[논문]느타리 버섯균의 정치배양으로부터 생산되는 중요한 망간퍼옥시데이즈(MnP3)의 N-말단 아미노산 배열 분석

하효철

doi:10.14480/jm.2019.17.4.185

느타리 버섯균의 정치배양으로부터 생산되는 중요한 망간퍼옥시데이즈(MnP3)의 N-말단 아미노산 배열 분석
N-terminal amino acid sequence analysis of major manganese peroxidase (MnP3) produced by static culture of Pleurotus ostreatus 원문보기

Journal of mushrooms = 한국버섯학회지, v.17 no.4, 2019년, pp.185 - 190

초록
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리그닌 분해 담자균류로 알려져 있는 느타리버섯균 No.42는 망간퍼옥시데이즈(MnP) 및 락게이즈(Lac)를 생산하였으나 글루코오스-펩톤-이스트-밀기울(GPYW)배지를 이용한 정치배양조건하에서 리그닌퍼옥시데이즈(LiP)활성은 검출되지 않았다. 한편, 동일배지에서 망간퍼옥시데이즈 활성은 11일째 80(3.6) U/flask(ml)의 최대 생산되었다. 망간퍼옥시데이즈 분리정제는 Sepha-ros CL-6B 및 Mono-Q 컬럼순으로 수행하였으며 주요 망간퍼옥시데이즈 isozyme은 단일밴드로 분자량은 36.4KDa이였다. N-말단으로부터 19개의 아미노산 배열은 단백질 자동 분석 장치로 분석한 결과 ATCADGRTTANAACCVLFP를 나타내었다. 느타리버섯균 No.42의 정치배양조건 하에서 세포외로 생산되는 중요한 망간퍼옥시데이즈 isozyme의 N-말단 아미노산 배열은 이전에 보고된 MnP3의 아미노산 배열과 동일하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pleurotus ostreatus No.42, known as the ligninolytic basidiomycetes, showed production of MnP and Lac, but did not show any LiP acitivity in static culture, grown in GPYW liquid medium. Maximum production of MnP (80U/flask) was observed on day 11 of culturing in this medium. Chromatographic purification of MnP included the use of Sepharose CL-6B and Mono-Q. The major MnP isozyme purified by column chromatography was observed to be a 36.4 KDa (single band on SDS PAGE). The 19-amino acid sequence from the N-terminal was determined by protein sequencing to be ATCADGRTTANAACCVLFP. The N-terminal sequence of the major MnP isozyme of P. ostreatus No.42 was found to be the same as a previously reported sequence of an MnP3 isozyme from this fungus.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. ligninolytic enzymes production of P. ostreatus No.42 by static culture with GPYW medium. ○: laccase activity; ●:manganese peroxidase activity.
그림 Fig. 2. Separation of MnP of P. ostreatus No.42 by DEAESepharose CL-6B column chromatography. ○: Absobance at 407 nm ●: : Absobance at 280nm; △: manganese peroxidase activity
그림 Fig. 3. Purification of MnP of P. ostreatus No.42 by Mono Q column chromatography. ―: Absobance at 280nm; …: Absobance at 407nm
그림 Fig. 4. Electrophoresis of purified major MnP from P. ostreatus No.42. Molecular weight(MW) markers is shown on the left of gel.
표 Table 1. Comparison of N-terminal sequences of the MnP isozymes of P. ostreatus and other white-rot fungi

AI 본문요약
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문제 정의

현재 국내에서는 백색부후균이 생산하는 망간퍼옥시데이즈에 대한 연구는 부족한 편이며 이에 대한 연구보고도 제한되어 있다. 따라서 본 연구자는 이전 보고(Ha, 2013)에서 느타리버섯균의 망간퍼옥시데이즈 대량 생산배지로서 글루코오스-펩톤-이스트-밀기울(GPYW;glucose-peptone-yeast-wheat bran)이 가장 적합한 것으로 확인하여 정치배양 조건하에서 실험을 진행하여 생산된 망간퍼옥시데이즈를 분리, 정제하여 N-말단 아미노산 배열 분석을 진행하여 보고하는 바이다.

제안 방법

총 단백질 함량은 Bradford방법(1976)에 따라 다음과 같이 실시하였다. Bradford reagent 1ml를 시료와 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Bovine serum albumin(Sigma Co.)를 표준곡선으로 시료 중 단백질의 함량을 측정하였다.
, UK)으로 실시하였으며 분광광도계를 이용하여 망간퍼옥시데이즈의 활성을 갖는 분획을 모아서 박막여과장치를 이용하여 농축하였다. 농축한 망간퍼옥시데이즈의 활성분획을 최종적으로 Mono-Q anion-exchange column(AmershamPhamacia Biotech., UK)을 이용하여 염농도에 따른 gradient방법에 따라 망간퍼옥시데이즈를 분리 정제하였다.
느타리버섯균 No. 42로부터 리그닌분해효소인 망간퍼 옥시데이즈를 분리 정제하였다. 정치배양을 통해 생산된 망간퍼옥시데이즈 조효소액을 Amicon PM-10 박막여과장 치를 이용하여 셀룰로오스막(molecular cut-off, 10KDa) 을 이용하여 분리하였다.
최종 컬럼을 통해 분리된 MnP를 겔 전기영동 장치를 이용하여 실시하였다. 단백질 전기영동은 Phast System(Amersham Pharmacia Biotech., UK)에 의한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에서 실시하였으며 전기영동이 끝난 후 0.1% Coomassie blue R-250으로 염색하여 단백질 밴드를 염색하였다. 분자량 마커는 standard mark(Daiichi Pure Chemicals, Japan)를 사용하여 실시하였다.
0 M로 단계적으로 증가하면서 분리하였다. 망간퍼옥시데이즈 분리정제는 DEAESepharose CL-6B column(Amersham Phamacia Biotech., UK)으로 실시하였으며 분광광도계를 이용하여 망간퍼옥시데이즈의 활성을 갖는 분획을 모아서 박막여과장치를 이용하여 농축하였다. 농축한 망간퍼옥시데이즈의 활성분획을 최종적으로 Mono-Q anion-exchange column(AmershamPhamacia Biotech.
박막여과장치에 의해 농축시킨 조효소액을 20 mM succinate buffer(pH 4.5)로 평형화 시켜 놓은 이온교환 크로마토그래피 컬럼(Ion-exchange chromatography)에 적용하고 염농도를 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 M로 단계적으로 증가하면서 분리하였다. 망간퍼옥시데이즈 분리정제는 DEAESepharose CL-6B column(Amersham Phamacia Biotech.
조효소액의 준비 및 농축은 다음과 같이 실시하였다. 배양액을 회수하여 박막여과장치(amicon diaflo system)에서 Diaflo PM 10(MW cut-off:10,000)박막을 사용하여 분자량 10 KDa이상의 분획물을 농축한 다음 농축액을 4℃에서 하루 동안 투석시킨 후 사용하였다. 모든 효소의 분리 정제 과정은 4℃에서 실시하였다.
) 20 ml에서 28℃, 7일 동안 정치배양 하면서 균사체를 회수한 뒤에 증류수 20 ml를 넣고 균질화하여 본 배양을 위한 접종원으로 사용하였다. 본 배양은 글루코오스-펩톤-이스트-밀기울 배지(GPYW)를 각각 20 ml씩 준비하여 위에서 언급한 전 배양한 접종원을 1 ml씩 접종하여 28℃에서 정치배양하면서 리그닌분해 효소활성측정을 실시하였다.
)막에 옮긴 후 전이된 단백질 부분을 절단하였다. 절단한 단백질 부분을 단백질 자동서열 분석기를 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다(Model 491A, Applied Biosystems, USA).
42로부터 리그닌분해효소인 망간퍼 옥시데이즈를 분리 정제하였다. 정치배양을 통해 생산된 망간퍼옥시데이즈 조효소액을 Amicon PM-10 박막여과장 치를 이용하여 셀룰로오스막(molecular cut-off, 10KDa) 을 이용하여 분리하였다. 농축한 분획물을 20 mM Nasuccinate buffer(pH 4.
즉, 전기영동 상에서 확인된 단일밴드를 0.05% SDS용액, 25 mM Tris, 20% methanol, 40mM ε-Amino-n-caproic acid를 함유한 전이 용매를 이용하여 1.2 mA/cm2, 120분간 polyvinyldifluoride(PVDF, Bio-red con.)막에 옮긴 후 전이된 단백질 부분을 절단하였다.
최종 컬럼을 통해 분리된 MnP를 겔 전기영동 장치를 이용하여 실시하였다. 단백질 전기영동은 Phast System(Amersham Pharmacia Biotech.

대상 데이터

본 연구자가 이전에 보고(Ha, 2013)한 실험방법에 따라 진행하였다. 느타리 버섯균주 중 리그닌 분해효소 활성이 가장 좋은 No. 42균주를 대구한의대학교 발효공학 실험실에서 보관하며 본 실험에 사용하였다. 느타리버섯 No.

이론/모형

리그닌 분해효소의 효소활성은 이전 보고의 방법(Ha,2013)으로 진행하였다. 각각의 배양액으로부터 1 ml씩 취하여 4℃, 5000 rpm, 5분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 UV-Visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)을 사용하여 아래 리그닌 분해효소 측정법에 의해 측정하였다. 리그닌퍼옥시데이즈의 효소 활성농도는 1분간 1 nmol의 veratryl alcohol이 veratryl aldehyde로 산화하는 정도를 310 nm의 파장에서 흡광도로 나타내었다.
정치배양을 통해 생산된 망간퍼옥시데이즈 조효소액을 Amicon PM-10 박막여과장 치를 이용하여 셀룰로오스막(molecular cut-off, 10KDa) 을 이용하여 분리하였다. 농축한 분획물을 20 mM Nasuccinate buffer(pH 4.5)에서 투석시켜 안정화 한 후 이온 교환 크로마토그래피인 DEAE-Sepharose CL-B 컬럼에서 stepwise 구배방법으로 NaCl용액(0~1.0M)으로 각각 시험 관별 5 ml씩 분획하여 280 nm와 407 nm에서 흡광도를 측정한 결과는 Fig. 2와 같다.
리그닌 분해효소의 효소활성은 이전 보고의 방법(Ha,2013)으로 진행하였다. 각각의 배양액으로부터 1 ml씩 취하여 4℃, 5000 rpm, 5분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 UV-Visible spectrophotometer(Shimadzu UV-1201)을 사용하여 아래 리그닌 분해효소 측정법에 의해 측정하였다.
본 연구자가 이전에 보고(Ha, 2013)한 실험방법에 따라 진행하였다. 느타리 버섯균주 중 리그닌 분해효소 활성이 가장 좋은 No.
총 단백질 함량은 Bradford방법(1976)에 따라 다음과 같이 실시하였다. Bradford reagent 1ml를 시료와 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였으며, Bovine serum albumin(Sigma Co.
최종 분리한 망간퍼옥시데이즈를 SDS-PAGE 상에서 전개하여 단일 밴드를 확인한 후 semi-dry electrophoretic transfer방법에 의해 실시하였다. 즉, 전기영동 상에서 확인된 단일밴드를 0.

성능/효과

DEAE-Sepharose CL-B 컬럼에서 분리 정제한 망간퍼옥시데이즈를 다시 박막여과장치를 통해 농축한 다음 Mono- Q 음이온 크로마토그래피를 이용하여 최종적으로 망간퍼옥시데이즈를 분리 정제한 결과 280nm와 407nm에서 겹치는 활성을 나타내는 가장 큰 피크를 확인 할 수 있었으며 효소활성 측정 결과 망간퍼옥시데이즈인 것으로 판명되었다(Fig. 3).
4KDa이였다. N-말단으로부터 19개의 아미노산 배열은 단백질 자동 분석 장치로 분석한 결과 ATCADGRTTANAACCVLFP를 나타내었다. 느타리버섯균 No.
글루코오스-펩톤-이스트-밀기울 배지(GPYW)배지에서는 15일간 정치 배양한 결과, 락게이즈 활성은 9일째 50(2.4) U /flask(ml)의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며 망간퍼옥시데이즈 활성은 11일째 80(3.6) U/ flask(ml)의 최대 활성을 나타낸 후 감소하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 이러한 결과는 본 연구자의 이전 보고 (Ha et al, 2001)에서 펠렛(pellet)형태로 배양한 결과 최적의 조건에서 락게이즈 효소 활성은 7일째 480 U/flask, 망간퍼옥시데이즈 효소 활성은 9일째 720 U/flask와 비교하여 낮은 효소활성 결과를 나타내었으나 효소생산 패턴은 거의 동일한 형태로 나타났으며 판막버섯에서 리그닌을 분해하는 대표적인 리그닌 분해효소인 리그닌퍼옥시데이즈 는 실험 배지에서 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였다.
한편 Martinez 등(1996)이 느타리속으로 분류되는 새송이균(Pleurotus eryngii)을 이용하여 펩톤과 같은 질소가 충분한 배지에서 정치배양한 결과 2개의 망간퍼옥시데이즈 isozyme을 분리 정제하였으며 아미노산 배열을 밝힌 결과, 2개의 망간퍼옥시데이즈 isozyme 중 하나인 MnP1이 본 연구에서 밝혀진 MnP3와 100% 상동성이 동일한 N 말단 아미노산 배열을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 느타리버섯균은 펩톤과 같은 질소원이 풍부한 배지조건 하에서 세포외로 생산되는 망간퍼옥시데이즈 isozyme은 연구그룹에 따라 MnPisozyme의 명칭은 다르지만 모두 동일한 MnP3 isozyme으로 확인되었으며 산업적으로 활용가치가 높은 중요한 세포외 생산효소인 것으로 판단된다.
이러한 이유로는 백색부후균내에서도 동일한 속(genus)에 포함되는 균류일수록 유전자 수준에서 발현되는 단백질의 상동성이 높기 때문으로 생각되어진다. 또한 판막버섯이 생산하는 망간퍼옥시데이즈의 경우 기질에 대한 산화반응 시 Mn⁺의존성이 거의 절대적인 반면 느타리속이 생산하는 망간퍼옥시데이즈의 경우 기질의 종류에 따라 Mn⁺의존성이 상대적으로 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 이유로는 망간퍼옥시데이즈의 촉매 반응에 관여하는 활성부위의 아미노산의 차이 때문인 것으로 알려져 있으며 이전 연구에서도 느타리버섯균의 MnP3 N- 말단 아미노산 배열 상동성을 기준으로 구성한 분자계통도에서도 판막버섯의 MnP 1(상동성 54.
리그닌 분해 담자균류로 알려져 있는 느타리버섯균 No.42는 망간퍼옥시데이즈(MnP) 및 락게이즈(Lac)를 생산하였으나 글루코오스-펩톤-이스트-밀기울(GPYW)배지를 이용한 정치배양조건하에서 리그닌퍼옥시데이즈(LiP)활성은 검출되지 않았다. 한편, 동일배지에서 망간퍼옥시데이즈 활성은 11일째 80(3.
아미노산 염기서열 자동분석기를 통하여 느타리버섯균 No.42로부터 분리한 망간퍼옥시데이즈의 아미노산을 분석한 결과 N-말단으로부터 ATCADGRTTANAACCVLFP으로 총 19개의 아미노산 배열을 확인할 수 있었다. 분석된 19개의 아미노산 배열을 이전에 보고된 연구들과 비교분석한 결과는 Table 1과 같다.
1). 이러한 결과는 본 연구자의 이전 보고 (Ha et al, 2001)에서 펠렛(pellet)형태로 배양한 결과 최적의 조건에서 락게이즈 효소 활성은 7일째 480 U/flask, 망간퍼옥시데이즈 효소 활성은 9일째 720 U/flask와 비교하여 낮은 효소활성 결과를 나타내었으나 효소생산 패턴은 거의 동일한 형태로 나타났으며 판막버섯에서 리그닌을 분해하는 대표적인 리그닌 분해효소인 리그닌퍼옥시데이즈 는 실험 배지에서 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였다. 한편 다른 연구자의 느타리버섯균의 연구에서, 동일한 정치배양 조건하에서 리그닌 분해효소의 생산 형태는 락게이즈가 먼저 생산된 후에 망간퍼옥시데이즈가 생산되는 것으로 보고하였으며 리그닌퍼옥시데이즈는 전혀 생산되지 않는 것으로 보고하여 본 연구결과와 일치하였다(Giardina et al, 2000; Irie et al, 2001; Cohen et al, 2002; Kamitsuji et al, 2004; Elisashvili et al, 2008)
이러한 결과는 이전에 연구 보고된 동일한 느타리버섯균 No 42(Ha et al, 2001)를 펠렛(pellet)형태로 배양한 결과 최적의 조건에서 수확한 망간퍼옥시데이즈와 동일한 이온교환 크로마토그래피인 DEAE-Sepharose CL-B 컬럼 조건으로 분리한 결과와 마찬가지로 0.1M NaCl농도에서 망간퍼옥시데이즈 피크가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 최종적으로 Mono-Q 음이온 크로마토그래피를 이용한 분리 조건에서도 이전 연구 보고와 마찬가지로 retention time(RT) 100분경에 큰 피크가 나타나는 것을 확인하였으며 이를 농축하여 영하 4℃에서 보관하며 다음 실험에 사용하였다.

후속연구

최근에는 느타리버섯균으로부터 유래되는 MnP3 유전자를 표고버섯 laccase 프로모터에 결합하여 이종 발현시켜 향상된 생산수율을 나타낸 연구결과도 보고한 바 있다(Sato et al, 2017). 따라서 느타리버섯균으로부터 생산되는 중요한 MnP3은 펩톤 혹은 밀기울과 같은 질소가 풍부한 조건에서 가장 많이 세포외로 생산되는 망간퍼옥시데이즈 isozyme이며 향후 국내에서도 MnP3 생산을 통해 염료분해, PAHs등과 같은 독성물질의 무독화, 환경호르몬 분해 등과 같은 환경산업이나 바이오펄핑, 바이오에너지 등 다양한 산업에 적용될 수 있을 것으로 생각한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	느타리 버섯이란 무엇인가?	느타리 버섯(Pleurotus ostreatus)은 인체에 안전하며 세계적으로 양송이버섯 다음으로 많이 생산되는 식용버섯으로 국내에서도 대량으로 재배 생산되고 소비되는 백색부후균이다. 이러한 백색 부후균은 대부분 담자균류에 속하는 것으로 지구상에 가장 많이 생산되는 유기화합물인 목질바이오매스를 분해 할 수 있는 능력을 가지고 있다.
	조효소액의 준비 및 농축은 어떻게 실시하였는가?	조효소액의 준비 및 농축은 다음과 같이 실시하였다. 배양액을 회수하여 박막여과장치(amicon diaflo system)에서 Diaflo PM 10(MW cut-off: 10,000)박막을 사용하여 분자량 10 KDa이상의 분획물을 농축한 다음 농축액을 4°C에서 하루 동안 투석시킨 후 사용하였다. 모든 효소의 분리 정제 과정은 4°C에서 실시하였다.
	백색 부후균은 어떤 능력을 가지고 있는가?	느타리 버섯(Pleurotus ostreatus)은 인체에 안전하며 세계적으로 양송이버섯 다음으로 많이 생산되는 식용버섯으로 국내에서도 대량으로 재배 생산되고 소비되는 백색부후균이다. 이러한 백색 부후균은 대부분 담자균류에 속하는 것으로 지구상에 가장 많이 생산되는 유기화합물인 목질바이오매스를 분해 할 수 있는 능력을 가지고 있다. 특히 목질바이오매스의 주요 구성성분 중 하나인 리그닌은 다방향족 화합물로 구성되어 있는 난분해성 물질로 최근에는 화이트바이오와 같은 바이오 리파이너리(Biorefinery)산업에서 재생 가능한 중요한 물질로 주목받고 있다.

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Watanabe T, Katayama S, Enoki M, Honda Y, Kuwahara M. 2000. Formation of acyl radical in lipid peroxidation of linoleic acid by manganese-dependent peroxidase from Cerioporipsis subvermispora and Bjerkandera adusta. Eur J Biochem 267: 4222-4231.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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