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문제 정의
- 따라서 본 연구는 세포에서 프로모터의 길이와 ERE 영역의 존재 유무에 따라 오브알부민 프로모터의 활성을 비교하고 에스트로겐 호르몬 처리에 의한 효과를 분석하여 궁극적으로 형질전환 닭 생산을 위한 최적 크기의 오브알부민 프로모터 영역을 결정하고자 수행하였다.
- 본 연구는 일차적으로 재조합바이러스 벡터 구축을 위한 오브알부민 유전자 프로모터의 크기에 따른 프로모터 활성을 평가하고자 하였다. 이를 위해 2.
제안 방법
- 3000(Invitrogen)을 사용하였다. 12-well 배양접시(Thermo Scientific)에 세포를 동일한 숫자로 분주한 후, 각 well의 세포 밀도가 70% 이상에서 유전자를 도입하였으며, 유전자 도입 직전에 항생제를 제거한 배양액으로 교체하였다. 벡터 사이즈에 따른 몰비(molar ratio)를 고려하여 각 well당 firefly DNA(pGL4.
- HS DNA poly- merase(Takara, Shiga)를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 증폭하였다. 2.8 kb 프로모터 영역 증폭용(Forward: 5-GGTACCTTAAGTCCTCAGACTTGG-3, Backward:5-CTCGAGGGTGAACTCTGAGTTGTC-3)과 5.5 kb 프로모터 영역 증폭용 프라이머(Forward: 5-GGTACCTCTCTTCAGAATGGCACA-3, Backward: 5-CTCGAGGGTGAACTCTGAGTTGTC-3)들은 번역 개시 위치(ATG) 기준으로 프로모터 영역을 증폭하도록 디자인하였고, 유전자 클로닝을 용이하게 위해 프라이머 양쪽 말단에 제한효소 KpnI과 XhoI 인식 염기서열을 각각 삽입하였다. 증폭된 두 가지 크기의 프로모터 영역은 pGL4.
- 24시간 동안 호르몬 처리한 세포는 Dual luciferase® reporter assay system (Promega)을 이용하여 리포터 분석을 실시하였다.
- 각 well에서 용해된 샘플들은 1.5 mL Eppendorf tube로 옮겨 12,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층의 20 μL를 96-well 배양접시(Nunc)에 각각 분주하였고, Centro LB 960 Luminometer(Berthold, TN) 장비를 사용하여 각 샘플에서 리포터 유전자의 발현량을 측정하였다.
- 5kb-pOV에 비해서 활성이 높은 것을 알 수 있었고, cEF 세포에서 모든 프로모터의 활성에 차이가 없는 결과를 통해서 오브알부민 프로모터가 세포 특이적으로 유전자 발현을 조절함을 확인하였다. 다음으로 오브알부민 프로모터가 클로닝된 벡터가 도입된 HeLa, MES-SA, LMH/2A, 그리고 cEF 세포에서 에스트로겐 처리에 따른 호르몬 반응성을 확인하고자, Mut-4.4kbpOV/pGL4.11 벡터를 HeLa, MES-SA, LMH/2A, 그리고 cEF 세포에 유전자 도입하여 24시간 후, 0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1,000 nM, 그리고 3,000 nM까지 에스트로겐을 처리하고, 호르몬 농도에 따른 리포터 유전자의 발현량을 분석하였다(Fig.3). HeLa 세포에서 1,000 nM과 3,000 nM의 에스트로겐 처리 시 무처리 그룹(0 nM)에 비해 프로모터 활성이 각각 1.
- 벡터 사이즈에 따른 몰비(molar ratio)를 고려하여 각 well당 firefly DNA(pGL4.11/luc2p) 1 μg과 renilla DNA(pGL4.74/hRluc) 0.01 μg을 2 μL의 p3000과 함께 50 μL의 Opti-MEM(Thermo Scientific)에 희석하고, 1.5 μL의 Lipofectamine reagent가 희석된 50 μL의 Opti-MEM과 섞어 약 20분간 실온에서 정치 후, 각 well에 분주하였다.
- 1). 상기의 벡터들은 HeLa, MES-SA, LMH/2A, 그리고 cEF 세포에 각각 도입하고, 프로모터의 활성을 분석하였다(Fig. 2). Mut-4.
- 세포 배지는 DMEM + Glutamax–I(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium + Glutamax–I; Invitrogen, CA) 배양액에 1% anti- biotic/antimycotic(Invitrogen)과 10% Fetal bovine serum(FBS; Invitrogen)을 첨가하여 사용하였고, cEF 세포 배양을 위해서 배양액에 추가적으로 2% chicken serum(Sigma-Aldrich, MO)을 첨가 후 사용하였다.
- 본 연구는 일차적으로 재조합바이러스 벡터 구축을 위한 오브알부민 유전자 프로모터의 크기에 따른 프로모터 활성을 평가하고자 하였다. 이를 위해 2.8kb-pOV/pGL4.11, 5.5kb- pOV/pGL4.11, 그리고 Mut-4.4kb-pOV/pGL4.11 벡터를 구축하였고, 각 벡터의 크기는 7,141 bp, 9,822 bp, 그리고 8,806bp이었다. 구축한 벡터들의 크기는 XhoI 제한효소 처리 결과, 예상했던 크기의 DNA 밴드들을 확인할 수 있었다(Fig.
- 5 kb 프로모터 영역 증폭용 프라이머(Forward: 5-GGTACCTCTCTTCAGAATGGCACA-3, Backward: 5-CTCGAGGGTGAACTCTGAGTTGTC-3)들은 번역 개시 위치(ATG) 기준으로 프로모터 영역을 증폭하도록 디자인하였고, 유전자 클로닝을 용이하게 위해 프라이머 양쪽 말단에 제한효소 KpnI과 XhoI 인식 염기서열을 각각 삽입하였다. 증폭된 두 가지 크기의 프로모터 영역은 pGL4.11(luc2p) 리포터 벡터의 KpnI과 XhoI 인식 염기서열에 연결하여 2.8 kb 오브알부민 프로모터(2.8kb-pOV)가 포함된 pGL4.11 리포터 벡터(2.8kb-pOV/pGL4.11) 그리고 5.5 kb 오브알부민 프로모터(5.5kb-pOV)가 포함된 pGL4.11 리포터 벡터(5.5kb-pOV/pGL4.11)를 구축하였다. 한편, 2.
- 11)를 구축하였다. 한편, 2.8 kb 오브알부민 상류지역과 ERE 영역 사이의 대략 1 kb를 결실시킨 4.4 kb 오브알부민 프로모터(Mut- 4.4kb-pOV)의 염기서열을 유전자 합성한 다음 pGL4.11 리포터 벡터에 연결시켜 변형된 4.4 kb 오브알부민 프로모터를 포함하는 pGL4.11 리포터 벡터(Mut-4.4kb-pOV/pGL4.11)를 구축하였다.
대상 데이터
- The reporter vectors were transiently transfected into HeLa (A), MES-SA (B), LMH/2A (C), and cEFs (D). Data are represented relative to the values obtained with the Mut-4.
- 본 실험에서 사용된 사람 자궁경관 상피세포주(Human cervix epithelial cells, HeLa, ATCC® CRL-2TM), 사람 자궁 상피세포주(Human uterus epithelial cells, MES-SA, ATCC® CRL-1976TM), 에스트로겐 수용체 알파 발현벡터가 도입된 닭 간세포주(Chicken hepatocyte, LMH/2A, ATCC® CRL-2118TM)는 American Type Culture Collection(ATCC, VA)에서 구매하였고, 닭의 배아 섬유아세포(Chicken embry- onic fibroblast cells; cEFs)는 10일차 수정란에서 트립신 처리 및 원심분리를 통해 확보하였다(Schmid et al., 1983).
- 본 연구의 프로모터 활성 검증을 위한 세포내 유전자 도입은 Lipofectamine® 3000(Invitrogen)을 사용하였다.
데이터처리
- 통계 분석은 Graphpad Prism 5.03. software를 사용하여 수행하였다.
- 프로모터 간의 상대적인 활성 비교는 one-way ANOVA를 통해 수행하였으며, P<0.05에서 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 우선적으로 닭 오브알부민 프로모터(ovalbumin promoter, pOV) 영역은 Maxwell® 16 blood DNA purification kit (Pro- mega, WA)를 사용하여 화이트 레그혼 닭의 혈액으로부터 genomic DNA를 추출한 후, PrimeSTARTM HS DNA poly- merase(Takara, Shiga)를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR) 방법으로 증폭하였다.
성능/효과
- Mut-4.4kb-pOV는 HeLa 세포에서 2.8kb-pOV에 비해 1.7배(P<0.001) 발현량이 높았고(Fig. 2A), MES-SA 세포에서는 2.8 그리고 5.5kb-pOV에 대하여 각각 2.7(P<0.01)와 2.2배(P<0.05) 높았으며(Fig. 2B), LMH/2A 세포에서는 각각 3.1(P<0.001)와 2.1배(P<0.001) 높게 발현하는 것을 확인하였다(Fig. 2C).
- 5kb-pOV에 비해 활성이 높은 결과를 확인할 수 있었다. 게다가, ERE 영역이 없는 2.8kbpOV는 에스트로겐 처리에 의한 효과가 거의 없었으나, ERE 영역이 존재하는 5.5 그리고 Mut-4.4kb-pOV는 에스트로겐 처리시 리포터 유전자의 발현이 증가하는 효과를 나타내었다.
- 11 벡터를 구축하였고, 각 벡터의 크기는 7,141 bp, 9,822 bp, 그리고 8,806bp이었다. 구축한 벡터들의 크기는 XhoI 제한효소 처리 결과, 예상했던 크기의 DNA 밴드들을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 상기의 벡터들은 HeLa, MES-SA, LMH/2A, 그리고 cEF 세포에 각각 도입하고, 프로모터의 활성을 분석하였다(Fig.
- 4A). 또한, LMH/2A 세포에서 에스트로겐 처리 전과 비교하여 500 nM 에스트로겐 처리 후의 효과를 분석한 결과, ERE 영역을 포함하는 Mut-4.4 그리고 5.5kb-pOV는 에스트로겐 처리에 의한 프로모터의 활성이 증가하는 반면, ERE 영역이 존재하지 않는 2.8kb-pOV는 그러한 효과가 없었다(Fig. 4B). 이상의 결과들은 에스트로겐에 반응성이 있는 세포에서 ERE 영역을 포함하는 Mut-4.
- 재조합단백질 생산용 형질전환 닭을 생산하기 위하여 다양한 크기의 오브알부민 유전자 프로모터가 재조합바이러스 벡터의 프로모터 영역으로서 이용되고 있다. 본 연구에서는 HeLa, MES-SA, LMH/2A 그리고 cEF 세포에서 2.8, 5.5, 그리고 Mut-4.4 kb의 오브알부민 프로모터를 검증하여 Mut-4.4 kb의 오브알부민 프로모터가 2.8 kb와 5.5 kb의 오브알부민 프로모터에 비해 효율적으로 유전자 발현을 조절 할 수 있음을 나타내었다. Byun et al.
- 종합적으로, 재조합바이러스 벡터에 사용될 오브알부민 프로모터는 그 크기와 ERE 영역의 존재 유무에 따라 프로모터의 활성 및 에스트로겐 반응성에 차이를 보였다. 본 연구에서는 Mut-4.4kb-pOV가 2.8와 5.5kb-pOV에 비해 더욱 효율적으로 형질전환 유전자의 발현을 조절할 수 있을 것으로 예측되었다. 이상의 연구결과는 실제 형질전환 닭 생산을 통해 in vivo에서 검증 될 필요가 있으나, Mut-4.
- 2D). 이러한 결과를 바탕으로 Mut-4.4kb-pOV는 HeLa, MES-SA, 그리고 LMH/2A 세포에서 2.8 그리고 5.5kb-pOV에 비해서 활성이 높은 것을 알 수 있었고, cEF 세포에서 모든 프로모터의 활성에 차이가 없는 결과를 통해서 오브알부민 프로모터가 세포 특이적으로 유전자 발현을 조절함을 확인하였다. 다음으로 오브알부민 프로모터가 클로닝된 벡터가 도입된 HeLa, MES-SA, LMH/2A, 그리고 cEF 세포에서 에스트로겐 처리에 따른 호르몬 반응성을 확인하고자, Mut-4.
- 3D).이러한 결과를 통해, Mut-4.4kb-pOV/pGL4.11 벡터가 도입된 HeLa, MES-SA, 그리고 LMH/2A 세포에서 에스트로겐 처리 후 호르몬에 반응성이 있는 결과를 확인하였다. 추가적으로, 에스트로겐에 반응성이 높은 LMH/2A 세포에서 Mock, 2.
- 4B). 이상의 결과들은 에스트로겐에 반응성이 있는 세포에서 ERE 영역을 포함하는 Mut-4.4와 5.5kb-pOV가 ERE 영역을 포함하지 않는 2.8kb-pOV와 비교하여 에스트로겐 처리시 유전자 발현을 상향 조절할 수 있을 것으로 기대되는 결과이며, 궁극적으로는 실험에 사용된 상피세포주들에서 Mut-4.4kb-pOV가 2.8 그리고 5.5kb-pOV에 비해 프로모터의 활성이 높아 보다 더 효율적으로 유전자 발현을 조절할 수 있는 오브알부민 프로모터의 크기인 것으로 생각되는 결과이다.
- 5kb-pOV에 비해 더욱 효율적으로 형질전환 유전자의 발현을 조절할 수 있을 것으로 예측되었다. 이상의 연구결과는 실제 형질전환 닭 생산을 통해 in vivo에서 검증 될 필요가 있으나, Mut-4.4kb-pOV가 2.8와 5.5kb-pOV에 비해 보다 더 효율적임을 in vitro에서검증하였다는 것에 의의가 있다.
- (1981)은 40주령 암탉에서 배란 24시간 전부터 배란 후 3시간까지의 혈중 에스트로겐 농도가 대략 350∼500 nM 수준인 것으로 보고한바 있다. 이에, 2.8, 5.5, 그리고 Mut-4.4kb-pOV/pGL4.11 벡터가 도입된 LMH/2A 세포에 500 nM의 에스트로겐을 24시간 처리 후 리포터 분석을 실시한 결과, Mut-4.4kb-pOV는 500nM의 에스트로겐 처리시에도 2.8와 5.5kb-pOV에 비해 활성이 높은 결과를 확인할 수 있었다. 게다가, ERE 영역이 없는 2.
- 종합적으로, 재조합바이러스 벡터에 사용될 오브알부민 프로모터는 그 크기와 ERE 영역의 존재 유무에 따라 프로모터의 활성 및 에스트로겐 반응성에 차이를 보였다. 본 연구에서는 Mut-4.
- (1987)이 보고한 오브알부민 프로모터가 닭의 배아 섬유아세포에서는 기능하지 않으나, 간세포에서는 기능을 한다는 결과와 일치하고 있다. 추가적으로, 본 연구는 오브알부민 프로모터의 에스트로겐 처리에 의한 효과를 분석하여 Mut-4.4kb-pOV/pGL4.11 벡터가 도입된 HeLa, MES-SA, 그리고 LMH/2A 세포는 농도 별 에스트로겐 처리 결과 1,000 nM 수준의 에스트로겐 처리에서 반응성을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, Tsang et al.
- 추가적으로, 에스트로겐에 반응성이 높은 LMH/2A 세포에서 Mock, 2.8kb-pOV/pGL4.11, 5.5kb-pOV/pGL4.11, 그리고 Mut-4.4kbpOV/pGL4.11 벡터를 도입하고, 500 nM의 에스트로겐을 처리한 후에 각 프로모터의 활성을 비교한 결과, Mut-4.4kb- pOV는 2.8 그리고 5.5kb-pOV에 비해 7.1(P<0.001)와 2.6배(P<0.001) 발현이 높은 것을 확인하였다(Fig. 4A).
- 특히 LMH/2A 세포는 1,000 nM과 3,000 nM 처리결과, 2.5(P<0.001)와 3.3배(P<0.001) 높아, HeLa 및 MES-SA세포에 비해 에스트로겐 처리에 의한 반응성이 더 큰 것으로 확인되었다(Fig. 3C).
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