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문제 정의
- 이에 부작용 문제를 줄이고 해결하고자 한의학적 관절염 치료법으로 약물 치료 외 레이저침과 전침 치료가 주목을 받고 있어 본실험에서는 골관절염에 대한 650 nm 레이저침 및 전침 요법 효과에 대해 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- (1) 전침치료군: 동일한 두께로 자극하기 위해 레이저침봉에 전극을 연결하여 3분 동안 30 mW/3 V전기를 흘려주었으며, 이 때 레이저 조사는 하지 않았다.
- (1) 조직 제작: 좌측 슬관절을 적출하여 Bouin 용액에 24시간 이상 고정하였으며, 2.5% 질산(nitric acid) 용액에서 7일 동안 매일 질산액을 교환하면서 탈회(decalcification)를 실시하였다. 파라핀 블록 제작을 위해 채취한 조직은 조직탈수 과정(Alcohol, Xylene)을 거쳐서 파라핀 블록을 제작하여 Microtome (HM325, Thermoscientific, Germany)을 사용하여 8 um 두께로 잘랐다.
- (2) Hematoxylin & Eosin (H&E) stain: 조직은 deparaffin을 거친 후 Hematoxylin (Muto, Japan)과 Eosin (Muto, Japan)으로 염색한 후 물로 세척하고 dehydration 과정을 거쳐 광학 현미경 (80i, Nikon, Japan)으로 관찰하였으며, Gerwin 등13) 에 고안된 측정방법 중 Osteophyte score를 응용하여 조직학점수를 측정하였다.
- (2) 레이저침치료군: 광섬유가 들어가도록 제작된 침을 사용하여 3분 동안 30 mW/100 Hz로 치료하였다.
- (3) 조합치료군: 레이저침봉에 전극을 연결하여 전침을 1분 30초간 시술을 하고, 레이저를 1분 30초간 교차로 조정하면서 시술하였다.
- 1) 군 분리: 실험군은 아무처치를 하지 않은 정상군(Normal, n=5), 관절염 유발 후 치료를 하지 않은 대조군(Control, n=5), 관절염 유발 후 전침 시술군(EA, n=5), 관절염 유발 후 650 nm Laser 침 시술군(650LA, n=5), 관절염 유발 후 650 nm Laser 침과 전침 교차 시술군(650LA+EA, n=5)으로 분리하였다.
- 100 μl stop solution을 plate에 넣고 반응을 중지시키고 microplate reader (EZ Read 400, Biochrom, UK)를 사용하여 450 nm파장에서 OD (Optical density)를 측정하였으며, sample의 TNF-α 양은 standard curve를 만들어 assay하였다.
- 2) Collagenase 관절염 유발: 관절염 유발은 collagenase (TypeVII : Sigma, USA)로 1.5 KU 양을 0.9% sterile saline 600 μl 에 용해하여 흰쥐의 좌측 슬관절 관절에 마리당 50 μl를 sterile hypodermic syringe (Korea vaccine Co., Korea)로 투여하였으며 실험 내용은 그림과 같다(Fig. 1).
- 3) 침 시술: 본 실험 연구를 위하여 원형으로 제작된 레이저침, 전자기 시술 기기(Wontech Co., Ltd., Korea)를 이용하였으며, 사용한 침은 침습조사가 가능하도록 다중모드 광섬유를 금속침 내부에 삽입하였고, 금속침과 광섬유간 연결보호를 위하여 폴리머 소재 보호튜브를 사용한 광커넥터로 연결하였다. 침 시술은 관절염 유발 후 일주일째부터 시작하였으며, 2회/주 총 6회에 걸쳐 시행되었다.
- 4) Dynamic Plantar Aesthesiometer 측정: Stimulator 자극에 대한 이질통 측정 방법은 유발전, 유발후, 6회 치료후에 5분간 안정시킨 후 Dynamic Plantar Aesthesiometer (UGO BASILE 37450, Italy)를 사용하여 철회반응(withdrawal response)을 관찰하였다.
- 6) TNF-α 측정: TNF-α 측정을 위해 Rat TNF-α (Invitrogen,USA)를 사용하였다.
- 7) Interleukin-6 (IL-6) 측정: IL-6 측정을 위해 Rat IL-6 (BIOMATIK, USA)를 사용하였다. Microplate에 100 μl Rat IL-6 standard, control, serum을 첨가하고 plate cover로 tapping하고 mixing한 후 37℃에 2시간 배양하였다.
- Plate에 stop solution 50 μl를 넣고 반응을 중지시키고 microplate reader (EZ Read 400, Biochrom, UK)를 사용하여 450 nm파장에서 OD (Optical density)를 측정하였다. Sample의 IL-6 양은 standard curve를 만들어 assay하였다.
- Stimulator 자극에 대한 통증 측정 방법은 2차통각과민에 대한 반응으로 0 g에서 50 g까지 좌측 환측 발바닥을 자극하여 철회반응 stimulator probe가 발바닥에 접촉하여 떨어질 때까지 시간(React Time)과, 실험동물이 stimulator probe를 피한 순간의 힘(Force Intensity)을 얻었다.
- 1% Safranin O (Sigma, USA)용액에 5분간 염색하였다. 그 다음 10분간 충분히 세척하여 dehydration 과정을 거쳐 광학 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다.
- 또, 본 실험에서 사용한 통증 지표로는 물리적 자극에 대한 회피 반응을 보았다. 물리적 자극에 대한 회피반응을 측정하는데 사용 하는 von Frey filament를 사용하였으며, 이 방법은 일정한 압력으로 동일한 자극을 가할 때 실험동물이 느끼는 물리적 통증은 회피반응으로 나타나 회피할 때 시간과 압력 값을 정량화하여 객관 적으로 증명이 가능한 방법이고 27) , 염증성 통증이나 신경병성 통증에서 보이는 이차통각과민 측정을 위한 지표로서 적절한 방법이다 28) .
- 레이저침과 전침 조합 치료 효과 관찰을 위하여 collagenase로 유발된 관절염 모델의 환도(GB30), 양릉천(GB34) 혈위에 650 nm 레이저침, 전침을 개별 및 조합 시술한 후, 통증에 대한 회피반응시 간과 자극 강도 변화, pro-inflammatory cytokine 등을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 에 고안된 측정방법 중 Osteophyte score를 응용하여 조직학점수를 측정하였다. 응용 방법으로는 각 조직사진을 3등분하여 femur와 tivia 양쪽의 각 영역 중 가장 큰 ostepphyte를 측정한 후 표에 따라 점수를 부여하였으며, 이 때 길이 측정 기준은 스케일 바를 기준하였다 (Table 1).
- 관절질환에 대한 한의학적 치료법이 다양하게 시도되었으나, 관절염에 대한 레이저침요법과 전침요법을 병행한 조합 치료에 대한 연구 보고는 미비한 상태이다. 이에 본 연구에서는 레이저침과 전침 조합 치료 효과를 관찰하기 위하여 collagenase로 관절염을 유발시킨 후 환도(GB30), 양릉천(GB34) 혈위에 650 nm 레이저침, 전침을 개별 및 조합 시술한 후, 통증에 대한 회피반응시간과 자극 강도 변화, pro-inflammatory cytokines 등을 관찰한 결과 다음과 같은 지견을 얻었다.
- 침 시술은 관절염 유발 후 일주일째부터 시작하였으며, 2회/주 총 6회에 걸쳐 시행되었다. 치료 시간은 3분으로 동일하게 환측 환도ㆍ양릉천 혈위에 시행하였으며 정상군과 대조군을 제외한 각 군을 치료하였다.
- , Korea)를 이용하였으며, 사용한 침은 침습조사가 가능하도록 다중모드 광섬유를 금속침 내부에 삽입하였고, 금속침과 광섬유간 연결보호를 위하여 폴리머 소재 보호튜브를 사용한 광커넥터로 연결하였다. 침 시술은 관절염 유발 후 일주일째부터 시작하였으며, 2회/주 총 6회에 걸쳐 시행되었다. 치료 시간은 3분으로 동일하게 환측 환도ㆍ양릉천 혈위에 시행하였으며 정상군과 대조군을 제외한 각 군을 치료하였다.
- 5% 질산(nitric acid) 용액에서 7일 동안 매일 질산액을 교환하면서 탈회(decalcification)를 실시하였다. 파라핀 블록 제작을 위해 채취한 조직은 조직탈수 과정(Alcohol, Xylene)을 거쳐서 파라핀 블록을 제작하여 Microtome (HM325, Thermoscientific, Germany)을 사용하여 8 um 두께로 잘랐다.
데이터처리
- 01for Window, USA) 통계 프로그램을 사용하였으며, 평균오차와 표준오차는 (mean±standard error)로 표시하였다. 관절염 유발 후각 군간의 통계학적 분석은 One-Way ANOVA test를 시행하였고, 사후검정은 t-test로 그룹간 평균을 비교 분석하였다. 유의수준은 p＜0.
- 본 연구에서 사용한 통계 분석은 Graph Pad Prism (Ver. 6.01for Window, USA) 통계 프로그램을 사용하였으며, 평균오차와 표준오차는 (mean±standard error)로 표시하였다.
이론/모형
- 골관절염 실험연구를 위한 관절염 유발방법으로 관절강내에 collagenase를 투여하는 모델이 제시되었는데 관절강 내에 collagenase를 주입하게 되면 인대, 반월판 등이 손상되고 기계적 스트레스가 활막세포와 연골세포 대사 작용에 영향을 미쳐 실제 골관절염과 비슷한 상태가 유도되는 것으로 보고되어 26) , 본 실험에선 collagenase를 이용한 골관절염 모델을 사용하였다.
성능/효과
- 1) Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색: 환도ㆍ양릉천혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 조직 변화에 미치는 영향을 H&E stain 염색으로 관찰한 바, 대조군(Fig. 4B)에서는 관절연골이 정상군에 비하여 pannus 형성이 관찰되었고, 활막 부분손상, 염증 세포 침윤 등이 관찰되었다.
- 1) Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) 함량: 환도ㆍ양릉천 혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 TNF-α 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 바, 정상군에 비해 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 대조군에 비해 모든 치료군에서 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 3A).
- 1. 통증에 대한 회피반응시간과 자극 강도 변화에 미치는 영향에서 대조군에 비하여 모든 실험군은 유의한 차이를 나타내었다.
- 2) Interleukin-6 (IL-6) 함량: 환도ㆍ양릉천혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 IL-6 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 바, 정상군에 비해 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 대조 군에 비해 모든 실험군에서 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 3B).
- 2) Safranin O-fast 염색: 환도ㆍ양릉천혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 조직 변화에 미치는 영향을 Safranin O-fast stain 염색으로 관찰한 바, 대조군(Fig. 4B)에서는 proteoglycans 양성반응이 낮게 관찰되었으며, EA군(Fig. 6C), 650LA 군(Fig. 6D), 650LA+EA군(Fig. 6E)에서는 대조군에 비하여 골조직과 인접한 연골층에서 proteoglycans 양성반응이 비교적 전체적으로 높게 관찰되었다(Fig. 6).
- 2. TNF-α 변화에 미치는 영향에서 대조군에 비하여 모든 치료 군은 유의한 감소를 나타내었다.
- 3) Interleukin-1β (IL-1β) 함량: 환도ㆍ양릉천혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 IL-1β 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 바, 정상군에 비해 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 대조군에 비해 650LA, 650LA+EA 치료군에서 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 3C).
- 3. IL-6 변화에 미치는 영향에서 대조군에 비하여 모든 치료군은 유의한 감소를 나타내었다.
- 4. IL-1β 변화에 미치는 영향에서 대조군에 비하여 650LA, 650LA+EA군이 유의한 감소를 나타내었다.
- 5. 조직 관찰에서 H&E 염색 결과 650LA, 650LA+EA군에서 균일한 윤활막, 뚜렷한 연골소강, 연골세포와 활액막 손상정도가 적은 정도의 소견을 보여주었으며, Safranin O-fast 염색 결과 EA군, 650LA군, 650LA+EA군에서 높은 proteoglycans 양성반응이 뼈조 직과 인접한 연골층에서 관찰되었다.
- 4). Osteophyte score는 대조군은 정상군에 비해 두꺼운 골증식을 보였으며, 모든 실험군은 대조군에 비해 골증식이 나타나지 않았다(Fig. 5).
- 관절 조직의 조직병리학적 변화를 관찰하기 위하여 H&E stain 염색을 한 결과, 대조군에 비하여 650LA군, 650LA+EA군은 관절 활액막 손상 정도가 비교적 적게 관찰되었으며, 정상군과 같이 윤활막이 균일한 모습을 보여주었고, 연골소강과 연골세포가 대조군에 비하여 뚜렷한 소견을 보였다. Safranin O-fast stain 염색으로 관찰한 바, 대조군에서는 관절연골은 정상군에 비하여 판누스 (pannus) 형성이 관찰되고, proteoglycans 양성반응이 낮게 관찰 되었으며, EA군, 650LA군, 650LA+EA군에서는 대조군에 비하여 골조직과 인접한 연골층에서 proteoglycans 양성반응이 비교적 높게 관찰되었다.
- 관절 조직의 조직병리학적 변화를 관찰하기 위하여 H&E stain 염색을 한 결과, 대조군에 비하여 650LA군, 650LA+EA군은 관절 활액막 손상 정도가 비교적 적게 관찰되었으며, 정상군과 같이 윤활막이 균일한 모습을 보여주었고, 연골소강과 연골세포가 대조군에 비하여 뚜렷한 소견을 보였다.
- 4B)에서는 관절연골이 정상군에 비하여 pannus 형성이 관찰되었고, 활막 부분손상, 염증 세포 침윤 등이 관찰되었다. 대조군에 비하여 650LA군(Fig.4D), 650LA+EA군(Fig. 4E)은 관절 활액막 손상 정도가 비교적 적게 관찰되었으며, 정상군과 같이 윤활막이 균일한 모습을 보여주었고, 연골소강과 연골세포가 대조군에 비하여 뚜렷한 소견을 보였다(Fig. 4). Osteophyte score는 대조군은 정상군에 비해 두꺼운 골증식을 보였으며, 모든 실험군은 대조군에 비해 골증식이 나타나지 않았다(Fig.
- 본 연구에서 650 nm 레이저침 및 전침요법이 TNF-α와 IL-6 및 IL-1β 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, TNF-α와 IL-6 변화는 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 대조군에 비하여 모든 치료군에서 유의한 감소를 나타내었고, IL-1β 변화는 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, 대조군에 비하여 650LA, 650LA+EA 치료군에서 유의한 감소를 나타내었다.
- 본 연구에서 650 nm 레이저침 및 전침요법이 통증에 대한 회피 반응시간과 자극 강도 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, von Frey filament를 이용하여 물리적 이질통을 발생시킨 후 회피반응 reaction time과 force intensity에서 모든 치료군이 대조군에 비 해 유의하게 증가하였고, 이는 650 nm 레이저침 및 전침요법이 기계적 자극에 대한 골관절염 회복에 도움을 주었을 것으로 보인다.
- 실험 결과로 보아 650 nm 레이저침 및 전침 요법은 collagenase로 유발된 골관절염 염증 유발 중간매개체 생성을 억제하여 염증 과정의 억제 및 염증전달물질 생성을 방해하는 작용이 있다. 이는 추후 650 nm 레이저침 및 전침요법이 류마티스 관절염 치료에 활용될 수 있는 가능성을 보여주고 있으나, 조합치료와 전침, 레이저 각 각 치료를 비교하였을 때 차이가 없었던 부분은, 관절염 조합치료시 전기 자극과 레이저 강도가 어느 시점일 때 시너지 효과를 가지는지 전극과 레이저 강도 및 주파수 등에 따른 효과 변화에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보이며, 향후 임상적인 활용을 위해 작용기전 및 안정성에 대한 더욱 상세한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 이러한 결과로 보아, 650 nm 레이저침 및 전침 요법은 collagenase로 유발된 골관절염 염증 유발 중간매개체 생성을 억제하여 염증 과정 억제 및 염증전달물질 생성을 방해하는 작용이 있는 것으로 사료된다.
- 환도ㆍ양릉천혈에 시술된 650 nm 레이저침 및 전침요법이 Reaction Time 변화(Fig. 2A)와 Force Intensity 변화(Fig. 2B)에 미치는 영향을 관찰한 바, 모든 치료가 끝난 후 정상군에 비해 대조 군은 압력에 대한 통증 반응이 유의한 감소를 나타내었고, 대조군에 비해 모든 치료군은 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 2).
후속연구
- 실험 결과로 보아 650 nm 레이저침 및 전침 요법은 collagenase로 유발된 골관절염 염증 유발 중간매개체 생성을 억제하여 염증 과정의 억제 및 염증전달물질 생성을 방해하는 작용이 있다. 이는 추후 650 nm 레이저침 및 전침요법이 류마티스 관절염 치료에 활용될 수 있는 가능성을 보여주고 있으나, 조합치료와 전침, 레이저 각 각 치료를 비교하였을 때 차이가 없었던 부분은, 관절염 조합치료시 전기 자극과 레이저 강도가 어느 시점일 때 시너지 효과를 가지는지 전극과 레이저 강도 및 주파수 등에 따른 효과 변화에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보이며, 향후 임상적인 활용을 위해 작용기전 및 안정성에 대한 더욱 상세한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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