[국내논문]일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물의 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 iNOS 및 염증성 사이토카인 발현 저해를 통한 항염증 효과 비교 Anti-inflammatory effects of seed ethanolic extracts of the common buckwheat and tartary buckwheat are mediated through the suppression of inducible nitric oxide synthase and pro-inflammatory cytokines in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells원문보기
메밀은 전 세계적으로 알곡, 싹, 차 등 다양한 형태로 이용되고 있으며, 주요재배종으로는 일반메밀과 쓴메밀이 있다. 본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다. 플라보노이드 및 폴리페놀 함량도 쓴메밀 추출물이 1.8-2.0배 높았다. 쓴메밀 추출물은 6.25-400 ㎍/mL 범위의 농도로 세포독성을 평가하였을 때 세포독성은 관찰되지 않았다. 또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNF-α와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은 쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
메밀은 전 세계적으로 알곡, 싹, 차 등 다양한 형태로 이용되고 있으며, 주요재배종으로는 일반메밀과 쓴메밀이 있다. 본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다. 플라보노이드 및 폴리페놀 함량도 쓴메밀 추출물이 1.8-2.0배 높았다. 쓴메밀 추출물은 6.25-400 ㎍/mL 범위의 농도로 세포독성을 평가하였을 때 세포독성은 관찰되지 않았다. 또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNF-α와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은 쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
The ethanolic seed extracts of the common buckwheat (CB) and tartary buckwheat (TB) were examined for their anti-oxidant and anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. In this study, it was observed that the rutin content of TB extracts was 65-78 times higher than...
The ethanolic seed extracts of the common buckwheat (CB) and tartary buckwheat (TB) were examined for their anti-oxidant and anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. In this study, it was observed that the rutin content of TB extracts was 65-78 times higher than the CB extracts, while quercetin was only detected in the TB extracts. In addition, TB extracts were observed to have 1.8-2.0 times higher flavonoid and polyphenolic content than the CB extracts. Cytotoxicity was not observed when both the buckwheat extracts were evaluated at concentrations in the range of 6.25-400 ㎍/mL. The treatment with TB extracts significantly suppressed the LPS-induced nitric oxide (NO) production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression at the protein and mRNA levels. The TB extracts more potently inhibited the LPS-induced production of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6 than the CB extracts. The mRNA levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were also significantly inhibited both by the TB and CB extracts in a pattern similar to their production.
The ethanolic seed extracts of the common buckwheat (CB) and tartary buckwheat (TB) were examined for their anti-oxidant and anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. In this study, it was observed that the rutin content of TB extracts was 65-78 times higher than the CB extracts, while quercetin was only detected in the TB extracts. In addition, TB extracts were observed to have 1.8-2.0 times higher flavonoid and polyphenolic content than the CB extracts. Cytotoxicity was not observed when both the buckwheat extracts were evaluated at concentrations in the range of 6.25-400 ㎍/mL. The treatment with TB extracts significantly suppressed the LPS-induced nitric oxide (NO) production and inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression at the protein and mRNA levels. The TB extracts more potently inhibited the LPS-induced production of tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, and IL-6 than the CB extracts. The mRNA levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were also significantly inhibited both by the TB and CB extracts in a pattern similar to their production.
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문제 정의
한국은 경제성장 이후 식생활의 서구화로 인한 만성퇴행성 질환 발병률과 사망률 증가에 따른 건강식에 대한 요구로 메밀에 대한 생산과 소비가 증가되고 있다(Cui 등, 2008). 따라서 본 연구에서는 메밀 추출물을 이용하여 LPS로 염증을 유도하고 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과와 염증 관련 mRNA의 발현에 미치는 영향을 연구하여 일반메밀과 쓴메밀의 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 또한 일반메밀에 비해 쓴메밀에 높은 함량으로 존재하는 루틴의 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 통해 루틴 함량과 일반메밀과 쓴메밀의 항염증 효과 간에 상관성이 있는지를 평가하였다.
메밀은 전 세계적으로 알곡, 싹, 차 등 다양한 형태로 이용되고 있으며, 주요재배종으로는 일반메밀과 쓴메밀이 있다. 본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다.
제안 방법
7 대식세포에서 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과와 염증 관련 mRNA의 발현에 미치는 영향을 연구하여 일반메밀과 쓴메밀의 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 또한 일반메밀에 비해 쓴메밀에 높은 함량으로 존재하는 루틴의 NO 및 염증성 사이토카인 생성 억제 효과를 통해 루틴 함량과 일반메밀과 쓴메밀의 항염증 효과 간에 상관성이 있는지를 평가하였다.
, Tokyo, Japan)로 감압농축 과정을 거친 후에 −70℃ 초저온에서 급속으로 동결 건조하였다. 건조된 추출물 시료의 무게를 평량하는 방법으로 추출 수율을 계산하고 일정 농도로 희석한 후 사용하였다.
관측에 사용된 검출 파장(detection wavelength)은 259 nm이고, 시료주입량은 1 µL로 하였다. 본 분석에 사용된 표준물질 루틴과 퀘세틴의 피크와 추출물 샘플의 각 피크는 표준물질의 머무름 시간(retention time, RT)과 비교하여 크로마토그램으로 나타내었다(Fig. 2). 표준물질의 루틴과 퀘세틴 RT는 각각 9.
51 min이었다. 루틴과 퀘세틴 함량(mg/100 g, 동결건조한 종실 기준)을 표준물질의 UPLC 피크 면적을 이용하여 계산하였다. 루틴과 퀘세틴 검량선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별로 UPLC로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r)를 하였다.
시료의 항산화 활성 측정을 위해 루틴 분석과 동일한 방법으로 추출 및 여과하여 −20℃ 냉동고에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 항산화 분석은 UV/VIS absorbance를 장착한 Multimode microplate reader(Cytation 5 cell imaging multimode reader, Biotek instruments Inc. Winooski, VT, USA) 기기로 측정하였다. Multi-mode microplate reader로 분석한 결과는 각 이미지로 저장하였다(Fig.
총 폴리페놀 함량은 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물 50 μL와 2% Na2CO3 용액 200 μL를 가한 후 실온에서 3분간 반응시킨 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) 20 μL를 가하였다.
RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 후 생성된 염증 관련 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비량을 측정하였다.
NO 및 염증성 사이토카인을 확인하기 위해 LPS 1 μg/mL (Sigma Aldrich Co.)를 처리하여 RAW 264.7 대식세포에서 염증반응을 유도하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu phenol reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과, 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다(Dewanto 등 2002; Folin와 Denis, 1912). 총 폴리페놀 함량은 96 well plate에 표준물질과 샘플 추출물 50 μL와 2% Na2CO3 용액 200 μL를 가한 후 실온에서 3분간 반응시킨 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) 20 μL를 가하였다.
, Madison, WI, USA)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내의 NO의 생성량은 표준물질인 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. NO의 positive control로는 LNIL (40 μM)을 사용하였다.
7 세포를 24 well plate에 2×105 cells/mL로 분주하여 24시간 배양하여 세포를 안정화시킨 뒤에 시료를 농도별로 전처리한 뒤 1시간 후에 LPS를 1 μg/mL이 되도록 처리하였다. 24시간 배양한 후 상층액을 취하여 enzyme immunoassay (EIA) kits (BD Bio-science, Sand Diego, CA, USA)를 이용하여 kit에 제시된 실험방법대로 수행하였다.
상층액을 제거하고, 1 mL DEPC-EtOH을 첨가하여 세척한 뒤 원심분리를 실시하여 상층액을 완전히 제거하였다. DEPC-DW를 첨가하여 RNA를 녹이고 Nanodrop을 이용하여 RNA 농도를 측정하였다. TOPscriptTM cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다.
DEPC-DW를 첨가하여 RNA를 녹이고 Nanodrop을 이용하여 RNA 농도를 측정하였다. TOPscriptTM cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 타깃 mRNA 발현을 평가하기 위해, real-time PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.
TOPscriptTM cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 타깃 mRNA 발현을 평가하기 위해, real-time PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc. Shiga, Japan)을 이용하여 한 후 SYBR Thermal Cycler Dice Real-Time PCR System (Takara Bio Inc.)에서 수행하였다. 실험에 사용한 각 mRNA의 primer는 Table 1에 나타냈다.
일반메밀과 쓴메밀 추출물의 각 시료를 100, 200 및 400 μg/mL 농도로 처리한 뒤, NO 생성 억제 효과를 평가하였다.
일반메밀과 쓴메밀 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 먼저 LPS를 처리하여 RAW 264.7 세포에 염증을 유도하고 NO를 과다 생성하는 조건을 만들었다. 여기에 메밀 추출물을 처리하여 NO 생성 억제 효과를 평가하였다(Fig.
7 세포에 염증을 유도하고 NO를 과다 생성하는 조건을 만들었다. 여기에 메밀 추출물을 처리하여 NO 생성 억제 효과를 평가하였다(Fig. 6). LPS (1 μg/mL) 단독 처리군은 처리하지 않은 군에 비해 생성된 NO의 양에서 약 10배 이상의 증가를 보여 염증반응이 충분히 활성화된 것을 확인하였다.
메밀 추출물에 의한 염증성 사이토카인 즉, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성 억제가 유전자의 발현 단계에서 조절되는지를 확인하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 조사하였다(Fig. 9).
메밀 추출물을 대상으로 매개인자인 iNOS 단백질 발현 정도를 확인하였다. 쓴메밀 추출물에서는 LPS에 의한 iNOS 단백질 발현이 감소하였으나, 일반 메밀 추출물은 LPS 처리군과 비교하여 단백질 발현에서 변화가 없거나 오히려 증가하는 것이 확인되었다(Fig.
8). 또한 쓴메밀 추출물에 의한 iNOS 단백질 감소가 유전자 전사 억제를 통해 나타나는 것인지 확인하기 위해 iNOS mRNA발현에 대한 영향을 측정하였다. 쓴메밀 추출물은 농도가 높아짐에 따라 iNOS mRNA를 유의적으로 감소시켰으나, 일반메밀 추출물은 농도 의존적인 iNOS mRNA 발현 저해를 보이지 않았다.
분말 시료 50g을 측정하여 −70℃의 초저온냉동고에 보관한 후 동결건조기에서 다시 건조하였다. 동결건조한 분말시료에 100배가량의 80% 에탄올을 첨가하고 속슬렛추출기 (Soxhlet heater DH-43, Jisico Sci., Seoul, Korea)를 활용하여 80℃ 항온수조에서 2시간 환류냉각추출(reflux extraction)하여 유용 성분을 추출하였다. 추출물은 여과지(No.
이후 Tween 20/TBS로 10분간 3번씩 세척하고, 2차 항체로는 anti-rabbit 또는 antimouse IgG-horseradish peroxidase (HRP)를 사용하여 반응시켰다. 이어서 단백질은 enhanced chemiluminescence (ECL) solution (American Pharmacia Biotech, NY, USA)을 감광시켜 ChemiDocTM Imaging Systems (Bio-Rad)을 이용하여 발현을 확인하였다.
대상 데이터
1). 건조된 종자를 분쇄기(Grinder SFM-555 SP, Shinil Co., Seoul, Korea)에서 마쇄하고 40 mesh체로 거른 후 분말을 분석에 사용하였다. 분말 시료 50g을 측정하여 −70℃의 초저온냉동고에 보관한 후 동결건조기에서 다시 건조하였다.
본 연구에 사용한 표준물질은 순도 99%의 루틴(Extrasynthese, Genay, France)과 퀘세틴(Extrasynthese, Genay, France) 2종을 사용하였으며, 분석에 사용된 시약으로는 HPLC 순도의 아세토니트릴과 메탄올(Tedia Co. Cincinnati, OH, USA)과 포름산(formic acid, Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 증류수는 초순수 증류수제조기(Milli-Q system, Millipore, Bedford, MO, USA)에서 정제한 초순수 물을 사용하였다.
Louis, MO, USA)을 사용하였다. 증류수는 초순수 증류수제조기(Milli-Q system, Millipore, Bedford, MO, USA)에서 정제한 초순수 물을 사용하였다.
관측에 사용된 검출 파장(detection wavelength)은 259 nm이고, 시료주입량은 1 µL로 하였다.
이때 1 N NaOH 100 μL를 첨가하고, 11분 후 표준물질이 주황색으로 변한 반응액의 흡광도 값을 510 nm에서 측정하였다(Dewanto 등, 2002). 표준물질인 rutin(SigmaAldrich)을 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 100 g당 mg rutin equivalent(RE, dry basis)로 나타내었다. 플라보노이드 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.
마우스의 대식세포인 RAW 264.7는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양을 받아 실험에 이용하였다. RAW 264.
실험에 사용된 재료는 일반메밀(‘양절메밀’)과 쓴메밀(‘대관 3-7호’) 2종으로 강원도 평창군 대관령면(북위 37.40°, 동경 128.45°,800 m)에 위치한 실험포장에서 2018년 7월에 파종하여 10월에 수확하고 20±5℃ 조건에서 한달간 자연건조한 종자를 사용하였다(Fig. 1).
데이터처리
회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y= −13.918x+1.3175)을 계산하였다.
회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y= −15.511x+1.4871)을 계산하였다.
루틴과 퀘세틴 함량(mg/100 g, 동결건조한 종실 기준)을 표준물질의 UPLC 피크 면적을 이용하여 계산하였다. 루틴과 퀘세틴 검량선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별로 UPLC로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값을 계산하였다.
DPPH radical 소거 활성은 시료 100 g 당 mg TE (Trolox equivalent antioxidant capacity)로 표현하였다. DPPH 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.023, 0.034, 0.045, 0.056, 0.083 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9974)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y= −15.
표준물질인 rutin(SigmaAldrich)을 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 100 g당 mg rutin equivalent(RE, dry basis)로 나타내었다. 플라보노이드 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9997)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편 (intercept)으로 하여 y=ax+b값(y=1.
30분 후, 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였고, 표준물질인 gallic acid(Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성하였고, 시료 100 g당 mg gallic acid equivalent(GAE, dry basis)로 나타내었다. 폴리페놀 보정선의 선형성을 검증하기 위하여 표준물질 농도별(0.00, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200, 0.400 mg/mL)로 6반복으로 multi-mode microplate reader로 분석하여 검량곡선을 작성하고, 회귀식과 결정계수(coefficient of determination, r=0.9963)를 하였다. 회귀식의 y를 피크 면적, x를 표준물질 농도로 하고, a를 기울기(slope), b를 절편(intercept)으로 하여 y=ax+b값(y=1.
모든 실험 결과의 측정값은 반복 실시한 결과를 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 Graphpad prism software t-test와 one way ANOVA 분석을 수행하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p-value로 검정하였다.
이론/모형
UPLC분석은 Kim 등(2017b)의 방법으로 플라보노이드 정량 분석을 위해 UV detector를 장착한 UPLC(Acquity UPLC I-Class, Waters Corporation, Milford, MA, USA) 기기와 분석 칼럼(Acquity UPLC CSH C18, 2.1 mm i,d, 100 mm length, 1.7 μm particle size, Waters Corporation, Milford, MA, USA)을 사용하였다.
시료의 세포독성은 MTT assay 방법으로 확인하였다. 세포를 96 well plate에 1×105 cells/mL로 분주하여 24시간 배양하였고 시료를 6.
NO 생성량은 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess reaction assay를 이용하여 측정하였다. RAW 264.
세포 용해액을 4℃에서 30분 반응 후, 15,000 rpm에서 30분 원심 분리하여 세포막 성분을 제거하고, 상등액만 회수하였다. 단백질의 정량은 Bradford protein assays(BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 595 nm의 흡광도로 측정하였고, 이에 대한 standard로는 bovine serum albumin (BSA)를 사용하였다. 단백질 정량 후 sample buffer에 넣고 5분간 끓인 뒤 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)을 이용하여 전개하였다.
쓴메밀 추출물은 일반메밀 추출물에 비해 플라보노이드 및 폴리페놀 함량에서도 각각 최대 2.0배(1,655 mg/100 g)와 1.8배(1,370 mg/100 g) 많은 것으로 나타났다(Fig. 4C-D). 천연물에 존재하는 폴리페놀계 화합물들은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대분자들과 결합하는 성질을 가지고 있어 항산화, 항암, 항당뇨, 심혈관 질환 및 골다공증 예방 등의 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Sakihama 등, 2002; Scalbert 등, 2005).
일반메밀과 쓴메밀 추출물을 대상으로 6.25-400 μg/mL의 다양한 농도범위에서 세포 독성을 평가하였을 때, 세포의 생존율은 모든 처리 농도에서 100% 이상인 것으로 조사되어 세포독성이 없는 것으로 확인되었다(Fig. 5).
LPS (1 μg/mL) 단독 처리군은 처리하지 않은 군에 비해 생성된 NO의 양에서 약 10배 이상의 증가를 보여 염증반응이 충분히 활성화된 것을 확인하였다.
일반메밀과 쓴메밀 추출물의 각 시료를 100, 200 및 400 μg/mL 농도로 처리한 뒤, NO 생성 억제 효과를 평가하였다. 일반메밀 추출물의 경우 모든 농도에서 유의적인 NO 생성 억제 효과가 나타나지 않았으나, 쓴메밀 추출물에서는 NO 생성량이 LPS 처리군와 비교하였을 때 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. 쓴메밀 추출물 100 μg/mL 처리에서는 통계적 유의성이 없었으나, 200 μg/mL과 400 μg/mL 농도에서는 통계적 유의성을 보였으며, 400 μg/mL 농도에서 LPS군 대비 10.
IL-6 생성은 쓴메밀 추출물(IC50: 239.07 μg/mL)처리에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였으나, 일반메밀 추출물에서는 생성 억제 효과가 거의 나타나지 않았다(Fig. 7).
특히, 일반메밀 추출물(TNF-α IC50: >400 μg/mL; IL-1β IC50: 271.24 μg/ mL)에 비해 쓴메밀 추출물(TNF-α IC50: 118.31 μg/mL: IL-1β IC50: <100 μg/mL)의 억제 효과가 현저했다.
염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNFα와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다.
또한 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물에 비해 TNF-α, IL1β 및 IL-6의 mRNA를 현저히 감소시킴으로써 더 우수한 항염증 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
반면, 쓴메밀 추출물에서는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 모두 농도의존적으로 저해되는 것을 확인하였다(Fig. 9).
메밀 추출물을 대상으로 매개인자인 iNOS 단백질 발현 정도를 확인하였다. 쓴메밀 추출물에서는 LPS에 의한 iNOS 단백질 발현이 감소하였으나, 일반 메밀 추출물은 LPS 처리군과 비교하여 단백질 발현에서 변화가 없거나 오히려 증가하는 것이 확인되었다(Fig. 8). 또한 쓴메밀 추출물에 의한 iNOS 단백질 감소가 유전자 전사 억제를 통해 나타나는 것인지 확인하기 위해 iNOS mRNA발현에 대한 영향을 측정하였다.
9). 따라서 일반메밀과 쓴메밀 추출물의 염증성 사이토카인 생성량 억제효과는 관련 유전자의 발현을 저해함으로써 나타나는 것으로 판단된다. 또한 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물에 비해 TNF-α, IL1β 및 IL-6의 mRNA를 현저히 감소시킴으로써 더 우수한 항염증 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
본 연구는 일반메밀과 쓴메밀 종실 추출물을 대상으로 항산화 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 루틴 함량은 쓴메밀 추출물이 일반메밀 추출물보다 65-78배 높았으며, 퀘세틴은 쓴메밀 추출물에서만 검출되었다. 플라보노이드 및 폴리페놀 함량도 쓴메밀 추출물이 1.
25-400 μg/mL 범위의 농도로 세포독성을 평가하였을 때 세포독성은 관찰되지 않았다. 또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다.
또한, 세포 내 NO 생성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNFα와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다.
염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNFα와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성억제 효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성억제 효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은 쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
후속연구
또한, 인체 내에서의 활성 radical 소거작용은 인체의 질병과 노화를 방지한다는데 역할을 한다고 하였다(Kim 등 2001). 이러한 항산화 활성의 중요성을 고려할 때 항산화 활성이 우수한 쓴메밀은 질병예방 및 노화방지를 위한 다양한 식의약 재료로 활용가치가 높을 것으로 기대된다.
쓴메밀의 경우 재배역사가 짧아 일반메밀에 비해 기능성 효과에 대한 활용가능 한 정보는 제한적이다. 따라서 본 연구에서 수행된 일반메밀 추출물과 쓴메밀 추출물의 항염증 비교연구는 기능성 성분의 함량과 생리활성 효과 간의 상관관계를 확인할 수 있는 기회를 제공해 줄 것으로 기대된다.
쓴메밀 추출물은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 억제하는 효과가 있어 초기 염증뿐만 아니라 후천성 면역과 관련된 염증의 억제에도 효과가 있을 것으로 기대된다.
이러한 결과는 루틴이 사이토카인 관련 염증 억제에 직접적인 효과가 있음을 시사한다. 또한, 루틴 함량이 높은 쓴메밀 추출물에서 사이토카인 억제 활성이 강하게 나타난 연구결과를 설명할 수 있는 근거가 될 수 있다.
염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다. 이러한 결과들을 고려하면 루틴 함량과 항염증 효과와는 밀접한 관계가 있으며, 루틴 함량이 높은 쓴메밀이 항염증 식의약 소재 개발에 활용 가능성이 높을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
일반메밀과 쓴메밀에서 염증성 사이토카인 생성 억제 효과의 차이점은?
염증성 NO 생성과 관련된 유전자 iNOS 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과, 쓴메밀 추출물에서만 iNOS 단백질과 mRNA 발현이 감소되었다. 염증성 사이토카인 생성억제 효과에서, TNFα와 IL-1β의 경우 쓴메밀과 일반메밀 추출물 모두에서 생성 억제효과가 확인되었으며, IL-6의 경우 일반메밀 추출물은 생성 억제효과가 없었으나 쓴메밀 추출물에서는 그 효과가 인정되었다. 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 확인한 결과, 일반메밀과 쓴메밀 추출물에 의한 mRNA 발현이 감소되었으며, 쓴메밀 추출물의 억제효과가 더욱 우수하였다.
메밀이란?
메밀은 마디풀과(Poygonaceae)에 속하는 일년생 식물로, 한국, 중국, 캐나다, 이탈리아 등 세계 여러 지역에서 재배되고 있는 식량 또는 경관용 작물이다. 메밀은 생육기간이 60-80일로 짧고 토양과 재배지역에 대한 적응성이 높아 작부체계상 유용한 작물로 활용되고 있다(Campbell, 1997; Kreft 등, 1994).
메밀의 종실에서 나타나는 생리활성 물질에는 무엇이 있는가?
메밀의 종실에는 여러가지 생리활성을 나타내는 루틴(rutin), 퀘세틴(quercetin) 등의 플라보노이드 물질과 카테킨(catechins), 트리터페노이드(triterpenoids)과 같은 페놀화합류들이 존재하고 있다. 이러한 성분은 항산화(Kang, 2014; Kim 등 2007), 항당뇨(Lee 등, 2012), 위 질환 효능(Kim, 2016), 항진균 및 항균활성(Hwang 등, 2006), 고혈압 및 심혈관질환 개선(Park, 2006), 모세혈관 건강 향상(Jeong 등, 2011), 미백개선(Han 등, 2014), 비만 예방(Yoon 등, 2012), 항암 및 항염증(Yoon 등, 2012) 등에 효과가 있는 것으로 보고되었다.
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