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문제 정의
- 본 연구는 기존에 개에서 실시된 피모벤단과 펜톡시필린의 약물약동학 및 약물약력학 연구를 바탕으로, 국내에서 개발된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제를 투여하였을 때에 나타나는 변화를 기존의 연구와 비교하고자 하였다.
- 따라서 피모벤단과 펜톡시필린은 심장 질환을 가진 개에서 함께 사용하였을 때에 유익한 효과를 가질 것으로 생각된다. 본 연구는 기존에 개에서 실시된 피모벤단과 펜톡시필린의 연구를 참고하여(2,7,11), 건강한 비글견에 피모벤단-펜톡시필린 합제를 투여 시 나타나는 약물약동학과 약력학의 변화 및 심근에 미치는 영향을 확인하고자 실험을 실시하였다.
- 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 약물약력학의 경우, 2016년에 실시된 수용성 액체 피모벤단 제제 연구의 실험설계를 참고하여 심초음파를 이용한 약물 작용 평가를 실시하고자 하였다(11). 기존에 실시된 연구에 따르면 약 0.
제안 방법
- 전반적인 약물약동학(Pharmacokinetics) 분석은 호서대학교 바이오의과학연구소에서 진행하였다. 개에서 피모벤단(pimobendan)과 펜톡시필린(pentoxifylline)이 혼합된 제제를 경구로 적용하는데 있어 본제의 유효성분 중 피모벤단과 펜톡시필린의 혈중 유효 농도를 확인하고자 수행하였으며, 비글견에 피모벤단과 펜톡시필린을 각각 체중 kg당 0.25 mg/kg, 15 mg/kg의 용량으로 경구투여 한 후 투여 후 5분, 10분,15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간째에 채혈한 후 분리된 혈장을 전처리를 거친 후 LC-MS/MS(Agilent 1200 series, Agilent; ABI API4500 MS/MS system, SCIEX)로 피모벤단과 펜톡시필린의 함량을 분석하여 약물약동학 분석을 실시하였다.
- 기존 연구방법에 준하여, 약물이 심장에 미치는 효과는 시간에 따른 각 지표의 변화로 나타내었다. 개의 크기에 따라IVSs, IVSDd, LVIDs, LVIDd, LVPWs, LVPWd, LA, Ao의 크기가 영향을 받을 수 있으므로, 몸무게를 통해 수치를보정하였다(6). 약물약력학 분석의 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다.
- 검량선을 작성하여 혈장에서 피모벤단과 펜톡시필린을 정량하였고, 검출한계(LOD)는 S/N(Signal to noise) 비율의 3배로, 정량한계(LOQ)는 S/N 비율의 10배 이상의 농도로 계산하였다.
- 경정맥 채혈을 통한 혈액 5 mL 채취는 경구투여 후 5,10, 15, 30, 45분과 1, 1.5, 2, 3, 4, 8, 12, 24시간에 실시하였다. 샘플 채취 시간동안 모든 개체는 물을 자유 급이하며, 사료는 4시간째 샘플 채취 이후 급이하였다.
- 약물 투여 당일, 각 그룹에 할당된 양의 경구용량을 단회투여하였다. 대조군은 약물이 첨가되지 않은 분말 부형제를 급여하며, 실험군은 피모벤단-펜톡시필린 합제를 Pimobendan0.25 mg/kg, Pentoxifylline 15 mg/kg으로 경구 투여하였다. 모든 개체는 투여 후 5-10 mL의 물을 급여하여 약물이 확실히 섭취되도록 하였다.
- 무처치 개 혈장 시료에 표준물질을 첨가하고 전처리 과정을 거친 시료로 검량선을 그렸다. 측정값의 표준편차로 S/N(Signal to Noise) 비의 3배의 농도를 검출한계로 구하였으며 정량한계는 S/N비의 10배의 농도로 계산하였다.
- 실험 설계는 기존에 개에서 실시된 연구 설계를 참고하였으며(7,11), 무작위적, 실험자-맹검적인 단회 투여, 동일 용량연구방법이 실시되었다. 실험견은 무작위로 실험군과 대조군두 그룹(각 4마리씩)으로 나누었다.
- 실험 하루 전, 모든 실험견에 기본 신체검사를 재실시하였으며, 혈압 측정(petMAPTM, Ramsey Medical) 및 심초음파를 실시하여 정상 심장 구조 및 기능을 확인하였다. 약물 투여 12시간 전 사료를 급여하여 공복을 유지하였다.
- 실험견들은 심초음파 실시 전 횡와 자세에 익숙해지도록 미리 교육하였다. 보정자 외에 다른 진정 약물은 사용하지 않았다.
- 실험 설계는 기존에 개에서 실시된 연구 설계를 참고하였으며(7,11), 무작위적, 실험자-맹검적인 단회 투여, 동일 용량연구방법이 실시되었다. 실험견은 무작위로 실험군과 대조군두 그룹(각 4마리씩)으로 나누었다. 약물약력학 분석 및 약물약동학 지표 측정에 참여한 조사자들은 약물과 대사체의 혈중 농도와 심혈관 지표 측정 결과가 나올 때까지 치료개체에 대한 정보를 알지 못하도록 하였다.
- 실험기간 동안 온도, 습도는 동일하게 유지하며 사료는 하루 2회 동일 제품(Natural Balance LID Potato & Duck Grain Free, Natural Balance)으로 급이하고 물은 자유 급이하였다.
- 모든 개체는 투여 후 5-10 mL의 물을 급여하여 약물이 확실히 섭취되도록 하였다. 심초음파 검사(EPIQ 7 Cardiology Ultrasound Machine, Philips)는 투여 30분 전, 투여 직전,투여 후 15분, 30분, 1, 1.5, 2, 3, 4, 8, 12, 24시간에 실시하였다.
- 본 실험 동안 심초음파(EPIQ 7 Cardiology Ultrasound Machine, Philips)는 한 명의 조사자에 의해 실시되었다. 심초음파 측정 항목은 기존 연구를 참고하였으며(11), 좌심방 크기(left atrium size; LA), 대동맥 크기(aorta size; Ao),좌심방과 대동맥 비율(left atrium to aorta ratio; LA/Ao),이완기말 심실중격 두께(interventricular septal septumdiastole; IVSd), 수축기말 심실중격 두께(interventricularseptum systole; IVSs), 이완기말 좌심실 직경(left ventricular internal diameter diastole; LVIDd), 수축기말 좌심실 직경(left ventricular internal diameter systole; LVIDs), 이완기말 좌심실 후벽 두께(left ventricular posterior wall diastole;LVPWd), 수축기말 좌심실 후벽 두께(left ventricular posterior wall systole; LVPWs), 좌심실 단축률(fractionalshortening; FS), 대동맥 혈류 속도(aortic flow velocity; Aovel), 수축 전 기간(pre-ejection period; PEP), 좌심실 수축시간(left ventricular ejection time; LVET)을 포함하였다.
- 약물 투여 당일, 각 그룹에 할당된 양의 경구용량을 단회투여하였다. 대조군은 약물이 첨가되지 않은 분말 부형제를 급여하며, 실험군은 피모벤단-펜톡시필린 합제를 Pimobendan0.
- 실험군과 대조군의 데이터 비교 및 약물 투여 전후 데이터 비교에는 Mann-Whitney test 방법이 사용되었다. 약물 투여 후 시간에 따른 LA size, Ao size, LA/Ao, IVSd, IVSs,LVIDd, LVIDs, LVPWd, LVPWs, FS, Ao vel, PEP,LVET를 측정하였으며 이러한 지표에서 나타난 실험군과 대조군의 차이, 혹은 약물 투여 전후의 차이가 통계적 유의성을 갖는지 분석하였다. 두 그룹간 지표의 차이는 P-value가 0.
- 이후 15,000 G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 vial에 옮겨 담고, 증류수 250 μL을 첨가한 후 LC-MS/MS로 분석하였다(Fig 1).
- 전반적인 약물약동학(Pharmacokinetics) 분석은 호서대학교 바이오의과학연구소에서 진행하였다. 개에서 피모벤단(pimobendan)과 펜톡시필린(pentoxifylline)이 혼합된 제제를 경구로 적용하는데 있어 본제의 유효성분 중 피모벤단과 펜톡시필린의 혈중 유효 농도를 확인하고자 수행하였으며, 비글견에 피모벤단과 펜톡시필린을 각각 체중 kg당 0.
- 정확도(회수율)와 정밀도(변이계수, CV)를 산출하기 위하여 QC sample을 이용하여 각 농도에 대하여 최소 3번의 시험을 실시하였다.
- 질량 분석은 API 4000 MS/MS System(SCIEX, USA)를사용하였고 ESI(Electrospray Ionization)로 fragmentation이 일어난 Positive ion은 MS/MS mode로 검출하였다.
- 피모벤단-펜톡시필린 합제를 투여한 실험군에서 시간에 따라 기존 지표 값과 유의적인 차이를 나타낸 지표는 다음과 같았다: FS(1-4시간), LVIDs(1-3시간), PEP(3, 4시간) (Fig 4). FS는 기존 지표값에 비해 증가하였으며, LVIDs와 PEP는 감소하였다.
- 혈액샘플은헤파린 튜브에 보관된 후 4시간 이내에 5분간 원심분리하여 혈장을 채취하였고, 액체 크로마토그래프 질량분석(LC-MS) 시까지 −70℃에 보관하였다.
대상 데이터
- 8마리(암컷 6마리, 수컷 2마리), 체중 7 kg에서 13 kg까지의 건강한 실험견(비글견)을 사용하였다. 실험견은 기본 신체검사 및 혈액, 혈액화학, 뇨검사 등을 통하여 다른 질환이 없는 건강한 개체로 선발하였다.
- 보정자 외에 다른 진정 약물은 사용하지 않았다. 본 실험 동안 심초음파(EPIQ 7 Cardiology Ultrasound Machine, Philips)는 한 명의 조사자에 의해 실시되었다. 심초음파 측정 항목은 기존 연구를 참고하였으며(11), 좌심방 크기(left atrium size; LA), 대동맥 크기(aorta size; Ao),좌심방과 대동맥 비율(left atrium to aorta ratio; LA/Ao),이완기말 심실중격 두께(interventricular septal septumdiastole; IVSd), 수축기말 심실중격 두께(interventricularseptum systole; IVSs), 이완기말 좌심실 직경(left ventricular internal diameter diastole; LVIDd), 수축기말 좌심실 직경(left ventricular internal diameter systole; LVIDs), 이완기말 좌심실 후벽 두께(left ventricular posterior wall diastole;LVPWd), 수축기말 좌심실 후벽 두께(left ventricular posterior wall systole; LVPWs), 좌심실 단축률(fractionalshortening; FS), 대동맥 혈류 속도(aortic flow velocity; Aovel), 수축 전 기간(pre-ejection period; PEP), 좌심실 수축시간(left ventricular ejection time; LVET)을 포함하였다.
- 본 실험에는 1 년령 이상의 비글견 8마리가 선발되었다. 모든 개체는 실험전 1 주일의 환경 적응 기간을 거쳤으며, 신체검사 및 기타 실험실 검사에서 문제가 없는 건강한 개 체로 선발하였다.
- 8마리(암컷 6마리, 수컷 2마리), 체중 7 kg에서 13 kg까지의 건강한 실험견(비글견)을 사용하였다. 실험견은 기본 신체검사 및 혈액, 혈액화학, 뇨검사 등을 통하여 다른 질환이 없는 건강한 개체로 선발하였다. 실험 개체는 실험 전 1주간 같은 환경에 계류하였다.
데이터처리
- 개의 크기에 따라IVSs, IVSDd, LVIDs, LVIDd, LVPWs, LVPWd, LA, Ao의 크기가 영향을 받을 수 있으므로, 몸무게를 통해 수치를보정하였다(6). 약물약력학 분석의 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다.
- 무처치 개 혈장 시료에 표준물질을 첨가하고 전처리 과정을 거친 시료로 검량선을 그렸다. 측정값의 표준편차로 S/N(Signal to Noise) 비의 3배의 농도를 검출한계로 구하였으며 정량한계는 S/N비의 10배의 농도로 계산하였다. 피모벤단의검출한계는 0.
이론/모형
- 실험군과 대조군의 데이터 비교 및 약물 투여 전후 데이터 비교에는 Mann-Whitney test 방법이 사용되었다. 약물 투여 후 시간에 따른 LA size, Ao size, LA/Ao, IVSd, IVSs,LVIDd, LVIDs, LVPWd, LVPWs, FS, Ao vel, PEP,LVET를 측정하였으며 이러한 지표에서 나타난 실험군과 대조군의 차이, 혹은 약물 투여 전후의 차이가 통계적 유의성을 갖는지 분석하였다.
성능/효과
- 피모벤단-펜톡시필린 합제를 투여한 실험군에서 시간에 따라 기존 지표 값과 유의적인 차이를 나타낸 지표는 다음과 같았다: FS(1-4시간), LVIDs(1-3시간), PEP(3, 4시간) (Fig 4). FS는 기존 지표값에 비해 증가하였으며, LVIDs와 PEP는 감소하였다. 약물의 최대 효과는 투여 후 2시간과 4시간 사이에 나타났으며, 실험군과 대조군 간의 유의적 차이(P <0.
- LC-MS/MS를 이용하여 피모벤단의 약물동태를 분석한 결과, 모든 개체에서의 피모벤단 혈중 최고농도도달시간(Tmax)은 1.08 ± 0.72시간이었으며, 혈중최고농도(Cmax)는 2.83 ±1.50 ng/mL으로 나타났다.
- 결론적으로 피모벤단과 펜톡시필린의 분석법의 검증 결과 모두 인정할 만한 수준의 분석법임이 확인되었다.
- 25 mg/kg의 농도로 경구투여 시 투여 1시간 후부터 FS가 증가하고 LVIDs와 PEP가 감소하였으며, 약물의 최대 효과는 투여 후 약 2시간과 4시간 사이에 나타났다. 따라서 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 경구 투여 이후 기존의 논문과 유사한 심초음파 지표에서 효과를 나타냄을 확인하였다. 펜톡시필린은 피모벤단과 마찬가지로 포스포디에스터라아제 억제제로(12), 피모벤단과 함께 심장의 후부하(afterload)를 감소시킬 수 있는 약물로 생각되며, 혈액의 점도를 낮추고 혈류를 개선하며 심장으로의 혈류흐름을 증대시키는 작용을 통해 심초음파 지표상에도 확인가능한 개선 효과를 가질 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 경구투여 되었을 때 펜톡시필린의 혈장 내 최대 평균 농도는 특이적인 간섭이나 흡수저해 없이 유효한 수준을 유지할 수 있음을 확인하였으며, 기존 연구에 사용된 약물보다 더 빠른 시간 내에 최고 농도에 도달하였다. 이는 피모벤단의 경우와 마찬가지로 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 제형 특성 및 약물의 절대적 생체이용률 차이에 의한 것으로 생각된다.
- 따라서, 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 경구투여 되었을 때 피모벤단의 혈장 내 최대 평균 농도는 특이적인 간섭이나 흡수저해 없이 유효한 수준을 유지할 수 있음을 확인하였다. 또한 Vetmedin 정제의 최대 농도는 투여 후 평균 2시간째에, 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 피모벤단 최대 농도는 투여 후 1.
- 또한 Vetmedin 정제의 최대 농도는 투여 후 평균 2시간째에, 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 피모벤단 최대 농도는 투여 후 1.08 ±0.72시간째에 관찰되어, 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 피모벤단 농도가 더 빠른 시간 내에 최고농도에 도달함을 확인하였다.
- 또한 반감기는 피모벤단 2.65 ±1.42시간, 펜톡시필린 0.29 ± 0.23시간으로 피모벤단의 경우 기존에 연구된 약물에 비해 더 긴 반감기를 가졌으며, 펜톡시필린은 기존 연구에 사용된 약물과 비슷한 수준의 시간을 52 노웅빈·송두원·강여림·박유진·유초롱·이종호·김기훈·정상희·강민희나타냈다.
- 무처치 개 혈장 시료에 각각의 농도로 첨가한 뒤 전처리하여 LC-MS/MS로 분석한 결과 상관계수(r2)가 0.99 이상으로 매우 양호한 직선성을 나타내었다.
- 반감기는 Vetmedin의 경우 대략 0.5시간, 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 경우 2.65 ± 1.42시간으로, 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제의 체내 피모벤단 배출시간이 Vetmedin 정제에 비해 더 소요되는 것을 확인되었다.
- 23시간으로 피모벤단의 경우 기존에 연구된 약물에 비해 더 긴 반감기를 가졌으며, 펜톡시필린은 기존 연구에 사용된 약물과 비슷한 수준의 시간을 52 노웅빈·송두원·강여림·박유진·유초롱·이종호·김기훈·정상희·강민희나타냈다. 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제는 심초음파 지표를 통한 평가 상 기존 연구에 사용된 약물과 유사한 지표(FS, LVIDs, PEP)에서 1시간 이후부터 유효적인 효과를 나타내었으며, 약물의 최대 효과는 투여 후 2시간에서 4시간에 관찰되었다. 본 연구 결과를 통해 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 개에서 적절하게 흡수되어 유효적으로 심장 기능 개선 효과를 가짐을 확인하였으며, 이는 추후 약물의 임상 적용 및 추가 연구에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제는 건강한 개에 경구투여시 혈장 내 최대 평균 농도가 피모벤단 2.83 ±1.50 ng/mL, 펜톡시필린 1184.33 ± 932.37 ng/mL로 두 성분 모두 유효한 수준의 농도를 나타냈으며, 최고 농도 도달시간은 피모벤단 1.08 ± 0.72시간, 펜톡시필린 0.29 ± 0.14시간으로 두 성분 모두 기존에 실시된 연구보다 빠른 시간 내에 최고 농도에 도달하였다.
- 본 연구에서 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제를 건강한 개에게 동일한 농도로 경구 투여하였을 때 혈장 내 펜톡시필린의 최대 평균 농도는 1.18 ± 0.93 μg/mL로 비슷한 수준을 나타내었고, 최대 농도 도달 시간은 17.4 ± 8.4분으로 더 빠른 시간내에 최고 농도에 도달하였으며, 반감기는 17.4 ± 13.8분으로 기존 연구와 비슷한 수준에서 약간 더 짧은 결과를 나타냈다.
- 본 연구의 경우, 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제를 0.25 mg/kg의 농도로 경구투여 시 투여 1시간 후부터 FS가 증가하고 LVIDs와 PEP가 감소하였으며, 약물의 최대 효과는 투여 후 약 2시간과 4시간 사이에 나타났다. 따라서 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 경구 투여 이후 기존의 논문과 유사한 심초음파 지표에서 효과를 나타냄을 확인하였다.
- 실험전 기본 심초음파 지표 검사 결과 대조군과 실험군 간에 유의적 차이가 없음을 확인하였다(Table 3).
- 약물의 최대 효과는 투여 후 2시간과 4시간 사이에 나타났으며, 실험군과 대조군 간의 유의적 차이(P <0.05)는 FS에서 2시간에서 4시간째에, LVIDs에서 1시간에서 3시간째에, 그리고 PEP에서 3시간과 4시간째에 관찰되었다.
- 정확성은 피모벤단의 QC에서 평균 회수율이 82.80-88.15% 이내 이었으며, 정밀성을 나타내는 변이계수는 0.53-0.90%로 확인되었고, 펜톡시필린의 QC에서 평균 회수율이 81.42-86.80% 이내 이었으며, 정밀성을 나타내는 변이계수는 0.52-1.26%로 확인되었다.
- 질량분석기는 0.1% formic acid가 혼합된 acetonitrile을 흘려줌으로써 최적화하였고, 피모벤단의 Product ion이 319.2m/z, 펜톡시필린의 Product ion이 181.1 m/z으로 확인되었다.
- 펜톡시필린의 약물동태를 분석한 결과, 모든 개체에서의 펜톡시필린의 혈중 최고농도도달시간(Tmax)은 0.29 ± 0.14시간이었으며, 혈중최고농도(Cmax)는 1184.33 ± 932.37 ng/mL으로나타났다.
후속연구
- 본 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제는 심초음파 지표를 통한 평가 상 기존 연구에 사용된 약물과 유사한 지표(FS, LVIDs, PEP)에서 1시간 이후부터 유효적인 효과를 나타내었으며, 약물의 최대 효과는 투여 후 2시간에서 4시간에 관찰되었다. 본 연구 결과를 통해 연구에 사용된 피모벤단-펜톡시필린 분말 합제가 개에서 적절하게 흡수되어 유효적으로 심장 기능 개선 효과를 가짐을 확인하였으며, 이는 추후 약물의 임상 적용 및 추가 연구에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구결과 이러한 합제를 이용한다면 반려견에서 흔히 발생하는 심장판막 변성에 의한 울혈성 심부전의 치료에 있어 혈관확장기능과 심근수축력 향상에 의해 심장의 기능을개선시켜 줄 수 있을 것으로 생각된다.
- 이러한 결과는 기존연구결과(4,8,12)와 유사한 결과를 보여주었다. 이러한 효과의 확인을 위해서는 동일 조건하에 동일한 제형의 피모벤단및 피모벤단-펜톡시필린 합제를 이용한 향후 대규모 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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