였다. 이 ABMLCE 원액 시료를 70% ethanol 침전물과 상등액으로 분획하여 각각 ABMLCE 상등액 시료와 ABMLCE 침전물 시료로 사용하였다.
이 추출물을 원심분리(4℃, 7,000 rpm, 20 min; Labgene 1580R, Seoul, Korea)하여 상등액을 회수하여 진공농축(<65℃, Brix 45; Rotavapor R-300, Buchi, Flawil, Switzerland)하여 ABMLCE 원액 시료를 조제하였다.

대상 데이터

Chromatograms were obtained using the Agilent Technologies 1200 series HPLC equipped with a ZORBAX Eclipse XDB-C18 column (4.6x250 mm, 5 μm particle size) and detected at 260 nm [25].
시료의 EA 함량 측정은 Moon 등의 reversed-phase HPLC system으로 external standard 방법으로 측정하였다[25]. EA 표준물질은 Santa Cruz Biotech (Dallas, TX)로부터 구입하였다.
여기에 Control [K-SFM (1% P/S) 200 μl] 및 시료[K-SFM (1% P/S) 150 μl + sample 50 μl]를 처리하고 다시 24 hr (37℃, 5% CO₂) 배양하였다. 배양물은 회수하여 biochemical markers 측정용 시료로 사용하였다. 시료는 ABMLCE (0, 10, 50, 10 ppm)와 EA (0, 1, 5, 10 ppm)이었다.
배양물은 회수하여 biochemical markers 측정용 시료로 사용하였다. 시료는 ABMLCE (0, 10, 50, 10 ppm)와 EA (0, 1, 5, 10 ppm)이었다.
생성된 DCF fluorescence를 490 nm (Synergy H1 Multi reader; BioTek, St, Louis, MO)에서 측정하여 cell viability를 계산하였다. 시료는ABMLCE (0, 5, 10, 50, 250 ppm)와 EA (0, 1, 5, 10 ppm)였다.

데이터처리

2)Means (n=3) with different small superscript letters of same column and large superscript letters of same row represent significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Data는 Mean±SD로 나타내었으며, GraphPad Prisam (version 5.01, GraphPad Software, Inc., CA)을 이용하여 one-way ANOVA로 분석하다.
Means with different small superscripts in the same panel represent significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Means with different small superscripts on the same line represent significantly difference at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Mean간의 유의성 검증은 Tukey’s w test로 검증하였고, 유의성은 p<0.05 이상으로 나타내었다.

이론/모형

ABMLCE의 EA 함량을 Moon 등[25]의 방법으로 측정하였다. Fig.
시료의 EA 함량 측정은 Moon 등의 reversed-phase HPLC system으로 external standard 방법으로 측정하였다[25]. EA 표준물질은 Santa Cruz Biotech (Dallas, TX)로부터 구입하였다.
시료처리에 의한 cell viability는 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Japan)의 분석 manual에 따라 측정하였다. 상기에서 배양한 RWPE-1 세포(1x105)가 함유된 96 well plate의 well에 Control 처리(DMEM 100 μl) 및 시료 처리(DMEM 75 μl+ sample 25 μl)를 하고 다시 24 hr 배양(37℃, 5% CO₂ incubator; Thermo Fisher Scientific)하였다.

성능/효과

CAT 효소활성도 ABMLCE 처리 농도에 따라 유의성 있게 증가 되었지만, FS처리 효과보다 낮았다. ABMLCE 시료 처리는 RWPE-1 세포에서 항염증효과를 보였다. COX-2 효소활성, TNF-α및 IL-1β 함량은 시료 처리 농도에 따라 유의성 있게 감소(p<0.
SOD 효소활성은 ABMLCE 처리 농도에 따라 유의성 있게 증가 되어 50ppm 처리 효과는 FS 처리와 유사하였다. CAT 효소활성도 ABMLCE 처리 농도에 따라 유의성 있게 증가 되었지만, FS처리 효과보다 낮았다. ABMLCE 시료 처리는 RWPE-1 세포에서 항염증효과를 보였다.
COX-2 효소활성, TNF-α및 IL-1β 함량은 시료 처리 농도에 따라 유의성 있게 감소(p<0.05)되었지만, 이들의 효과는 FS보다 낮았다.
따라서 본 연구의 ABMLCE가 RWPE-1 세포의 5α-R2 효소활성을 억제하여 DHT 생성을 억제하고, TS의 함량을 증가시킨 결과는 합성 FS를 BPH 치료제로 사용할 때 나타나는 부작용(성기능 저하와 TS 생산 저하로 인한 발기부전)을 보완할 수 있는 BPH 예방 및 치료제로 개발할 수 있음을 의미한다.
05). 따라서 세 분획 중 ABMLCE 원액 50 ppm 농도가 RWPE-1 세포 생존율에 가장 우수한 효과를 보였다.
따라서 이들 보고 결과와 마찬가지로 ABMLCE의 항산화성 및 항염증성이 RWPE-1 전립선세포의 TNF-α와 IL-1 β의 함량 감소와 COX-2 효소활성을 억제하였다.
또한, 원액, 상등액 및 침전물 50 ppm 처리 농도에서의 세포생존율을 비교할 때, 원액에 비해 상등액과 침전물이 세포 생존율을 유의적으로 감소시켰다(p<0.05).
본 연구에서 ABMLCE가 RWPE-1 전립선세포의 BPH 예방 및 치료를 위한 핵심 효소인 5α-R2 효소활성을 감소시킴과 동시에 핵심 물질인 DHT 함량을 감소시킴을 확인하였다.
대부분의 식용이나 약용버섯 자실체에 EA가 함유되어 있었고, 그 중 EA가 가장 많이 함유된 버섯은 표고버섯 자실체(Lentinus edodes: 642mg/100 g 건중)이었고, AB자실체에는 403 mg/100 g (건중)함유되어 있다고 보고되었다[1]. 본 연구에서 사용한 ABMLCE의 EA의 함량(15.3 mg/100 g)은 AB자실체보다 함량이 낮았다.
세 분획물은 농도 의존적으로 5α-R2의 활성을 억제하였다, 원액, 상등액 및 침전물 50 ppm 농도 처리는 5α-R2의 활성을 Control 처리에 비해 각각 52.8%, 55.9%, 52.1%로 감소시켰다(p<0.05).
원액 50 ppm 처리는 세포 생존율에 영향을 미치지 않았지만, 상등액과 침전물 50 ppm 처리는 세포생존율을 Control 처리에 비해 유의적으로 각각 91.4%, 93.4%로 감소시켰다(p<0.05).
또한 AB자실체나 ABMLCE에 상당량의 tocopherol, ergosterol, agaritine, phenolic compounds, nucleotide, nucleoside 등의 이차대사산물을 함유하고 있어 항산화성을 비롯한 다양한 생리활성 나타낸다고 보고되었다[18, 22, 28]. 이들 보고 결과와 마찬가지로 본 연구의 ABMLCE가 RWPE-1 전립선세포의 SOD와 CAT 효소활성을 증가시켜 free radical을 소거함으로써, BPH 생성을 억제하는 것으로 판단된다.
이와 같은 효과는 ABMLCE의 항염증효과(COX-2 효소활성 감소, TNF-α와 IL-1b 함량 감소)와 항산화효과(SOD 효소 및 CAT 효소활성 증가)에 기인하며, EA가 이들 효과에 관여함을 확인하였다(Fig. 5).

후속연구

따라서 EA가 ABMLCE의 RWPE-1 전립선세포에서 BPH 관련 biochemical marker 개선 결과에 일부 기여하였을 것이다. 그러나 아직 RWPE-1 세포에서 EA의 항산화성 및 항염증성 효과 증가 기전에 관한 연구가 더 수행되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	신령버섯의 어떤 특징을 가진 버섯인가?	신령버섯(Agaricus blazei Murill, AB)은 β-D-glucan, polyphenol, eritadenine (EA) 등과 같은 수많은 2차대사산물을 함유하고 있어, 항암성, 항산화성, 면역성 등의 기능성이 뛰어난 약용버섯이다[3, 8-10, 14, 17, 37]. 이와 같은 효능을 갖는 AB자실체 생산은 오랜 생육기간을 요하고, 배지조성이나 배양조건 등이 까다롭기 때문에, AB자실체를 생산하는 대신 화학적 성분이나 기능성이 유사한 AB균사체를 액체배양하여 활용하고 있다[5, 7].
	AB균사체 액체배양 추출물이 RWPE-1 세포에 미치는 영향은?	본 연구에서 ABMLCE가 RWPE-1 전립선세포의 BPH 예방 및 치료를 위한 핵심 효소인 5α-R2 효소활성을 감소시킴과 동시에 핵심 물질인 DHT 함량을 감소시킴을 확인하였다. 이와 같은 효과는 ABMLCE의 항염증효과(COX-2 효소활성 감소, TNF-α와 IL-1b 함량 감소)와 항산화효과(SOD 효소 및 CAT 효소활성 증가)에 기인하며, EA가 이들 효과에 관여함을 확인하였다(Fig.
	전립선비대증의 주원인 및 유발 물질은 무엇인가?	전립선비대증(Benign prostatic hyperplasia: BPH)의 주원인은 노화, 산화스트레스 및 염증반응 등이 있으며[4, 6, 23, 33], BPH는 전립선 조직내의 dihydrotestosterone (DHT)에 의해 유발된다[31]. 고환의 Leydig cell에서 합성된 TS가 전립선 조직으로 유입되어 5α-reductase 2 (5α-R2)의 작용에 의해 DHT로 전환된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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