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문제 정의
- . 본 연구에서는 추가적으로 56종의 건강보험급여 기준 처방의 치매 병리기전에서의 주요 효능 평가지표들의 변화를 측정하여 이들의 유효성에 대한 과학적 근거를 구축하고자 하였다. 치매의 생리지표인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase) 활성 및 아밀로이드 베타(amyloid-β, Aβ) 단백질 응집에 대한 효능과 자유 라디칼 소거능 측정을 통한 항산화 효능을 검색하였다.
- 아세틸콜린분해효소의 활성화 및 아밀로이드 베타의 응집은 치매환자에서의 주요 현상으로 알려져 있다17, 22). 따라서 56종 처방들의 아세틸콜린 분해효소 활성 및 아밀로이드 베타 응집 변화에 미치는 영향을 평가하였다. 56종 처방 중 9종이 아세틸콜린 분해효소의 활성을 저해하였다(당귀육황탕, 반하사심탕, 삼황사심탕, 청위산, 황련해독탕, 반하백출천마탕, 자음강화탕, 청서익기탕, 회춘양격산) (Table 1).
- . 따라서 주요 바이오마커들의 활성에 효과를 나타낸 10종 한약처방들의 신경세포 손상에 대한 보호 효능에 대한 평가를 실시하였다. HT22 마우스 유래 신경 해마 세포주를 사용하였으며 각각 처방들의 세포 독성을 측정하여 HT22 세포에 대한 비독성 농도 범위에서 다음의 실험을 수행하였다(Table 2).
- 활성화된 미세아교세포는 NO를 비롯한 염증 매개 물질을 분비를 촉진한다24). 본 연구에서는 항뇌염증 효능을 평가하기 위하여 10종 한약처방의 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다. BV-2 미세아교세포주의 세포독성을 평가한 다음(Table 3), 비독성 범위의 다양한 농도로 한약처방 추출물을 처리하고, LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하였다.
- 본 연구에서는 국민건강보험 급여 한약처방 56종의 치매 관련 평가 지표에 대한 영향을 분석하여 유효처방의 과학적 근거를 확보하고자 하였다. 한약처방 56종 중 당귀육황탕, 반하사심탕, 청위산, 황련해독탕, 반하백출천마탕, 자음강화탕, 청서익기탕, 회춘양격산이 아세틸콜린분해효소 활성 저해 효능을 보였고, 도인승기탕이 아밀로이드 베타 응집 억제 효능을 나타내었다.
제안 방법
- 치매의 생리지표인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase) 활성 및 아밀로이드 베타(amyloid-β, Aβ) 단백질 응집에 대한 효능과 자유 라디칼 소거능 측정을 통한 항산화 효능을 검색하였다.
- 치매의 생리지표인 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase) 활성 및 아밀로이드 베타(amyloid-β, Aβ) 단백질 응집에 대한 효능과 자유 라디칼 소거능 측정을 통한 항산화 효능을 검색하였다. 또한 신경세포보호 및 뇌세포염증 저해 효능을 평가하였다.
- 본 연구에 사용된 한약처방은 보험급여 한약제제 중 혼합엑스산제 56종에 대하여 기준처방별 가격표에 제시된 처방 내용에 따라 단미재를 혼합하여 추출물을 제조하였다9). 한약처방의 구성 한약재는 모두 광명당제약 (Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 사용하였다.
- 한약처방의 구성 한약재는 모두 광명당제약 (Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 사용하였다. 각각의 처방을 구성하는 한약재를 제시된 비율로 배합한 후 70%(v/v) 에탄올을 시료의 6배에 해당하는 양으로 첨가하여 100℃에서 2시간씩 2회 환류추출 장치(MS-E105 Heating mantle, MTOPSⓇ, Korea)로 추출하였다10). 상기 추출액을 여과지 (5 mm)를 이용하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 장착된 농축 장치(EYELA N-1000, Rikakikai Co.
- 각각의 처방을 구성하는 한약재를 제시된 비율로 배합한 후 70%(v/v) 에탄올을 시료의 6배에 해당하는 양으로 첨가하여 100℃에서 2시간씩 2회 환류추출 장치(MS-E105 Heating mantle, MTOPSⓇ, Korea)로 추출하였다10). 상기 추출액을 여과지 (5 mm)를 이용하여 불용성 물질을 제거한 후, 냉각 콘덴서가 장착된 농축 장치(EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 40℃에서 감압 농축하여 분말 형태의 추출물을 얻었다.
- 아세틸콜린 분해효소 저해 활성은 Ellman법11)을 변형하여 분광 광도법으로 측정하였다. 활성 분석을 위한 완충용액은 0.
- 마우스 유래 신경 해마 세포 HT22와 미세아교세포 BV-2는 10% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 DMEM 배지에 penicillin (100 U/mL)과 streptomycin(100 μg/mL)을 첨가하여 37℃ 및 5% CO2조건에서 배양하였다.
- 7mMABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 최종농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+·를 형성 시킨 후 743nm에서 0.7의 흡광도 값을 갖도록 PBS로 희석하였다.
- 3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decol orization assay방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다15).
- Aβ1-42 응집억제정도를 측정하기 위하여 96 well plate (black microplate)에 thioflavin T (ThT) 10 μL와 Aβ1-42 85 μL를 넣은 후 일정 농도로 만든 시료 5 μL와 혼합하여 형광 분광 분석기로 측정하였다.
- 이때 사용한 형광 분광 분석기의 파장값은 440 nm/484 nm(excitation/emission)이며, 37oC에서 20분 간격으로 총 2시간 측정하였다. 활성 비교를 위하여 양성 대조군으로 morin 을 사용하였고14), 결과는 응집 저해능에 대한 %로 표시하였으며, 계산식은 아래와 같다.
- 96 well plate에 ABTS+·용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, Epoch Microplate Spectophotometer를 사용하여 743 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거활성은 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타냈다.
- 신경세포 손상을 유도하기 위하여 HT22 세포에 250 μM hydrogen peroxide (H2O2)를 6시간 처리하였으며, H2O2단독 처리군과 한약처방과 H2O2를 동시 처리군의 세포 생존율 변화를 비교하여 세포 보호 효능을 판단하였다.
- 이어서 Cell Count Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) 용액 10 μL를 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후 microplate reader (BioTek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율 (% of control)을 계산하였다. 세포 활성 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
- 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 상대적인 세포 생존율 (% of control)을 계산하였다. 세포 활성 실험은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도를 기준으로 진행하였다.
- BV-2 세포에 한약처방을 2시간 전처리 한 다음, 염증 반응을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS, 1 μg/mL)을 처리하고 24시간 배양한 다음 상등액을 회수하였다. 상등액과 Griess 시약(sulfanilamide: N -1-napthylethylenediamine dihydrochloride=1:1)를 동량 혼합하여 5-10분 반응 시킨 다음 540nm에서 흡광도를 측정한 다음 표준 곡선에 따라 nitrate 양을 계산하였다.
- 본 연구에서는 건강보험 적용 한약처방 56종의 치매 주요 바이오마커에 대한 효능과 함께 항산화, 신경세포보호 및 뇌염증 저해능을 분석하였다. 아세틸콜린분해효소의 활성화 및 아밀로이드 베타의 응집은 치매환자에서의 주요 현상으로 알려져 있다17, 22).
- . 상기 치매 주요 바이오마커들에 대한 저해 효능이 확인된 10종 처방들의 ABTS 라디컬의 생성에 대한 소거능을 측정하였다. 10종 처방은 모두 농도 의존적으로 강한 ABTS 소거 활성을 나타내었으며, 그 중 도인승기탕(B)과 삼황사심탕(D)이 저농도에서도 활성이 높음이 확인되었다(Fig.
- 따라서 주요 바이오마커들의 활성에 효과를 나타낸 10종 한약처방들의 신경세포 손상에 대한 보호 효능에 대한 평가를 실시하였다. HT22 마우스 유래 신경 해마 세포주를 사용하였으며 각각 처방들의 세포 독성을 측정하여 HT22 세포에 대한 비독성 농도 범위에서 다음의 실험을 수행하였다(Table 2). H2O2를 처리하여 세포 손상을 유도하였다.
- HT22 마우스 유래 신경 해마 세포주를 사용하였으며 각각 처방들의 세포 독성을 측정하여 HT22 세포에 대한 비독성 농도 범위에서 다음의 실험을 수행하였다(Table 2). H2O2를 처리하여 세포 손상을 유도하였다. Fig.
- 본 연구에서는 항뇌염증 효능을 평가하기 위하여 10종 한약처방의 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다. BV-2 미세아교세포주의 세포독성을 평가한 다음(Table 3), 비독성 범위의 다양한 농도로 한약처방 추출물을 처리하고, LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하였다. 그 결과 LPS를 처리한 세포를 약물을 처리하지 않은 정상 세포와 비교하였을 때, NO의 생성량이 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(Fig.
- 본 논문에 포함된 효능 시험은 in vitro 수준에서만 이루어졌다. 이들 처방 효능에 대한 보다 신뢰도 높은 과학적 근거 제시를 위해서는 복수의 동물 모델을 활용한 효력 시험을 통한 비임상 유효성 검증이 반드시 필요할 것이다.
대상 데이터
- . 한약처방의 구성 한약재는 모두 광명당제약 (Ulsan, Korea)에서 규격품을 구입하여 사용하였다. 각각의 처방을 구성하는 한약재를 제시된 비율로 배합한 후 70%(v/v) 에탄올을 시료의 6배에 해당하는 양으로 첨가하여 100℃에서 2시간씩 2회 환류추출 장치(MS-E105 Heating mantle, MTOPSⓇ, Korea)로 추출하였다10).
- , Winooski, VT)를 이용하여 412 nm에서 측정하였다. 대조약물로는 아세틸콜린 분해효소 저해 약물로 잘 알려진 berberine을 사용하였고12), 결과는 control군에 대한 %로 표시하였으며, 계산식은 아래와 같다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한것으로 판정하였다.
이론/모형
- 아밀로이드 베타의 응집 저해 측정은 형광 분석법13)을 이용한 SensoLyteⓇ Thioflavin T β-Amyloid(1-42) Aggregation Kit (AnaSpec, Inc., Fremont, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 따라서 56종 처방들의 아세틸콜린 분해효소 활성 및 아밀로이드 베타 응집 변화에 미치는 영향을 평가하였다. 56종 처방 중 9종이 아세틸콜린 분해효소의 활성을 저해하였다(당귀육황탕, 반하사심탕, 삼황사심탕, 청위산, 황련해독탕, 반하백출천마탕, 자음강화탕, 청서익기탕, 회춘양격산) (Table 1).
- 두 결과를 종합하였을 때, 56종 보험급여 한약처방 중 삼황사심탕만이 치매에 대한 두 종류의 주요 바이오마커 아세틸콜린 분해효소 활성 및 아밀로이드 베타응집을 모두 저해하였으며, 다른 처방들은 아세틸콜린분해효소 활성 또는 아밀로이드 베타 응집 중 한 가지 마커에 대해서만 효능을 나타내었다.
- 상기 치매 주요 바이오마커들에 대한 저해 효능이 확인된 10종 처방들의 ABTS 라디컬의 생성에 대한 소거능을 측정하였다. 10종 처방은 모두 농도 의존적으로 강한 ABTS 소거 활성을 나타내었으며, 그 중 도인승기탕(B)과 삼황사심탕(D)이 저농도에서도 활성이 높음이 확인되었다(Fig. 3).
- 4의 결과는 H2O2의 처리는 HT22 세포 생존율을 유의적으로 감소시켰다. 반면에 치매 주요 마커들에 대한 효능을 나타낸 10종 처방 모두가 H2O2에 의하여 유발된 신경세포 손상에 대한 보호 효과가 있음이 확인되었다. 치매를 포함함 퇴행성 뇌질환에서의 뇌 손상은 염증 반응을 유도하며, 이 과정에서 미세 아교세포의 활성화가 나타난다.
- BV-2 미세아교세포주의 세포독성을 평가한 다음(Table 3), 비독성 범위의 다양한 농도로 한약처방 추출물을 처리하고, LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하였다. 그 결과 LPS를 처리한 세포를 약물을 처리하지 않은 정상 세포와 비교하였을 때, NO의 생성량이 유의적으로 증가되었음을 확인하였다(Fig. 5). 반면에 한약처방을 처리한 경우, 10종 처방 모두 LPS에 의한 NO 생성을 농도 의존적인 감소시켰다(Fig.
- 5). 반면에 한약처방을 처리한 경우, 10종 처방 모두 LPS에 의한 NO 생성을 농도 의존적인 감소시켰다(Fig. 5). 본 연구에서 항치매 활성을 나타낸 10종의 처방들의 치매와 관련한 비임상 및 임상 논문들을 분석한 결과, 황련해독탕에 대한 것이 다수 있었으며 삼황사심탕 효능의 임상논문이 1건 있었다.
- 5). 본 연구에서 항치매 활성을 나타낸 10종의 처방들의 치매와 관련한 비임상 및 임상 논문들을 분석한 결과, 황련해독탕에 대한 것이 다수 있었으며 삼황사심탕 효능의 임상논문이 1건 있었다. 나머지 8종의 처방들의 치매관련 논문들은 확인 되지 않았다.
- 삼황사심탕의 치매 효능 관련 논문으로는 2001년 신 등이 발표한 저산소증으로 유발된 다발성경색치매의증 환자 증례 보고가 있다42). 기억력 저하, 착란, 불면 등을 주소로 하는 저산소성다발성경색의 치매의증환자를 삼황사심탕가미방으로 치료한 결과 지남력과 집중력이 향상되어 MMSE 검사 점수의 상승과 함께 야간 불면증상과 착란증상이 현저히 개선되었다고 하였다.
- 본 연구에서는 국민건강보험 급여 한약처방 56종의 치매 관련 평가 지표에 대한 영향을 분석하여 유효처방의 과학적 근거를 확보하고자 하였다. 한약처방 56종 중 당귀육황탕, 반하사심탕, 청위산, 황련해독탕, 반하백출천마탕, 자음강화탕, 청서익기탕, 회춘양격산이 아세틸콜린분해효소 활성 저해 효능을 보였고, 도인승기탕이 아밀로이드 베타 응집 억제 효능을 나타내었다. 또한 삼황사심탕은 두 가지 지표 모두에 효과를 나타내었다.
- 또한 삼황사심탕은 두 가지 지표 모두에 효과를 나타내었다. 치매 주요지표에 대한 효능이 확인된 총 10종 처방들은 항산화 활성, 신경세포보호, 뇌염증 억제에 대한 효능이 있음이 확인되었다. 향후 이들 처방들에 대하여 치매 동물 모델에서 유효성 검증이 필요할 것이다.
- 양성대조군 berberine이 60.63 ± 0.6%의 아세틸콜린 분해효소 활성에 대한 저해를 나타낸 것과 비교하여, 9종의 처방은 모두 양성대조군 보다 높은 67% 이상의 저해 효과를 나타내었다.
- 양성대조군으로 사용된 morin의 아밀로이드 베타 응집 저해 효능이 68.3 ± 6.2%인 것과 비교하여 도인승기탕과 삼황사심탕은 각각 74.06 ± 3.44%, 76.00 ± 5.57%의 저해 활성을 나타내었다.
- 특히 이들 중 당귀육황탕, 삼황사심탕, 황련해독탕, 회춘양격산은 각각 92.32± 0.39%, 93.30 ± 0.23%, 96.71 ± 0.31%, 91.87 ± 0.20%의 높은 저해 활성을 나타내었다.
- 또한, 9종 처방은 다양한 농도(12.5, 25, 50 or 100 μg/mL)에서 분석하였을 때, 농도 의존적으로 아세틸콜린 분해효소 활성을 저해함을 확인하였다(Fig. 1).
- 아세틸콜린 분해효소 활성에 대한 효능 평가와는 달리 아밀로이드 베타 응집에 대한 저해 효능은 56종 처방 중 2종에서만 관찰되었다(도인승기탕, 삼황사심탕)(Table 1). 양성대조군으로 사용된 morin의 아밀로이드 베타 응집 저해 효능이 68.
- 57%의 저해 활성을 나타내었다. 이들 2종 처방의 활성은 다양한 농도에서 재검증 되었으며 2종 모두 농도 의존적으로 아밀로이트 베타 저해활성을 보였다(Fig. 2).
후속연구
- 과거에는 한약은 보약이라는 인식이 강하여 치료보다는 예방의 역할이 더 강하게 부각 되었었으나, 실제 한약은 전통적으로 치료약으로 사용되어 온 것이 사실이다. 이러한 사실은 한의약을 보다 치료의학으로서 발전시킬 수 있는 기반이 된다고 할 수 있으며, 이를 통하여 보다 적극적인 한방의료보험 활성화에 기여할 수 있을 것이다.
- 치매 발병에 대한 분자기전은 염증, 세포손상, 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능장애, 대뇌 글루코스 대사 등과 관련된 여러 경로들이 관여되어 있다19). 따라서 치매 치료제의 개발 연구는 주요 바이오마커에 대한 효과와 함께 관련된 다양한 기전에 대한 부분이 복합적으로 고려되어야 할 것이다. 이와 같은 측면에서 다수의 한 약재의 배합으로 다양한 약물들 간의 생체 내 상호작용에 의한 시너지 및 조절을 나타내며, 이는 치매와 같은 복합한 병리기전에 의해 조절되는 질환의 치료제 개발에 보다 적합할 것으로 생각된다.
- 따라서 치매 치료제의 개발 연구는 주요 바이오마커에 대한 효과와 함께 관련된 다양한 기전에 대한 부분이 복합적으로 고려되어야 할 것이다. 이와 같은 측면에서 다수의 한 약재의 배합으로 다양한 약물들 간의 생체 내 상호작용에 의한 시너지 및 조절을 나타내며, 이는 치매와 같은 복합한 병리기전에 의해 조절되는 질환의 치료제 개발에 보다 적합할 것으로 생각된다. 현재까지 여러가지 한약처방의 치매에 대한 효능을 제시하는 비임상 또는 임상 연구결과들이 발표되어 왔으며20,21), 본 연구팀에서도 다빈도 한약처방 50종의 항치매 효능 평가비교 결과를 발표한 바 있다8).
- 본 논문에 포함된 효능 시험은 in vitro 수준에서만 이루어졌다. 이들 처방 효능에 대한 보다 신뢰도 높은 과학적 근거 제시를 위해서는 복수의 동물 모델을 활용한 효력 시험을 통한 비임상 유효성 검증이 반드시 필요할 것이다.
- 치매 주요지표에 대한 효능이 확인된 총 10종 처방들은 항산화 활성, 신경세포보호, 뇌염증 억제에 대한 효능이 있음이 확인되었다. 향후 이들 처방들에 대하여 치매 동물 모델에서 유효성 검증이 필요할 것이다.
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