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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 위 조건에 부합하는 reverse transcription nested (RT-nested) PCR 기반의 HuAiV-A1 진단용 PCR 프라이머 조합을 개발하고, 기존에 보고된 C-PCR 방법들과 민감도, 특이성, 현장 활용성 등이 우수한 C-PCR 시스템을 개발하고자 하였다.
- 본 연구에서는 HuAiV-A1의 보다 효과적인 진단용 RTnested PCR 프라이머 조합을 개발하고자 하였으며 현재HuAiV-A1을 비롯한 수인성 바이러스 진단을 위한 기존의 방법으로는 ELISA 등을 이용한 효소면역측정법이 있었으나, PCR 검사법에 비해 약 1,000배 수준의 낮은 검출 민감도, 낮은 특이성, 판독 오류 등이 나타날 수 있으며,특히 환경과 같이 병원체에 대한 오염도 밀도가 상대적으로 낮은 경우 검출 민감도가 진단 기술에 중요한 척도가 됨에 따라 최근에는 특이적 핵산을 증폭하는 분자 진단기술이 많이 활용되고 있다(Cho, 2018). 따라서 환경부 등 국가기관에서는 C-PCR, real-time qPCR, LAMP 등 분자기반의 진단 기술 중에서도 안정성, 활용성 등을 고려하여 타 검사법에 비해 C-PCR을 기반으로 한 표준검사 기술을 주로 활용하고 있다(NIER, 2016).
제안 방법
- RT-PCR 조성은AccuPower®RT/PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea), PCR 프라이머(정방향 및 역방향) 각각 25 pmol 농도로 2 μL,주형 핵산 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 하여 총 20 μL로 반응하였다.
- HuAiV-A1 핵산 1 ng/μL 기준으로 10배 단계 희석하여 10-4 (100 fg/μL) ~10-9 (1 ag/μL)의 농도로 희석된 HuAiV-A1 핵산들을 주형으로 민감도 분석을 시행하였다.
- 특이적 반응은 주형 핵산인 HuAiV-A1 핵산을 100 fg/μL 농도로 사용하여 구성된 PCR 프라이머 조합에 대한 특이적 밴드의 형성 여부를 확인한 후, 반응이 강하고 증폭산물의 크기가 적합한 조합을 선발하였다.
- 0 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 사용하였다. 탐색 조건은 HuAiV-A1 NCBI accession NC_001918 2,740~3,918 (1,179 nt)를 기준으로 하였으며, 검사자의 편의성을 위해 기존 수인성 바이러스의 PCR 조건으로 활용되고 있는 annealing 온도 51~59℃(최적 55℃)로 하였다(NIER, 2016). HuAiV-A1에 특이적 결합을 할 것으로 추정되는 정방향 및 역방향 프라이머들을 대상으로 Oligo Calculator version 3.
- 탐색 조건은 HuAiV-A1 NCBI accession NC_001918 2,740~3,918 (1,179 nt)를 기준으로 하였으며, 검사자의 편의성을 위해 기존 수인성 바이러스의 PCR 조건으로 활용되고 있는 annealing 온도 51~59℃(최적 55℃)로 하였다(NIER, 2016). HuAiV-A1에 특이적 결합을 할 것으로 추정되는 정방향 및 역방향 프라이머들을 대상으로 Oligo Calculator version 3.27를 통해 프라이머의 특이성, 스스로 부착되어 효율이 저하될 수 있는지에 대한 가능성 등을 분석하여 최종 후보 프라이머 조합들을 제작하였다.
- 특이적 반응에 사용할 HuAiV-A1 주형 핵산은 NC_-001918.1 VP3-VP1 [2,740~3,918 (1,179 nt)]을 마크로젠(Seoul,Korea)에 의뢰하여 linear 상태로 gene을 합성하였다. 비 특이적 반응에 활용할 참고 바이러스주 핵산[RNA, DNA orcDNA; (Rotavirus A, Parechovirus A, Norovirus GII, Coronavirus, Enterovirus-68, Enterovirus-71, Coxakievirus-A6, Coxakievirus-B1, Coxakievirus-B5, non-enteric Adenovirus C 및 enteric Adenovirus 41)]와 linear type gene 합성 [Aichivirus-B (NC_-004421; 4,571~5,370), Aichivirus-C (NC_011829; 4,417~5,216),Parvovirus-B19 (NC_000883.
- RNA 형태로 수집된 것은 ReverTraAce-α-® (TOYOBO, Osaka, Japan)으로 cDNA로 합성하여사용하였다. 한편, HuAiV-A1 참고 프라이머의 반응을 위해 3CD [NC_001918.1; 6,038~8,011 (1,974 nt)]를 linear type으로 gene 합성하였다.
- HuAiV-A1에 특이적으로 증폭이 가능할 것으로 추정되는 PCR 프라이머 조합을 이용하여, 특이적, 비 특이적 및 검출 민감도 분석을 수행하였다. 특이적 반응은 주형 핵산인 HuAiV-A1 핵산을 100 fg/μL 농도로 사용하여 구성된 PCR 프라이머 조합에 대한 특이적 밴드의 형성 여부를 확인한 후, 반응이 강하고 증폭산물의 크기가 적합한 조합을 선발하였다.
- 특이적 반응은 주형 핵산인 HuAiV-A1 핵산을 100 fg/μL 농도로 사용하여 구성된 PCR 프라이머 조합에 대한 특이적 밴드의 형성 여부를 확인한 후, 반응이 강하고 증폭산물의 크기가 적합한 조합을 선발하였다. 특이적 반응에서 선발된 PCR 프라이머 조합들을 이용하여 참고 바이러스주 15종에 대한 비특이적 반응을 검정하였다. 이후 참고 바이러스주들에 대하여 핵산에 반응이 나타나지 않은 PCR 프라이머 조합들을 HuAiV-A1 진단에 적합하다고 추정하였다.
- 이후 참고 바이러스주들에 대하여 핵산에 반응이 나타나지 않은 PCR 프라이머 조합들을 HuAiV-A1 진단에 적합하다고 추정하였다. 또한 특이적 및 비 특이적 시험에서 선발된 PCR 프라이머 조합들을 대상으로 검출 민감도를 분석하였다. HuAiV-A1 핵산 1 ng/μL 기준으로 10배 단계 희석하여 10-4 (100 fg/μL) ~10-9 (1 ag/μL)의 농도로 희석된 HuAiV-A1 핵산들을 주형으로 민감도 분석을 시행하였다.
- HuAiV-A1 핵산 1 ng/μL 기준으로 10배 단계 희석하여 10-4 (100 fg/μL) ~10-9 (1 ag/μL)의 농도로 희석된 HuAiV-A1 핵산들을 주형으로 민감도 분석을 시행하였다. 본 연구에서 사용되는 주형은 linear type으로 합성된 DNA였지만, 실제 시료에서는 total RNA 추출 후 RT-PCR로 반응해야 하는 것을 감안하여 one step RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 조성은AccuPower®RT/PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea), PCR 프라이머(정방향 및 역방향) 각각 25 pmol 농도로 2 μL,주형 핵산 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 하여 총 20 μL로 반응하였다.
- Nested PCR의 조성은AccuPower®HotStart PCR PreMix (Bioneer), PCR 프라이머(정방향 및 역방향) 각각 25 pmol 농도로 2 μL, 주형 DNA (RT-PCR 산물) 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 하여 총 20 μL로 하였다.
- 한편, nested PCR 프라이머 조합을 선발하기 위해 최종선발된 RT-PCR 프라이머 조합에서 nested PCR 증폭이 가능한 조합을 설계 및 제작하였다. RT-PCR을 통해 생성된 산물을 주형으로 검출 민감도 시험을 위한 최종 nested PCR 프라이머 조합을 선발하였다.
- 한편, nested PCR 프라이머 조합을 선발하기 위해 최종선발된 RT-PCR 프라이머 조합에서 nested PCR 증폭이 가능한 조합을 설계 및 제작하였다. RT-PCR을 통해 생성된 산물을 주형으로 검출 민감도 시험을 위한 최종 nested PCR 프라이머 조합을 선발하였다. Nested PCR의 조성은AccuPower®HotStart PCR PreMix (Bioneer), PCR 프라이머(정방향 및 역방향) 각각 25 pmol 농도로 2 μL, 주형 DNA (RT-PCR 산물) 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 하여 총 20 μL로 하였다.
- Nested PCR 조건은 RT-PCR 과정 중 역전사 과정을 제외하고 동일하게 하였다. RT-PCR 및 nested PCR 산물들은 1.2% agarose gel을 사용하여 100 V에서 30분 동안 전기영동 후 gel documentation system (Bio Rad,California, USA)에서 확인하였다.
- 기존 시험법과 검출 민감도를 비교하기 위하여 HuAiVA1의 VP3-1 부분을 합성한 1,179 nt와 3CD 부분을 합성한 1,974 nt를 혼합한 칵테일을 제작하였다. Oligo Calculator version 3.
- 기존 시험법과 검출 민감도를 비교하기 위하여 HuAiVA1의 VP3-1 부분을 합성한 1,179 nt와 3CD 부분을 합성한 1,974 nt를 혼합한 칵테일을 제작하였다. Oligo Calculator version 3.27 서버에 각 염기서열을 입력한 후 분자량을 계산한 결과 합성한 3CD 부분이 VP3-1 부분의 약 1.68배인 것을 고려하여 혼합 시 VP3-1과 3CD의 비율을 1.68:1.00으로 조절하여 copy 수를 맞추었다. 혼합한 칵테일을 10배 단계 희석하였으며, 이것들을 주형으로 본 연구에서 선발한 RT-nested PCR 프라이머 조합 및 기존 conventional PCR 프라이머 조합들의 검출 민감도를 분석하였다.
- 00으로 조절하여 copy 수를 맞추었다. 혼합한 칵테일을 10배 단계 희석하였으며, 이것들을 주형으로 본 연구에서 선발한 RT-nested PCR 프라이머 조합 및 기존 conventional PCR 프라이머 조합들의 검출 민감도를 분석하였다. 또한, 조건 별 반응 시간 비교를 위하여 역전사 과정은 KIT의 프로토콜에 따라 30분~1시간 수준으로 상이하지만 모두 60분으로 통합 계산하였으며, PCR이 시작된 후 종료 시점까지의 시간을 비교하였다.
- 혼합한 칵테일을 10배 단계 희석하였으며, 이것들을 주형으로 본 연구에서 선발한 RT-nested PCR 프라이머 조합 및 기존 conventional PCR 프라이머 조합들의 검출 민감도를 분석하였다. 또한, 조건 별 반응 시간 비교를 위하여 역전사 과정은 KIT의 프로토콜에 따라 30분~1시간 수준으로 상이하지만 모두 60분으로 통합 계산하였으며, PCR이 시작된 후 종료 시점까지의 시간을 비교하였다.
- (2014) 및 Pham (2011)이 보고한 방법에서는 약 100 ag (10-7)의 검출 민감도가 나타났으며, 나머지 방법들은 약 100 fg (10-4)부터 1 fg (10-6) 수준으로 나타났다. 그러나 기존 방법은 각각 227분 및 193분의 반응 시간이 소요되었으나, 이번에 개발한 방법은 175분으로 기존 반응 시간을 약 18~52분 단축시켰다. 또한 RT-nested PCR에서 최고의 검출 민감도가 나타난Saikruang et al.
대상 데이터
- RNA 형태로 수집된 것은 ReverTraAce-α-® (TOYOBO, Osaka, Japan)으로 cDNA로 합성하여사용하였다.
- 1 VP3-VP1 [2,740~3,918 (1,179 nt)]을 마크로젠(Seoul,Korea)에 의뢰하여 linear 상태로 gene을 합성하였다. 비 특이적 반응에 활용할 참고 바이러스주 핵산[RNA, DNA orcDNA; (Rotavirus A, Parechovirus A, Norovirus GII, Coronavirus, Enterovirus-68, Enterovirus-71, Coxakievirus-A6, Coxakievirus-B1, Coxakievirus-B5, non-enteric Adenovirus C 및 enteric Adenovirus 41)]와 linear type gene 합성 [Aichivirus-B (NC_-004421; 4,571~5,370), Aichivirus-C (NC_011829; 4,417~5,216),Parvovirus-B19 (NC_000883.2; 3,001~5,000), Hepatitisvirus-A(K02990.1; 2,014~4,013) 및 Sapovirus (KP298674.1; 4,440~6,439)]을 수집하였다. RNA 형태로 수집된 것은 ReverTraAce-α-® (TOYOBO, Osaka, Japan)으로 cDNA로 합성하여사용하였다.
- HuAiV-A1에 특이적이고, 스스로 결합되는(self annealing) 등의 문제가 나타나지 않는 9개의 PCR 프라이머(정방향 5개 및 역방향 4개)가 탐색되었다(Fig. 1, Table 1). PCR 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 20개 조합을 구성하였으며, 약 248~874 base pair (bp)의 길이었다(Data not shown).
- 1, Table 1). PCR 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 20개 조합을 구성하였으며, 약 248~874 base pair (bp)의 길이었다(Data not shown).
- 총 20개 PCR 프라이머 조합을 대상으로 HuAiV-A1에 대한 특이적 반응을 분석한 결과, 20개 중 15개 조합(조합#02, #03, #04, #06, #07, #08, #10, #11, #12, #14, #15, #16, #18,#19 및 #20)에서 특이적 반응이 나타났으며 밴드의 강도, 증폭한 PCR 산물의 길이, 증폭이 된 위치 등을 고려하여 14개 중 5개 조합(#02, #06, #08, #10 및 #18)을 선발하였다(Fig. 2).
이론/모형
- HuAiV-A1 특이적 프라이머 제작을 위하여 DNAMANsoftware package version 6.0 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 사용하였다. 탐색 조건은 HuAiV-A1 NCBI accession NC_001918 2,740~3,918 (1,179 nt)를 기준으로 하였으며, 검사자의 편의성을 위해 기존 수인성 바이러스의 PCR 조건으로 활용되고 있는 annealing 온도 51~59℃(최적 55℃)로 하였다(NIER, 2016).
성능/효과
- 2). 특이적 반응에서 선발된 5개의 PCR 프라이머 조합을 대상으로 15개 참고 바이러스주 핵산에 비 특이적 반응을 분석한 결과, 5개 PCR 프라이머 조합 모두에서 비특이적 반응이 나타나지 않아(Fig. 3), 선발된 5개 PCR 프라이머 조합은 HuAiV-A1를 특이적으로 진단할 수 있을 것으로 추정되었다. 또한, 5개의 PCR 프라이머 조합을 대상으로 검출 민감도를 분석한 결과, 4개 조합(#02, #06, #08 및 #18)에서는 1 fg 수준인 10-6까지 밴드가 형성되었으며, 조합 #10의 경우 100 ag 수준인 10-7까지 검출 민감도가 나타나, HuAiV-A1를 진단하기에 적합한 RT-PCR 프라이머 조합으로 선발되었다.
- 또한, 5개의 PCR 프라이머 조합을 대상으로 검출 민감도를 분석한 결과, 4개 조합(#02, #06, #08 및 #18)에서는 1 fg 수준인 10-6까지 밴드가 형성되었으며, 조합 #10의 경우 100 ag 수준인 10-7까지 검출 민감도가 나타나, HuAiV-A1를 진단하기에 적합한 RT-PCR 프라이머 조합으로 선발되었다. 최종 선발된 HuAiV-A1 진단용 RT-PCR 프라이머 조합은 HuAiV-1의 VP3-1에 대한 프라이머 F30과 R20 조합으로 563 bp의 PCR 산물을 증폭할 수 있었다(Fig. 4).
- 또한 RT-nested PCR에서 최고의 검출 민감도가 나타난Saikruang et al. (2014) 및 Alcalá et al. (2010)가 보고한 기존방법이 각각 254분 및 257분인데 반해, 이번 연구에서 개발한 nested PCR은 RT-PCR을 포함 및 중간 전기영동 반응 시간을 제외하면 총 290분으로 기존 RT-nested PCR 반응 시간에 비해 약 33~36분 정도 반응 시간이 길었다.
- RT-PCR 프라이머 조합 #10 (F30/R20)의 산물을 주형으로 nested PCR 증폭이 가능한 2개 프라이머 조합[#10-1 (F40/R30; 441 bp) 및 #10-2 (F50/R20; 410 bp)]이 설계되었다. 검출 민감도 분석 결과, 모두 10 ag 수준인 10-8까지동일한 검출 민감도가 분석되었으며, 이 중 참고 바이러스에 비 특이적 반응이 검정된 #10-2 (F50/R20; 410 bp)를최종 선발하였다(Fig. 5).
- 기존 보고된 HuAiV-A1 진단을 위한 RT-PCR 또는 RTnested PCR 10개를 대상(Table 2)으로 검출 민감도를 분석한 결과, RT-PCR에서는 Yip et al. (2014) 및 Pham (2011)이 보고한 방법에서는 약 100 ag (10-7)의 검출 민감도가 나타났으며, 나머지 방법들은 약 100 fg (10-4)부터 1 fg (10-6) 수준으로 나타났다. 그러나 기존 방법은 각각 227분 및 193분의 반응 시간이 소요되었으나, 이번에 개발한 방법은 175분으로 기존 반응 시간을 약 18~52분 단축시켰다.
- (2010)가 보고한 기존방법이 각각 254분 및 257분인데 반해, 이번 연구에서 개발한 nested PCR은 RT-PCR을 포함 및 중간 전기영동 반응 시간을 제외하면 총 290분으로 기존 RT-nested PCR 반응 시간에 비해 약 33~36분 정도 반응 시간이 길었다. 그러나 기존의 두 방법은 약 100 ag 수준의 검출 민감도가 나타난 반면, 본 연구에서 개발한 방법은 10 ag의 검출 민감도를 나타내 기존에 비해 약 10배 좋은 민감도가 나타났다. 그러나 반응에 비 특이적 밴드도 일부가 형성되었다.
- 이번 연구에서 개발한 RTPCR 프라이머 조합은 현재까지 보고되고 있는 RT-PCR 방법 중 최고 수준인 100 atogram(최초 합성된 농도를 1 ng/μL으로 한 것을 기준으로10-7) 수준의 검출 민감도가 나타났으며, 동급 수준을 나타낸 검사법에 비해 검사 시간을 평균 약 35분 단축시켰다.
- 이번 연구에서 개발한 RTPCR 프라이머 조합은 현재까지 보고되고 있는 RT-PCR 방법 중 최고 수준인 100 atogram(최초 합성된 농도를 1 ng/μL으로 한 것을 기준으로10-7) 수준의 검출 민감도가 나타났으며, 동급 수준을 나타낸 검사법에 비해 검사 시간을 평균 약 35분 단축시켰다. 따라서 본 검사법은 임상, 식품, 해양수산 등의 시료에서 HuAiV-A1 진단에 적합할 것으로 사료된다. 한편, nested PCR의 경우 기존의 시간(전기영동 제외 약 4시간 15분) 보다 총 검사 시간이 약 35분 길어진 4시간 50분이 소요되었다.
- 그러나 반응에 비 특이적 밴드도 일부가 형성되었다. 한편, 다른 RT-nested PCR 방법들의 검출 민감도는 약 1~10 fg 수준으로 나타나 이번 연구에서 개발한 RT-nested PCR 방법에 비해 약 10~1,000배 낮은 민감도를 나타냈다(Fig. 5).
후속연구
- 그러나 음용 및 비음용 지하수와 농업용수 등의 시료에서는 검출 민감도가 중요하다. 이번 연구에서 개발한 nested PCR은 기존방법 중 우수한 검출 민감도를 보였으므로 환경 시료 등에서의 활용이 적합할 것으로 보인다. 그러나 향후 실질적 시료에서의 활용성 등 많은 사례가 검증되어야 할 것으로 생각된다.
- 이번 연구에서 개발한 nested PCR은 기존방법 중 우수한 검출 민감도를 보였으므로 환경 시료 등에서의 활용이 적합할 것으로 보인다. 그러나 향후 실질적 시료에서의 활용성 등 많은 사례가 검증되어야 할 것으로 생각된다. 본 연구에서 개발된 RT-nested PCR 프라이머 조합은 임상과 비 임상에서 HuAiV-A1 진단에 효율적인 기술로 활용될 것으로 기대된다.
- 그러나 향후 실질적 시료에서의 활용성 등 많은 사례가 검증되어야 할 것으로 생각된다. 본 연구에서 개발된 RT-nested PCR 프라이머 조합은 임상과 비 임상에서 HuAiV-A1 진단에 효율적인 기술로 활용될 것으로 기대된다.
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