[논문]어류병원균 Streptococcus iniae의 toxin/antitoxin system에 대한 연구

윤성용; 김연하; 전문정; 성민지; 유아영; 이동희; 문기환; 강호영

doi:10.5352/jls.2019.29.1.97

어류병원균 Streptococcus iniae의 toxin/antitoxin system에 대한 연구
Studies on a Toxin/Antitoxin System in Streptococcus iniae 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.1 = no.225, 2019년, pp.97 - 104

윤성용 (부산대학교 대학원 생명시스템학과) , 김연하 (부산대학교 대학원 생명시스템학과) , 전문정 (부산대학교 대학원 생명시스템학과) , 성민지 (부산대학교 대학원 생명시스템학과) , 유아영 (부산대학교 미생물학과) , 이동희 (부산대학교 대학원 생명시스템학과) , 문기환 (한국해양대학교 해양생명과학부) , 강호영 (부산대학교 대학원 생명시스템학과)

초록
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Streptococcus iniae는 대표적인 어류병원균으로 인수공통의 질병을 일으킨다. S. iniae FP5228에 존재하는 병원성 인자를 찾고자 하는 연구과정에서 S. iniae를 24시간 이상 배양한 배양액에는 살아있는 균의 수가 급격하게 감소하는 현상을 발견하였다. 이 현상은 FP5228 균이 가지고 있는 14 kb plasmid 상에 있는 toxin/antitoxin (TA) system의 구성요소인 toxin ${\zeta}$와 antitoxin ${\varepsilon}$ 유전자가 관련이 있을 것이란 가설을 설정하였다. IPTG와 arabinose에 의해 toxin ${\zeta}$와 antitoxin ${\varepsilon}$의 발현이 조절되는 pBP1140 vector system을 구축하였다. E. coli/pBP1140 균주는 toxin이 발현되는 조건에서 초기 생육이 느려졌고, 현미경의 관찰에서 균체가 길어짐을 확인하였다. FP5228 균주가 가진 14 kb plasmid를 없앤 S. iniae CK287을 제조하였다. CK287 균은 배양 중 급격하게 사멸되는 현상을 보이지 않았고, biofilm 생성능력도 감소하였고 세포독성 시험과 물고기 시험에서 독성이 약화 된 것이 확인되었다. 이들 결과 들은 TA system이 생리적 조절 및 병원성 인자의 발현에 관련이 있음을 추정할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Streptococcus iniae is a typical fish pathogen causing streptococcosis and it can also cause zoonotic infectious diseases. We studied S. iniae FP5228 isolated from infected olive flounder in Wando, Korea. In a study to find virulence factors in FP5228, we found that the number of live bacteria decreased dramatically in culture medium containing S. iniae FP5228 for more than 24 hr. This phenomenon was hypothesized to be related to Toxin ${\zeta}$ and Antitoxin ${\varepsilon}$ genes, components of the Toxin/ Antitoxin (TA) system on the 14 kb plasmid of FP5228. We used a protein overexpression system to identify it. The pBP1140 vector system was constructed to regulate the expression of Toxin ${\zeta}$ and Antitoxin ${\varepsilon}$ by IPTG and Arabinose. E. coli/pBP1140 strain grew slowly in early growth under toxin expression condition, and it was confirmed by microscopic observation that the strain became longer. S. iniae CK287, lacking a 14 kb plasmid of S. iniae FP5228 strain, was constructed. CK287 bacterial cells did not show rapid killing during culture, and the ability to produce biofilm was also decreased, and toxicity was weakened in cytotoxicity test and fish test. These results suggest that the TA system is involved in physiological regulation and expression of virulence factors in S. iniae FP5228.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. PCR primers used in this study
그림 Fig. 1. Growth analysis of S. iniae, E. coli, B. subtilis, E. piscicida. The absorbance and viable count were measured every 12 hours. The absorbance was measured at OD₆₀₀, and the number of viable cells was determined by counting the colonies formed in the BHI agar plate after serial dilution with 0.85% NaCl solution.(A)S. iniae FP5228, (B) E. coli DH5a, (C) B. subtilis subsp. subtilis, (D) E. piscicida CK41; dark gray line : OD₆₀₀, gray line : viable count (CFU/ml).
그림 Fig. 2. Construction of overexpression vector of toxin and antitoxin in S. iniae FP5228. (A) pBP1140 vector construction process. (B) Confirmation of pBP1140 vector using PCR. M : marker, lane 1 ; antitoxin ε : 287 bp, lane 2; pBAD :: toxin ζ : 2643bp, lane 3 ; toxin ζ : 864 bp.
그림 Fig. 3. Growth analysis of toxin antitoxin overexpressed E. coli. The growth rate of the arabinose overexpressing strain at the early stage of growth was slower than the other conditions. (A) Growth curves measured using absorbance (OD _600nm). (B) Growth curves measured by viable count. (log CFU/ml/1,000,000), ◆ : control, ■ : IPTG induction, ▲ : Arabinose induction, × : IPTG & arabinose induction.
그림 Fig. 4. Morphological changes of E. coli BL21 overexpressing Toxin. Overexpression of toxin in E. coli BL21 confirmed that the cell length was prolonged. (Gram staining, ×400) ; (A) control (not induction), (B) IPTG induction, (C) Arabionse induction, (D) IPTG & arabinose induction.
그림 Fig. 5. Characteristic difference between wild type S. iniae (FP 5228) and plasmid-cured S. iniae (CK287). (A) Growth curves and viable counts of S. iniae FP5228 and CK287. It was confirmed that the decrease in viable cells was slightly improved in CK287.; ◆ OD₆₀₀ of FP5228, ▲: OD₆₀₀ of CK287, ■: CFU/ml of FP5228, ×: CFU/ml of CK287. (B) Plasmid preparation of S. iniae FP5228 and CK287.; lane 1 : FP5228, lane 2 : CK287. Plasmid size: 13,781 bp.
그림 Fig. 6. Comparison of biofilm formation between S. iniae FP5228 and CK287.
그림 Fig. 7. MTT assay between S. iniae FP5228 and CK287. In all cases, wild type S. iniae showed lower value than CK287. (n=3) (*p< 0.1).
그림 Fig. 8. Virulence of S. iniae strains in zebrafish. To confirm the virulence, different concentrations of bacteria were inoculated. Survival rate was measured for 12 days. ◆, FP5228 10⁸ CFU/fish; ■, FP5228 10⁷ CFU/fish; ▲, FP5228 10⁶ CFU/fish; Χ, CK287 10⁸ CFU/fish; Ж, CK287 10⁷ CFU/fish; ●, CK287 10⁶ CFU/fish.

AI 본문요약
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문제 정의

S. iniae FP5228 균주에서 유전자조작 및 형질전환이 어려우므로 상대적으로 쉬운 host인 E. coli에 toxin ζ와 antitoxin ε 단백질을 발현시켜 이들 단백질의 역할을 규명하고자 하였다.
Streptococcus iniae는 그람 양성의 Lancefield 항원이 존재하지 않는 연쇄구균으로 넙치, 역돔, 민어, 베스, 무지개송어 등에 감영하여 수막뇌염, 피부병변, 연쇄구균증(Streptococcosis) 등을 일으키는 어류병원균이며[2, 8], 병원성 유발에 관여하는 여러 병원성 인자들이 알려져 있다[3, 12, 19, 25]. 감염된 넙치로부터 분리된 균주인 Streptococcus iniae FP5228의 병원성 인자를 연구하고자 선행연구에서 FP5228 균주의 유전체분석을 진행하였다(GenBank accession no.: CP024843.1). 그 결과 plasmid (GenBank accession no.
이를 근거로, S. iniae FP5228의 계대 배양이 어려운 것은 plasmid에 존재하는 ε/ζ TA system 일수도 있다는 가설을 설정하고서 S. iniae FP5228의 ε/ζ TA system의 기능 및 특성을 알아보는 연구를 하였다.

제안 방법

Agarose gel로부터 DNA를 분리하고자 할 때 HiGeneTM Gel & PCR Purification System (Biofact)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 추출하였다.
Antitoxin ε과 toxin ζ의 발현이 각각 IPTG와 arabinose에 의해 조절되는 system을 구축하였다.
6). Biofilm 생성을 정량적으로 측정하기 위하여 0.1% crystal violet 용액으로 biofilm을 염색 하였고, 염색된 biofilm-crystal violet 복합체의 crystal violet 을 95% 에탄올로 추출하여 흡광도로 정량하였다(Fig. 6). FP 5228 균주 유래 샘플의 흡광도에 비해 CK287 균주 유래 샘플 의 흡광도가 낮은 것을 확인할 수 있었다.
Biofilm 형성의 측정은 O'Toole GA에 의해 기술되어있는 방법을 변형하여 진행하였다[17].
Curing된 균주의 확인은 PCR을 통하여 S. iniae 16s rRNA 유전자와 toxin ζ 유전자의 증폭 여부를 통하여 검증하였다.
2)은 IPTG에 의해 antitoxin 유전자 발현이 유도되며, arabinose에 의해 toxin 유전자가 발현되는 체계를 가진 재조합 plasmid이다. E. coli BL21/pBP1140 균주를 LB배지에서 배양 하면서 1 mM의 IPTG 또는 0.2% arabinose를 각각 또는 동시에 첨가하여 생균수의 변화를 측정하였다(Fig. 2). Control과 IPTG를 첨가하여 antitoxin 발현이 유도된 균주의 생육에 비해, arabinose 만 첨가하였거나 IPTG와 arabinose 둘 다를 첨가하여 toxin의 발현이 유도된 경우에는 생육저해 현상을 관찰할 수 있었다.
iniae CK287로 명명하였다. FP 5228균주와 CK287균주를 BHI배지에 접종하고서 배양하면서 각각 균의 생육을 흡광도와 생균수 측정으로 관찰하였다. 두 균주 모두 배양시간에 따라 OD₆₀₀의 값은 비슷한 패턴을 보였 으나, 생균수는 변화가 있음을 확인할 수 있었다(Fig.
HY1134F와 HY1135R 을 이용하여 PCR을 통해 증폭한 toxin ζ 유전자를 pBP1129의 PBADMCS에 존재하는 EcoRI/KpnI site에 클로닝하여 pBP1140 을 제조하여 ζ 단백질 발현이 arabinose에 의해 조절되게 구축 하였다.
Agarose gel로부터 DNA를 분리하고자 할 때 HiGeneTM Gel & PCR Purification System (Biofact)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 추출하였다. HY540과 HY541 primer는 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석을 위해 이용하였고, HY1025F와 HY1026R primer를 이용하여 S. iniae의 균주 확인에 이용하였다.
HeLa 세포주는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco) 배지에 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% penicillin-streptomycin (Gibco)을 첨가하여 사용하였다.
IPTG와 arabinose를 활용한 발현조건에서 배양된 균체의 형태를 광학현미경으로 관찰하였다.
iniae FP5228균이 가진 약 14 kb plasmid를 제거하기 위하여 McHugh 등이 적용한 plasmid curing 과정을 변형하여 사용하였다[14]. Plasmid 유전체에는 chloramphenicol 내성을 나타내는 유전자가 있으므로 이를 screening marker로 사용하였다. S.
S. iniae FP5228 strain을 BHI 배지에 접종하고서 배양하면 서 12시간 간격으로 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하였고, 배양액을 적절히 희석하여 생균수를 측정한 결과 흥미로운 현상을 발견하였다(Fig. 1A). 초기 배양부터 24시간까지는 정상적인 생육패턴을 보이다가 24시간 이후부터는 흡광도(배양액 내의 총 입자량을 의미)는 계속 유지하는 경향을 보이나 생균수는 급격하게 줄어들었다.
S. iniae FP5228균이 가진 약 14 kb plasmid를 제거하기 위하여 McHugh 등이 적용한 plasmid curing 과정을 변형하여 사용하였다[14]. Plasmid 유전체에는 chloramphenicol 내성을 나타내는 유전자가 있으므로 이를 screening marker로 사용하였다.
Biofilm 형성의 측정은 O'Toole GA에 의해 기술되어있는 방법을 변형하여 진행하였다[17]. S. iniae를 BHI배지에서 12시간 배양 후, 새로운 20 ml BHI배지에 전배양액을 1% 농도로 접종하였다. 접종한 배양액을 96 well plate에 200 μl씩 분주하여 27℃에서 48시간 정치 배양하였다.
50 1 크기의 수조에 24℃의 온도를 유지하며 제브라피시 (Danio rerio)를 사육하며 실험에 이용하였으며 제브라피시는 부산 근교의 수족관(못골 수족관)에서 공급받아 사용하였다. S. iniae의 배양액을 OD₆₀₀ 1.2가 되었을 때 원심분리를 실시하여 균체를 모았다. 균체는 PBS (pH 7.
coli의 competent cell은 rubidium chloride 용액을 이용하여 제조하 였고, 형질전환은 heat-shock 방법으로 하였다. S. iniae의 형질 전환은 MicroPulser Electroporator (Bio-Rad)를 이용한 electroporation으로 하였다.
Streptococcus iniae가 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하 여 MTT 분석을 진행하여 세포 독성 및 생존율을 측정하였다. HeLa 세포를 각 well 당 7×10⁴ cells/ml로 접종하고서 24시간 동안 배양하였다.
TA system이 결손된 S. iniae CK287균주가 parental strain 인 FP5228 균주와 비교할 때 세포독성에 미치는 영향을 확인 하기 위해 MTT 분석을 실시하였다. MTT 분석 결과 MOI 10:1 에서, CK287을 처리한 경우보다 FP5228을 처리하였을 때 그 값이 낮은 것을 확인할 수 있었고, 세포에 더 많은 독성을 나타내고, 살아있는 세포가 더 적음을 알 수 있었다(Fig.
유전자의 확인 및 클로닝에 사용할 DNA 단편을 얻기 위하여 PCR 증폭법을 사용하였으며, PCR에 사용된 primer를 Table 1에 열거하였다. Taq DNA polymerase나 Pfu DNA polymerase를 PCR 반응에 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 denaturation, 45℃에서 annealing, 72℃에서 elongation 반응을 진행시켰는데 각 단계별 반응시간은 상황에 따라 달리하였다. 증폭된 DNA 산물을 확인하거나 정제하기 위해서 agarose gel을 이용한 DNA 전기영동을 실시하였다.
Toxin ζ가 세균의 형태에 영향을 미치는지를 관찰하였다.
Toxin ζ와 antitoxin ε의 발현은 E. coli BL21 (DE3)/ pBP1140의 OD600이 약 0.4 일 때, 1mM의 IPTG 또는 0.2% arabionse를 각각 첨가하거나 동시에 첨가한 후 흡광도와 생균수를 1시간 간격으로 측정하며 관찰하였다.
antitoxin ε 유전자를 HY1080R와 HY1150F primer를 이용하여 PCR을 통해 증폭하 였고, pET28a의 NcoI/SacI site에 클로닝하여 pBP1115를 제조 하여 ε 단백질 발현이 IPTG에 의해 조절되도록 구축하였다.
antitoxin ε 유전자를 HY1080R와 HY1150F primer를 이용하여 PCR을 통해 증폭하 였고, pET28a의 NcoI/SacI site에 클로닝하여 pBP1115를 제조 하여 ε 단백질 발현이 IPTG에 의해 조절되도록 구축하였다. pBAD24의 PBAD promoter와 AraC 유전자를 HY1175F와 HY1176R을 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후 pBP1115의 BglII site에 클로닝하여 pBP1129를 구축하였다. HY1134F와 HY1135R 을 이용하여 PCR을 통해 증폭한 toxin ζ 유전자를 pBP1129의 PBADMCS에 존재하는 EcoRI/KpnI site에 클로닝하여 pBP1140 을 제조하여 ζ 단백질 발현이 arabinose에 의해 조절되게 구축 하였다.
이후 증류수를 이용하여 다시 세척하고, 세척된 well에 95% 에탄올을 이용하여 biofilm에 염색된 색소를 탈색하는 과정을 진행하였다. 각 well의 용액은 595 nm에서 흡광도를 측정하여 biofilm 형성 정도를 측정하였다.
5B), Plasmid내에 있는 유전자가 PCR로 증폭되지 않음으로 확인하였다(data not shown). 그 균주가 오염균이 아니고 S. iniae 임은 16s rRNA 유전자 분석과 API 20 strep을 이용하여 균주를 검증하였다(data not shown). 최종 검정된 균을 S.
4C), 이는 곧 균의 표면에 부착물 생성이 달라졌다고 유추가 가능하다. 그래서 S. iniae의 plasmid 유무에 따른 biofilm 생성을 관찰하였다(Fig. 6). Biofilm 생성을 정량적으로 측정하기 위하여 0.
대조군으로 20 μl의 PBS를 5마리의 제브라피시에 복강 내 주사 후, 12일간 생존율을 관찰하였다.
HeLa 세포주는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco) 배지에 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% penicillin-streptomycin (Gibco)을 첨가하여 사용하였다. 배양을 위한 조건으로 37℃, 습도 95%, 5% CO₂상태를 유지하여 60 mm petri dish를 이용하여 배양하였다. 배양한 세포주는 Trypsin/EDTA (Gibco) 를 이용하여 부착세포를 떼어내었고, 1×10⁶ cells/ml의 세포를 새로운 petri dish로 계대배양하는 과정을 진행하였다.
배양한 세포에 대수증식기의 S. iniae 균주를 DMEM 배지에 희석하여 multiplicity of infection (MOI)가 10:1이 되도록 조절하여 접종하였고, 37℃, 습도 95%, 5% CO2 조건에서 1시간 배양하였다.
배양 후 각 well의 배지를 제거한 후 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Gibco) 로 두 번 세척하였고, 세척 한 well에 DMEM 배지를 500 μl 첨가 하고, MTT 용액을 50 μg/ml 농도가 되도록 처리하였고 4시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, DMSO 를 이용하여 발색을 진행하였고 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7). 부가적으로 숙주에서의 병원성을 나타내는 정도를 비교하기 위하여 제브라피시의 생존정도를 측정하였다. 그 결과, 10⁸ CFU/fish 의 농도로 투여하였을 경우, FP5228과 CK287에서 큰 차이가 나타나지 않았다(Fig.
IPTG와 arabinose를 활용한 발현조건에서 배양된 균체의 형태를 광학현미경으로 관찰하였다. 샘플의 전처리 과정으로 그람 염색법으로[13] 세포를 염색한 후 400배 배율로 관찰하였다(Fig. 4). Arabinose 첨가로 toxin ζ의 발현이 유도 된 균체는 다른 실험군 샘플에 비해 길이가 길어지는 현상을 확인할 수 있었다(Fig.
Toxin ζ가 세균의 형태에 영향을 미치는지를 관찰하였다. 이들 단백질들의 조건적 발현이 Streptococcus에서는 불가능하므로 heterologous host인 E. coli BL21/pBP1140 균주에서 관찰하였다. IPTG와 arabinose를 활용한 발현조건에서 배양된 균체의 형태를 광학현미경으로 관찰하였다.
Taq DNA polymerase나 Pfu DNA polymerase를 PCR 반응에 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 denaturation, 45℃에서 annealing, 72℃에서 elongation 반응을 진행시켰는데 각 단계별 반응시간은 상황에 따라 달리하였다. 증폭된 DNA 산물을 확인하거나 정제하기 위해서 agarose gel을 이용한 DNA 전기영동을 실시하였다. Agarose gel로부터 DNA를 분리하고자 할 때 HiGeneTM Gel & PCR Purification System (Biofact)을 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 추출하였다.
항생제는 필요에 따라 각각의 배양 조건에서 ampicillin, 100 μg/ml; kanamycin, 50 μg/ml; chloramphenicol, 30 μg/ml 농도로 첨가하였다.
현탁 균액을 적절히 희석한 후 106 ~108 CFU/20μl투여량으로 각각 10마리씩 제브라피시의 복강으로 주입하였다.

대상 데이터

50 1 크기의 수조에 24℃의 온도를 유지하며 제브라피시 (Danio rerio)를 사육하며 실험에 이용하였으며 제브라피시는 부산 근교의 수족관(못골 수족관)에서 공급받아 사용하였다.
형성된 집락들은 벨벳 replica나 tooth pick을 사용하여 chloramphenicol이 포함된 BHI 고체배지와 포함되지 않은 고체배지에 patching하 여 27℃에서 배양하였다. Chloramphenicol에 감수성을 지닌 균을 선택하였다. Curing된 균주의 확인은 PCR을 통하여 S.
HeLa (KCLB No. 10002) 세포주를 한국 세포주은행(Korean cell line bank)에서 분양 받아 사용하였다. HeLa 세포주는 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco) 배지에 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% penicillin-streptomycin (Gibco)을 첨가하여 사용하였다.
계대배양은 이틀 간격으로 진행하였으며 계대배양 횟수가 4번 이상인 세포를 실험에 사용하였다.
연구에서 사용한 Escherichia coli 는 Luria-Bertani (LB) 액체배지 또는 1.5% agar 를 첨가한 고체배지를 사용하여 37℃에서 배양하였고, Streptococcus iniae 와 Bacillus subtilis, Edwardsiella piscicida 는 Brain Heart Infusion (BHI, Oxoid)의 액체배지 또는 1.5% agar를 첨가한 고체배지를 사용하여 27℃에서 배양하였다. 항생제는 필요에 따라 각각의 배양 조건에서 ampicillin, 100 μg/ml; kanamycin, 50 μg/ml; chloramphenicol, 30 μg/ml 농도로 첨가하였다.
재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 S. iniae FP5228 균이 가지고 있는 약 14 kb 크기의 plasmid를 제거하였다. 제거의 확인은 plasmid purification 방법으로 그 plasmid가 추출되지 않는 것으로 확인하였고(Fig.

이론/모형

본 연구에서 이루어진 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법에 준하여 수행하였다[18]. E. coli의 competent cell은 rubidium chloride 용액을 이용하여 제조하 였고, 형질전환은 heat-shock 방법으로 하였다. S.
본 연구에서 이루어진 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법에 준하여 수행하였다[18]. E.
유전자의 확인 및 클로닝에 사용할 DNA 단편을 얻기 위하여 PCR 증폭법을 사용하였으며, PCR에 사용된 primer를 Table 1에 열거하였다. Taq DNA polymerase나 Pfu DNA polymerase를 PCR 반응에 사용하였고, 반응조건은 95℃에서 denaturation, 45℃에서 annealing, 72℃에서 elongation 반응을 진행시켰는데 각 단계별 반응시간은 상황에 따라 달리하였다.

성능/효과

Arabinose 첨가로 toxin ζ의 발현이 유도 된 균체는 다른 실험군 샘플에 비해 길이가 길어지는 현상을 확인할 수 있었다(Fig. 4C).
2). Control과 IPTG를 첨가하여 antitoxin 발현이 유도된 균주의 생육에 비해, arabinose 만 첨가하였거나 IPTG와 arabinose 둘 다를 첨가하여 toxin의 발현이 유도된 경우에는 생육저해 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 저해 현상은 초기배양 5시간까지만 볼 수 있었고 그 이후에는 control과 비슷한 생육정도를 보였다.
6). FP 5228 균주 유래 샘플의 흡광도에 비해 CK287 균주 유래 샘플 의 흡광도가 낮은 것을 확인할 수 있었다. Plasmid를 제거함으로써 biofilm 형성의 정도가 낮아지는 것을 알 수 있었다.
FP 5228는 지금까지 관찰되어온 전형적인 패턴을 가지는 반면에 CK287 균주는 계속 급격히 사멸하는 것이 아니고 일정 수준의 균수를 유지하는 양상을 보였다.
iniae CK287균주가 parental strain 인 FP5228 균주와 비교할 때 세포독성에 미치는 영향을 확인 하기 위해 MTT 분석을 실시하였다. MTT 분석 결과 MOI 10:1 에서, CK287을 처리한 경우보다 FP5228을 처리하였을 때 그 값이 낮은 것을 확인할 수 있었고, 세포에 더 많은 독성을 나타내고, 살아있는 세포가 더 적음을 알 수 있었다(Fig. 7). 부가적으로 숙주에서의 병원성을 나타내는 정도를 비교하기 위하여 제브라피시의 생존정도를 측정하였다.
S. iniae FP5228 균주는 약 14 kb 크기의 plasmid를 가지고 있음이 확인되었고 완전한 염기서열이 알려졌다. 이 plasmid 가 암호화하고 있는 정보를 분석한 결과 toxin ζ와 antitoxin ε 유전자들이 암호화 되어 있고 이들 ε/ζ TA system 유전자들이 operon 구조를 하고 있음을 분석할 수 있었다(data not shown).
1). 그 결과 plasmid (GenBank accession no.: CP024844.1)의 존재를 알게 되었다. 이전 연구에서, 다른 어류 병원체인 Edwardsiella tarda CK41에 있는 pCK41 plasmid는 병원성에 관련 있는 유전자를 지닌 병원성 plasmid 임을 확인한 바 있다[24].
그람 음성균인 E. coli와 E. piscicida, 그람 양성균인 B. subtilis를 동일조건으로 배양하면서 생육을 측정한 결과 S. iniae 에서와 같은 현상이 나타나지 않았다(Fig. 1B ~ Fig. 1D). 이 결과는 24시간 배양 이후 급격하게 생균수가 감소하는 현상은 S.
FP 5228균주와 CK287균주를 BHI배지에 접종하고서 배양하면서 각각 균의 생육을 흡광도와 생균수 측정으로 관찰하였다. 두 균주 모두 배양시간에 따라 OD₆₀₀의 값은 비슷한 패턴을 보였 으나, 생균수는 변화가 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 5). FP 5228는 지금까지 관찰되어온 전형적인 패턴을 가지는 반면에 CK287 균주는 계속 급격히 사멸하는 것이 아니고 일정 수준의 균수를 유지하는 양상을 보였다.
따라서 S. iniae FP5228에 존재하는 plasmid도 어류에 병원성을 유발할 수 있는 인자들을 가지고 있는지를 확인하고자 하였고, 그 결과 toxin ζ 와 antitoxin ε 유전자들이 암호화되어 있음을 발견하였다.
pnumoniae 의 연구 결과에서, PezAT를 제거하게 되면 병원성이 낮아지는 것이 이미 보고되었다[15]. 따라서, S. iniae 의 TA system의 제거는 병원성을 저하시킬 수 있음을 유추할 수 있었다.
이러한 저해 현상은 초기배양 5시간까지만 볼 수 있었고 그 이후에는 control과 비슷한 생육정도를 보였다. 생균수 측정 결과에서도 arabinose 첨가에 의한 toxin 발현 배양에서 생장 초기에 낮은 생균수를 나타내었다(Fig. 3). 이들 결과는 본 연구에서 제조된 pBP1140에 의해 toxin/antitoxin 의 발현이 유도되어 이들 단백질들이 그 역할을 하는 것으로 여겨진다.
이 plasmid 가 암호화하고 있는 정보를 분석한 결과 toxin ζ와 antitoxin ε 유전자들이 암호화 되어 있고 이들 ε/ζ TA system 유전자들이 operon 구조를 하고 있음을 분석할 수 있었다(data not shown).
1D). 이 결과는 24시간 배양 이후 급격하게 생균수가 감소하는 현상은 S. iniae의 특이적인 생리현상이라 추정되었다(Fig. 1A). FP5228 균주가 나타내는 만큼의 급격하지는 않으나 세균 생육 단계 중 사멸기에 완만하게 감소하는 현상은 일반적이며, 이는 주로 영양분 부족, 산화적 스트레스, 생체이물질(xenobiotics)의 축적 등의 원인 때문이라고 보고되고 있다[11, 13].
3). 이들 결과는 본 연구에서 제조된 pBP1140에 의해 toxin/antitoxin 의 발현이 유도되어 이들 단백질들이 그 역할을 하는 것으로 여겨진다. 다만 불행하게도 SDS-PDAGE에서 이들 발현된 단백질의 band는 보이지 않았고, 뿐만 아니라 특정 enzymatic activity를 모르는 관계로 활성을 측정할 수 없었다.
iniae FP5228 균이 가지고 있는 약 14 kb 크기의 plasmid를 제거하였다. 제거의 확인은 plasmid purification 방법으로 그 plasmid가 추출되지 않는 것으로 확인하였고(Fig. 5B), Plasmid내에 있는 유전자가 PCR로 증폭되지 않음으로 확인하였다(data not shown). 그 균주가 오염균이 아니고 S.
iniae 임은 16s rRNA 유전자 분석과 API 20 strep을 이용하여 균주를 검증하였다(data not shown). 최종 검정된 균을 S. iniae CK287로 명명하였다. FP 5228균주와 CK287균주를 BHI배지에 접종하고서 배양하면서 각각 균의 생육을 흡광도와 생균수 측정으로 관찰하였다.

후속연구

하지만 처음에 가정하였던 균체의 길어지는 현상과 biofilm 생성과의 연계성은 찾아보기 어려웠다. Plasmid가 제거 되어 biofilm형성에 영향을 주긴 했으나 이것이 TA system 하고 직접적인 관련성을 추후 연구에서 밝혀야 하는 부분이다.
이 연구에서 얻어진 모든 현상 및 결과를 종합해 보면, TA system의 구체적 기작이 밝혀진다면 일정 시간 후 사멸하는 S. iniae 균의 특이적 생리현상을 이해 할 수 있을 것으로 판단되며, 이를 근거로 이 균이 어류에서 감염을 이루어 나가는 과정도 이해할 수 있을 것으로 예측된다.
이는 제거된 plasmid에 암호화 되어 있는 유전자들이 사멸에 일부분 관여할 것이라는 것 을 암시한다. 특히 TA system이 관련되어 있을 것으로 추정되나 현 단계에서는 확정하기 어렵고 추후 연구가 필요하다.
다만 불행하게도 SDS-PDAGE에서 이들 발현된 단백질의 band는 보이지 않았고, 뿐만 아니라 특정 enzymatic activity를 모르는 관계로 활성을 측정할 수 없었다. 향후 계속 되는 연구에서 이들 단백질에 특이성이 있는 항체를 제작하여 immunoblotting analysis를 통해 정량이 가능할 것이 여겨진다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	TA system에서 II형은 무슨 형태인가?	TA system의 toxin은 세균 세포 내 DNA 복제, tRNA 합성, 세포벽 합성 등에 관계하는 다양한 단백질들을 표적으로 하여 생리적 조절을 한다[1]. 이러한 TA system은 세균에서 I형~VI형이 알려져 있는데[4-7, 10, 21, 22], 그 중 II형은 불안정한 antitoxin 단백질이 안정한 toxin 단백질에 결합하여 toxin의 작용을 막는 단백질-단백질 상호작용을 하는 형태이다. II형 TA system의 한 예로 그람 양성 세균에서 발견되는 ε/ζ TA system이 있다.
	toxin-antitoxin (TA) system의 구성은 무엇으로 되어있는가?	세균이 가진 다양한 생리조절 체계들 중의 하나가 toxin-antitoxin (TA) system이다[9]. 일반적으로 TA system은 두 종류 이상의 단백질로 구성되나 주요 역할을 담당하는 단백질은 toxin 단백질과 antitoxin 단백질이 있다. 이들 단백질을 암호화하는 유전자들은 오페론(operon)의 구조로 이루어져 있다.
	TA system의 toxin은 무엇에 관여하는가?	이들 단백질을 암호화하는 유전자들은 오페론(operon)의 구조로 이루어져 있다. TA system의 toxin은 세균 세포 내 DNA 복제, tRNA 합성, 세포벽 합성 등에 관계하는 다양한 단백질들을 표적으로 하여 생리적 조절을 한다[1]. 이러한 TA system은 세균에서 I형~VI형이 알려져 있는데[4-7, 10, 21, 22], 그 중 II형은 불안정한 antitoxin 단백질이 안정한 toxin 단백질에 결합하여 toxin의 작용을 막는 단백질-단백질 상호작용을 하는 형태이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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