[논문]SIP-3 한약 처방 및 도네페질의 병용 치료: 아밀로이드 베타로 유도된 알츠하이머병 생쥐 모델에서의 NGS 연구

오영제; 송수진; 류천봉; 손태권; 김근우; 구병수

doi:10.7231/jon.2019.30.4.327

[국내논문] SIP-3 한약 처방 및 도네페질의 병용 치료: 아밀로이드 베타로 유도된 알츠하이머병 생쥐 모델에서의 NGS 연구
Combination Treatment with SIP-3 Herb Formula and Donepezil: An NGS Study in the Mouse Model of Alzheimer's Disease Induced by Amyloid-β 원문보기

동의신경정신과학회지 = Journal of oriental neuropsychiatry, v.30 no.4, 2019년, pp.327 - 340

오영제 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 송수진 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 류천봉 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 손태권 (서울대학교 약학대학 종합약학연구소) , 김근우 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실) , 구병수 (동국대학교 한의과대학 한방신경정신과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: Alzheimer's disease (AD) is a complex disease accompanied by slow impairment of memory and coordination leading to behavioral changes. To date, the only treatment option is to delay the progress of the disease. The purpose of this study was to investigate the synergistic effects of combination treatment with donepezil and three herbal extracts SIP-3 in the AD mouse model induced by amyloid-β (Aβ). Methods: We tested SIP-3 extracts for the cytotoxicity on Aβ-treated SH-SY5Y cells. Then the synergistic effects of SIP-3 and donepezil were evaluated in the AD mouse model using animal experiments and the next generation sequencing (NGS) study. Results: We found that co-treatment with SIP-3 extracts and donepezil increased the viability in Aβ-treated SH-SY5Y cells. The beneficial effects of the co-treatment were also observed in the Aβ-induced AD mouse model. The NGS study was performed to show that the co-treatment of SIP-3 and donepezil restored the disease phenotype closely to the normal level in the AD mouse model in terms of mRNA expression. However, the phenotypes were only partially restored. Conclusions: This study suggests that the combination treatment has a potential to be used for the treatment of AD. However, longer periods of treatment may be required.

Keyword

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. A schematic drawing of animal experiments.
그림 Fig. 2. Effects of SIP-3 on Aβ_25-35-induced cell viability in SH-SY5Y cells.
그림 Fig. 3. Administration of SIP-3 improved the memory impairment of Aβ-induced mouse model.
그림 Fig. 4. SIP-3 improves cognitive deficits of Aβ-induced mouse model in water maze.
그림 Fig. 5. RNA-Seq analyses of DEGs in the cerebral cortex of Aβ-induced mouse model.
표 Table 1. Top 40 Aberrantly Expressed mRNA in RNA-Seq Analyses of DEGs
그림 Fig. 6. Heatmap of the hierarchical cluster analysis of DEGs between samples.

AI 본문요약
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문제 정의

AChE 억제제로 치료받는 환자에게서 AD와 관련된 증상을 더욱 개선시키기 위해, 본 연구진은 기억력 저하, 불안과 같은 증상에 대해 효과적인 한약을 발굴하고자 하였다. 한약은 AD를 포함하여 다양한 질병을 치료하기 위해 당나라 이전부터 사용되어 왔다^12,13).
본 연구에서는 세 가지 한약재의 추출물을 혼합한 SIP-3 한약 처방과 도네페질 병용 치료의 시너지 효과를 확인하는 것을 목표로 하였다. 이에 앞서 본 연구진은 한약 처방을 선택하기 위하여 문헌 검색을 수행한 후, 세포 실험을 통해²⁷⁾신경보호 효과의 유의성이 가장 높게 나온 세 가지 한약, 즉백단향(白檀香; Santalum album), 대회향(大茴香; Illicium verum), 원지(遠志; Polygala tenuifolia)를 최종적으로 선정하여 이들의 혼합 추출물을 SIP-3로 명명하였다.
대뇌 피질 조직에서의 유전자 발현 평가 후에는 단백질 상호작용 데이터베이스를 활용하여 SIP-3의 표적 단백질을 확인하였다. 본 연구진은 이들 결과를 바탕으로 SIP-3 추출물이 도네페질과의 병용 치료에 유망한 후보가 될 수 있음을 제안하는 바이다.
본 연구를 통하여 우리는 한약 추출물을 여러 가지로 조합하여 신경세포 보호 효과를 새로이 확인하였다. SIP-3 구성 한약재에 대하여 단일 한약 추출물, 두 가지 또는 세 가지 한약 추출물의 조합을 각각 다양한 농도로 투여하여 관찰하였고, 도네페질을 2.
본 연구에서는 유의한 수준으로 차별 발현된(differentially expressed) mRNA 관련 유전자 정보를 활용하여, SIP-3 및 도네페질 병용요법의 분자적 기전을 예측하고자 하였다. 먼저, 차별발현 유전자들의 클러스터링과 집단 분석을 수행하였으며, 특히 도네페질과 한약 병용 투여시 유의성있게 변화하는(q-value＜0.

제안 방법

Aβ 25-35를 처리한 세포에서의 세포생존율을 측정하고, AD 동물 모델을 이용하여 Y-미로 및 수중미로 실험을 하였으며, AD 동물 모델의 대뇌 피질에서 RNA 발현 프로파일을 분석하였다.
Aβ _25-35를 처리한 세포에서의 세포생존율을 측정하고, AD 동물 모델을 이용하여 Y-미로 및 수중미로 실험을 하였으며, AD 동물 모델의 대뇌 피질에서 RNA 발현 프로파일을 분석하였다. 대뇌 피질 조직에서의 유전자 발현 평가 후에는 단백질 상호작용 데이터베이스를 활용하여 SIP-3의 표적 단백질을 확인하였다. 본 연구진은 이들 결과를 바탕으로 SIP-3 추출물이 도네페질과의 병용 치료에 유망한 후보가 될 수 있음을 제안하는 바이다.
먼저 SH-SY5Y 세포를 12-well plate (Corning Incorporated, USA)에 5×103 cells/well 밀도로 분주하여 FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 16시간 동안 배양하였으며, SIP-3 추출물 또는 도네페질, SIP-3 추출물과 도네페질 병용 처리하여 24시간 동안 다시 배양하였다.
백단향(100 g; voucher number: CYWDU-KP0014), 대회향(100 g; voucher number: CYWDU-KP0015), 원지(100 g; voucher number:CYWDU-KP0013)를 4℃ cold chamber에 보관하였다. 세 가지 한약을 1:1:1 비율로 100 g씩 혼합하여 세말한 후 reflux condenser (EYELAN-1200A, EYELA, Tokyo, Japan) 를 이용해 혼합물을 30% 에탄올로 100℃에서 3시간 동안 추출하는 것을 2회 반복하였다. 이를 50 μm 필터(Millipore, MA, USA)로 여과한 다음 -60℃의 동결건조기(일신바이오 베이스, 동두천, 대한민국)에서 농축시켜 최종적으로 약 8.
각각의 생쥐에게 Aβ 뇌실 주입을 위해 정수리(bregma)의 0.3 mm 후방(poste-rior), 1.0 mm 측방(lateral), 2.5 mm 복측(ventral) 위치로 Aβ25-35 4 nM을 주사하였다.
TRIzol® RNA Isolation Reagents (Life technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 RNA 전체를 생쥐의 대뇌 조직으로부터 분리하였다.
이 때, 분당 0.2 μl 속도의 stepper-motorized microsyringe를 사용하였고, 주입 부위는 Indian ink 염색으로써 확인하였다.
(5) 도네페질군(Donepezil group): Aβ25-35 ICV 주입후 28일 동안 0.124 mg/kg 도네페질을 경구 투여(p.o.) 도네페질의 투여량은 인간에게 사용되는 표준 용량에 따라 적용하였다.
공간 작업 기억(spatial working memory)에 대한 조사를 위해 Aβ 주입 24일 차에 Y-미로 실험을 수행하였다.
. 원형의 물탱크(직경 100 cm, 높이 35 cm)에 검은색 잉크를 넣어 물을 까맣게 만들고 물의 온도를 실온으로 유지하였다. 투명한 아크릴 플라스틱 플랫폼은 그 상단이 수면 1 cm 아래에 위치하도록 하였다.
생쥐를 플랫폼에 머무르게 한 후 케이지로 들어가게 하였다. 생쥐의 경로에 대한 추적은 물탱크 위 천정에 설치된 카메라 (Ethovision XT, Noldus, VA, USA)를 이용해 녹화 분석하였다.
RNA Isolation Reagents (Life technologies, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 RNA 전체를 생쥐의 대뇌 조직으로부터 분리하였다. RNA 보존상태(RNA integrity)는 Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 바이오분석으로 확인하였다. 분리된 전체 RNA는 mRNA 시퀀싱 라이브러리(mRNA sequencing library)를 위해 TruSeq stranded mRNA sample preparation kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 처리되었다.
분리된 전체 RNA는 mRNA 시퀀싱 라이브러리(mRNA sequencing library)를 위해 TruSeq stranded mRNA sample preparation kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 처리되었다. 각각의 라이브러리에 대해, Agilent DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA)의 바이오분석 으로 약 220 bp의 삽입 크기(insert size)를 확인하였고, CFX96 real time system (BioRad, Hercules, CA, USA) 을 통해 real-time PCR을 시행하여 라이브러리의 정량을 측정하였다. RNA-seq 분석 샘플은 NextSeq 500/550 High Output Kit version 2 (150 사이클)를 사용하여 Illumina NextSeq 500 플랫폼의 75-bp 페어드 엔드 리드 (paired-end reads)로 시퀀싱하였다.
RNA-seq 분석 샘플은 NextSeq 500/550 High Output Kit version 2 (150 사이클)를 사용하여 Illumina NextSeq 500 플랫폼의 75-bp 페어드 엔드 리드 (paired-end reads)로 시퀀싱하였다. 원본 이미지 데이터는 염기해독(base-calling) 과정을 거쳐 염기서열(sequence) 데이터로 변환 후 FASTQ 형식으로 저장되었다.
정상군, 대조군, SIP-3 저농도군, SIP-3 고농도군, 도네 페질군으로 구성된 5개의 샘플에 대한 페어드 엔드 75-bp 리드의 FASTQ 서열 파일은 Cutadapt³⁴⁾를 사용하여 adaptertrimming을 시행하였다. STAR³⁵⁾를 사용하여, 트리밍 된 서열 조각을 UCSC 데이터베이스(https://genome.
제일 먼저 우리는 백단향, 대회향, 원지 추출물을 다양한 농도로 조합해보았고, 이를 Aβ로 처리한 SH-SY5Y 세포에 실험하여 세포생존율을 확인하였다.
를 사용하여 adaptertrimming을 시행하였다. STAR³⁵⁾를 사용하여, 트리밍 된 서열 조각을 UCSC 데이터베이스(https://genome.ucsc.edu/) 에서 얻은 마우스 참조 게놈(reference genome) 서열 mm10 버전에 맞추어 정렬시켰다. 맵핑된 리드의 발현값 산출은 Cufflinks³⁶⁾를 통해 수행되었다.
맵핑된 리드의 발현값 산출은 Cufflinks³⁶⁾를 통해 수행되었다. 산출된 발현값으로 Cuffdiff³⁷⁾를 사용한 차등 발현 유전자(differentially expressed genes;DEGs) 분석이 이루어졌다.
동물 모델에서 도네페질과 SIP-3의 병용 효과를 검증하기 위해, Aβ로 처리한 생쥐에게 0.124 mg/kg 도네페질과 100 mg/kg 또는 300 mg/kg SIP-3를 28일 동안 연속적으로 경구 투여하였다.
SIP-3 100 mg/kg 및 도네페질을 투여했을때 질병 표현형(disease phenotype)으로서 Aβ 처리와 연관된 상향조절(up-regulated) 또는 하향조절(down-regulated) 유전자는 벤다이어그램으로 나타내었으며 (Fig. 5), 대조군과 SIP-3 저농도군과 사이의 배수변화도(fold change;FC)에 대하여 상향조절 상위 20개의 유전자 및 하향조절 상위 20개의 유전자를 Table 1에 제시하였다.
통계적으로 유의하지 않을지라도, 본 연구진은 SIP-3 추출물과 도네페질이 Aβ 로 처리된 생쥐의 뇌 기능에 효능을 나타내는 몇몇 양성 징후를 관찰하였으며, RNA-seq 분석을 수행하였다.
3A, 3B). 다음으로는 도네페질과 SIP-3 병용 투여가 인지저하를 완화시킬 수 있는 지를 실험하였다. Aβ로 처리한 생쥐에서는 자발적인 Y-미로 교차 행동률이 유의하게 감소되었으며, 도네페질을 투여한 군에서는 SIP-3의 유무와는 상관없이 Aβ에 의해 유발된 교차 행동률 감소 현상이 유의하게 역전되었다(p＜ 0.
수중미로 테스트를 통해서는 공간 학습과 기억을 조사하였다. 실험은 4일 간의 훈련을 거친 이후 수행되었다.
통계적으로 유의하지 않을지라도, 본 연구진은 SIP-3 추출물과 도네페질이 Aβ 로 처리된 생쥐의 뇌 기능에 효능을 나타내는 몇몇 양성 징후를 관찰하였으며, RNA-seq 분석을 수행하였다. AD와 관련될 가능성이 유력한 유전자 마커를 식별하기 위해 도네페질군과 함께 SIP-3 저농도군을 선택하여 RNA-seq 데이터를 결합했다. SIP-3 100 mg/kg 및 도네페질을 투여했을때 질병 표현형(disease phenotype)으로서 Aβ 처리와 연관된 상향조절(up-regulated) 또는 하향조절(down-regulated) 유전자는 벤다이어그램으로 나타내었으며 (Fig.
SIP-3 구성 한약재에 대하여 단일 한약 추출물, 두 가지 또는 세 가지 한약 추출물의 조합을 각각 다양한 농도로 투여하여 관찰하였고, 도네페질을 2.5 μM의 저농도, 5 μM의 고농도로 투여한 결과도 함께 비교하였다.
본 연구진은 선행 연구에서 SH-SY5Y 세포 실험을 통해 도네페질 단독요법에 비해 한약과 도네페질의 병용요법시 더 우수한 세포생존율을 보이는 한약을 탐색하고자, 50여 가지 한약 추출물을 각각 도네페질과 함께 SH-SY5Y 세포에 처리한 다음 Aβ 독성에 대해 스크리닝하였다27).
그 결과를 바탕으로 하여 새로운 조합으로써 SIP-3 처방을 제시하였다. 백단향은 혈관이완 작용을 통해 뇌로 가는 혈류를 증가시키며⁴⁰⁾, 백단향의 주요 생리활성 성분인 산탈롤(santalol)은 신경이완제(neuroleptics)로 작용한다^41-46).
본 연구에서는 유의한 수준으로 차별 발현된(differentially expressed) mRNA 관련 유전자 정보를 활용하여, SIP-3 및 도네페질 병용요법의 분자적 기전을 예측하고자 하였다. 먼저, 차별발현 유전자들의 클러스터링과 집단 분석을 수행하였으며, 특히 도네페질과 한약 병용 투여시 유의성있게 변화하는(q-value＜0.05) 42개 유전자의 문헌 분석을 수행하였다. 유전자 집단 분석과 문헌 조사 결과를 종합하였을 때, 하향 조절된 RNA 중 prkcd 및 kcnb1 유전자가 AD 및 산화적 인산화와 관련되는 생물학적 경로와 연관성이 있었다.
1. 백단향, 대회향, 원지 추출물을 다양한 농도로 조합해 보았고, 이를 Aβ로 처리한 SH-SY5Y 세포에 실험하여 세포생존율을 확인하였다.
2. 동물 모델에서 도네페질과 SIP-3의 병용 효과를 검증하기 위해, Aβ로 처리한 생쥐에게 0.124 mg/kg 도네페질과 100 mg/kg 또는 300 mg/kg SIP-3를 28일 동안 연속적으로 경구 투여하였다.
SIP-3 추출물의 신경보호 특성에 더하여, SIP-3 및 도네 페질 병용 투여에 대한 NGS 결과는 AD의 원인 유전자를 탐색하는 실험적 측면에서 새로운 접근 방법을 제공한다. 그러나 이러한 병용 치료의 효과에 대한 실험은 한 가지 유형의 AD 모델을 통해서만 이루어졌으므로 본 결과는 주의해서 해석해야 한다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 SIP-3 구성 한약재 중에서 백단향은 TFS Corporation Ltd. (Nedlands, Australia) 회사로부터 제공받은 것을 이용하였고, 대회향 및 원지는 태원당약업사 (대구, 대한민국)에서 구입하였다. 백단향(100 g; voucher number: CYWDU-KP0014), 대회향(100 g; voucher number: CYWDU-KP0015), 원지(100 g; voucher number:CYWDU-KP0013)를 4℃ cold chamber에 보관하였다.
실험동물은 11∼12주령, 30∼ 32 g 무게의 ICR 수컷 생쥐를 주식회사 오리엔트바이오(성 남, 대한민국)에서 공급받아 사용하였다.
인간 신경모세포종(neuroblastoma cell line) SH-SY5Y 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포는 37℃, 5% CO 2 인큐베 이터에서 10% Fetal bovine serum (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s minimum essential medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하여 유지하였다.

데이터처리

실험 결과는 평균±표준편차(mean±standard error)로 표현하였고, 실험 결과에 대한 그룹 간의 통계적인 유의성은 Student’s t-test로 검증하였다.
통계는 Prism 5 (GraphPad software, San Diego, CA) 로 수행되었다. 실험 결과는 평균±표준편차(mean±standard error)로 표현하였고, 실험 결과에 대한 그룹 간의 통계적인 유의성은 Student’s t-test로 검증하였다.

이론/모형

세포생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Abcam, Cambridge, MA, USA) assay를 통해 확인하였다. 먼저 SH-SY5Y 세포를 12-well plate (Corning Incorporated, USA)에 5×10³ cells/well 밀도로 분주하여 FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 16시간 동안 배양하였으며, SIP-3 추출물 또는 도네페질, SIP-3 추출물과 도네페질 병용 처리하여 24시간 동안 다시 배양하였다.
AD는 여러 가지 원인에 인해 발생하기 때문에 다중 표적 치료가 대안으로 제시된다. 본 연구는 한약 복합 처방과 도네페질 약물의 병용요법을 통해 수행되었다^38,39). 본 연구진은 선행 연구에서 SH-SY5Y 세포 실험을 통해 도네페질 단독요법에 비해 한약과 도네페질의 병용요법시 더 우수한 세포생존율을 보이는 한약을 탐색하고자, 50여 가지 한약 추출물을 각각 도네페질과 함께 SH-SY5Y 세포에 처리한 다음 Aβ 독성에 대해 스크리닝하였다²⁷⁾.

성능/효과

이외에도 도네페질과 한약을 결합한 연구가 다수 수행되었다. 바코파 몬니에리 (Bacopa monnieri)²⁰⁾, 지황음자(地黃飮子)²¹⁾, 스마트 수프 (Smart soup)²²⁾, 가미온담탕(加味溫膽湯)²³⁾, 은행 추출물(EGb 761)²⁴⁾, 칠복음(七福飮)²⁵⁾ 등과 도네페질을 병용 투여한 결과, 동물 실험, 세포 실험 및 임상 연구에서 유익한 효과가 관찰되었다. 장기 병용요법이 AChE 억제제 단독요법에 비해 AD의 인지기능 장애의 진행을 지연시킨다는 보고도 있다²⁶⁾.
이를 50 μm 필터(Millipore, MA, USA)로 여과한 다음 -60℃의 동결건조기(일신바이오 베이스, 동두천, 대한민국)에서 농축시켜 최종적으로 약 8.7 g 의 추출물(평균 수득률 8.7%)을 얻었다.
결과적으로 도네페질과 SIP-3 추출물의 병용 투여는 Aβ로 처리한 SH-SY5Y 세포의 세포생존율을 증가시켰다.
결과적 으로 도네페질과 SIP-3 추출물의 병용 투여는 Aβ로 처리한 SH-SY5Y 세포의 세포생존율을 증가시켰다.
또한, 도네페질을 2.5 μM 혹은 5 μM 농도와 200 μg/ml SIP-3 추출물과 병용 처리 하였을 때, SIP-3 추출물에 2.5 μM 낮은 농도의 도네페질을 병용하여도 5 μM 도네페질 단독 투여군보다 우수한 효능을 가지는 것을 관찰하였다(p＜0.001, Fig. 2C).
한약재 단독 투여 결과를 비교하면, 각 200 μg/ml 추출물 1:1:1 비율의 SIP-3 처리군은 도네페질 단독 처리군에 비해 세포생존율이 가장 유의하게 증가되었으며(p＜0.01, Fig. 2A), 이는 한약재에 도네페질을 추가로 투여한 결과에서도 가장 높은 세포생존율을 보였다(p＜0.05, Fig. 2B).
Aβ로 처리한 생쥐에서는 자발적인 Y-미로 교차 행동률이 유의하게 감소되었으며, 도네페질을 투여한 군에서는 SIP-3의 유무와는 상관없이 Aβ에 의해 유발된 교차 행동률 감소 현상이 유의하게 역전되었다(p＜ 0.01, Fig. 3C).
실험은 4일 간의 훈련을 거친 이후 수행되었다. 대조군의 잠복기(latency)가 크게 증가한 것에 비해, SIP-3 저농도군과 SIP-3 고농도군 및 도네페질군의 잠복기는 정상군에 가까운 수준으로 유의성 있게 감소한 것이 관찰되었다(p＜0.05, Fig. 4). Y-미로 실험 결과와 마찬가지로 SIP-3 저농도군과 도네페질군, 또는 SIP-3 고농도군과 도네페질군 사이에는 유의한 차이가 없었다.
155개의 유전자 중에서 88개의 유전자는 SIP-3 및 도네페질 병용 투여군, 그리고 도네페질 단독 투여군에서 공통적으로 상향 조절되는 반면, 67개의 유전자는 SIP-3 및 도네페 질의 병용 투여군에서만 상향 조절되었다.
5 μM의 저농도, 5 μM의 고농도로 투여한 결과도 함께 비교하였다. 저농도의 도네페질을 투여하였을 때, 세 가지 한약 추출물인 SIP-3를 병용하는 것이 한 가지나 두 가지의 한약을 병용 투여하는 것보다 효과적임이 관찰되었다.
4주 동안 시행한 동물 실험 결과에서 체중 증가량과 일일 섭취량은 실험군들 간의 변화가 없었다. Y-미로 실험 및 SIP-3 저농도군, SIP-3 고농도군, 도네페질군은 단기 기억및 인지 능력이 대조군보다 현저히 개선되었다.
4주 동안 시행한 동물 실험 결과에서 체중 증가량과 일일 섭취량은 실험군들 간의 변화가 없었다. Y-미로 실험 및 SIP-3 저농도군, SIP-3 고농도군, 도네페질군은 단기 기억및 인지 능력이 대조군보다 현저히 개선되었다. 이는 백단향과 원지에 대해 실험한 연구와 유사한 결과이다^55-57).
이는 백단향과 원지에 대해 실험한 연구와 유사한 결과이다^55-57). 수중 미로 실험에서는 SIP-3 및 도네페질 병용 투여가 도네페질 단독 투여와 비해 유의한 차이를 나타내는 인지 개선 효과를 보이지는 않았으나, 정상군과 소폭 더 근접한 수준으로 회복 되었음을 관찰하였다.
05) 42개 유전자의 문헌 분석을 수행하였다. 유전자 집단 분석과 문헌 조사 결과를 종합하였을 때, 하향 조절된 RNA 중 prkcd 및 kcnb1 유전자가 AD 및 산화적 인산화와 관련되는 생물학적 경로와 연관성이 있었다.
3. SIP-3 추출물과 도네페질이 Aβ로 처리된 생쥐의 뇌기능 효능에 미치는 인자들을 살펴보기 위하여 RNA-seq 분석을 수행한 결과, SIP-3 및 도네페질의 병용 투여로 442 개의 상향조절 유전자 중 155개의 유전자가 질병 표현형에서 상향 조절되었고, 251개의 하향조절 유전자 중에서는 85 개의 유전자가 질병 표현형에서 하향 조절되었으며, 히트맵 분석(heatmap analysis) 및 클러스터링 데이터는 SIP-3 및 도네페질 병용 투여가 도네페질 단독 투여보다 정상 표현형에 더 가깝다는 것을 보여주었다.
한약재 단독 투여 결과를 비교하면, 각 200 μg/ml 추출물 1:1:1 비율의 SIP-3 처리군은 도네 페질 단독 처리군에 비해 세포생존율이 가장 유의하게 증가 되었다.
보고에 따르면, 포타슘 채널의 산화는 AD의 사후 뇌에서 악화되었 으며 채널의 산화에 따른 주요 신호전달 단계 또한 AD 뇌에서 강화되었다. 본 연구의 결과상 kcnb1 발현량은 SIP-3 저농도군이 대조군에 비해 감소하였으므로, 이를 통해 AD 에서 SIP-3 및 도네페질의 병용 효과를 미루어 짐작해볼 수있다.
비록 SIP-3 및 도네페질 병용 투여를 통하여 도네페질 단독 투여보다 유의하게 우월한 효과를 얻지는 못 하였으나, NGS 분석을 통해 SIP-3 및 도네페질 병용 투여시 대뇌 피질 유전자 군집이 도네페질 단독 투여와는 상당히 다른 것을 관찰하였다. 도네페질 단독 투여군에서는 유전자 집단 분석에서 주로 세포 스트레스 관련 유전자 집단 변화가 관찰되었 고, SIP-3 및 도네페질 병용 투여군에서는 이온 수송 조절 관련 유전자들의 변화가 관찰되었다.
124 mg/kg 도네페질과 100 mg/kg 또는 300 mg/kg SIP-3를 28일 동안 연속적으로 경구 투여하였다. 도네페질과 SIP-3 병용 투여가 인지저하를 완화시킬 수 있는지를 실험한 결과, 도네페질 및 SIP-3 병용 투여군을 대조군과 비교하였을 때에는 우수한 효능을 보이지만 도네페질 단독 처리군과 비교하였을 때는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
Nrf2 유전자가 결핍된 쥐의 뇌에서는 bace1 및 bace1-as 발현이 증가해 Aβ의 생성량이 증가하였다⁶¹⁾. 본 연구 결과에서 prkcd 발현량은 SIP-3 저농도군이 대조군에 비해 감소한 것이 관찰되었고, 이는 본 연구 결과와 부합되지 않는다.

후속연구

그러나 이러한 병용 치료의 효과에 대한 실험은 한 가지 유형의 AD 모델을 통해서만 이루어졌으므로 본 결과는 주의해서 해석해야 한다. SIP-3 처방과 도네페질의 병용 효과를 확인하려면 후속적인 연구가 필요할 것이다. 유전자 변형 생쥐 모델 또는 녹아웃(knockout) 생쥐 모델을 이용한 동물 연구에서 더 장기적인 실험을 하게 된다면 더 명확한 결과를 얻을 수 있을 것이라 사료된다.
SIP-3 처방과 도네페질의 병용 효과를 확인하려면 후속적인 연구가 필요할 것이다. 유전자 변형 생쥐 모델 또는 녹아웃(knockout) 생쥐 모델을 이용한 동물 연구에서 더 장기적인 실험을 하게 된다면 더 명확한 결과를 얻을 수 있을 것이라 사료된다.

참고문헌 (62)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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