[국내논문]신수(BL23) 택사약침이 Cisplatin으로 유발된 급성신부전 백서에 미치는 영향 Effects of Alismatis Rhizoma Pharmacopuncture at BL23 on Cisplatin-Induced Acute Renal Failure in Rats원문보기
Objectives : This study was designed to investigate the effects of Alismatis Rhizoma (AR) pharmacopuncture at BL23 on acute renal failure induced by cisplatin. Methods : The Sprague-Dawley rats were divided into Normal group (no injection of cisplatin and no treatment), Control group (cisplatin inje...
Objectives : This study was designed to investigate the effects of Alismatis Rhizoma (AR) pharmacopuncture at BL23 on acute renal failure induced by cisplatin. Methods : The Sprague-Dawley rats were divided into Normal group (no injection of cisplatin and no treatment), Control group (cisplatin injection without treatment), Acu group (needling at BL23 after cisplatin injection), AR-PA1 group (treated with $0.3571mg/kg/20{\mu}l$ of AR pharmacopuncture at BL23 after cisplatin injection), and AR-PA2 group (treated with $1.7855mg/kg/20{\mu}l$ of AR pharmacopuncture at BL23 after cisplatin injection). Each treatment was given once daily for 8 days. Changes in body weight, kidney weight, tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$), interleukin-6 (IL-6), Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD), glutathione peroxidase (GPx), serum blood urea nitrogen (serum BUN), and serum creatinine were observed. Results : Body weight was significantly increased in AR-PA1 on $4^{th}$ and $6^{th}$ days and AR-PA2 on $2^{nd}$ day. $TNF-{\alpha}$ was significantly decreased in Acu, AR-PA1 and AR-PA2 groups. Cu-Zn SOD was significantly increased in AR-PA2 group. GPx was significantly increased in AR-PA1 and AR-PA2 groups. But kidney weight, IL-6, serum BUN and serum creatinine were not significantly changed in any groups compared to control group. Conclusions : In acute renal failure induced by cisplatin, AR pharmacopuncture has a mitigating effect on the inflammatory reaction related to the increase of $TNF-{\alpha}$ in the kidney tissue and a protective effect on the oxidative stress of the kidney tissue. However it is unlikely to restore the glomerular function or inhibit the renal swelling.
Objectives : This study was designed to investigate the effects of Alismatis Rhizoma (AR) pharmacopuncture at BL23 on acute renal failure induced by cisplatin. Methods : The Sprague-Dawley rats were divided into Normal group (no injection of cisplatin and no treatment), Control group (cisplatin injection without treatment), Acu group (needling at BL23 after cisplatin injection), AR-PA1 group (treated with $0.3571mg/kg/20{\mu}l$ of AR pharmacopuncture at BL23 after cisplatin injection), and AR-PA2 group (treated with $1.7855mg/kg/20{\mu}l$ of AR pharmacopuncture at BL23 after cisplatin injection). Each treatment was given once daily for 8 days. Changes in body weight, kidney weight, tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$), interleukin-6 (IL-6), Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD), glutathione peroxidase (GPx), serum blood urea nitrogen (serum BUN), and serum creatinine were observed. Results : Body weight was significantly increased in AR-PA1 on $4^{th}$ and $6^{th}$ days and AR-PA2 on $2^{nd}$ day. $TNF-{\alpha}$ was significantly decreased in Acu, AR-PA1 and AR-PA2 groups. Cu-Zn SOD was significantly increased in AR-PA2 group. GPx was significantly increased in AR-PA1 and AR-PA2 groups. But kidney weight, IL-6, serum BUN and serum creatinine were not significantly changed in any groups compared to control group. Conclusions : In acute renal failure induced by cisplatin, AR pharmacopuncture has a mitigating effect on the inflammatory reaction related to the increase of $TNF-{\alpha}$ in the kidney tissue and a protective effect on the oxidative stress of the kidney tissue. However it is unlikely to restore the glomerular function or inhibit the renal swelling.
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문제 정의
이에 신수(BL23) 澤瀉약침이 cisplatin으로 유발된 급성신부전에 미치는 영향을 알아보기 위해, 백서에 cisplatin을 주입하여 급성신부전을 유발시킨 후, 澤瀉약침을 신수(BL23) 상응 부위에 1회/1일 8일간 시술하고, 체중, 신장무게, tumor necrosis factoralpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), Cu-Zn superoxide dismutase (Cu-Zn SOD), glutathione peroxidase (GPx), serum BUN (serum blood urea nitrogen) 및 serum creatinine 변화를 관찰하여 다음과 같은 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
(2) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) analysis: 분리된 total RNA 5 μg과 DEPC-treated water, 2.5 μl Oligo (dT)를 RT premix (Bioneer, Korea)에 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Germany)를 이용하여 PCR 증폭을 위한 template로 50 μl cDNA를 합성하여 사용하였다.
1) Acute Renal Failure (ARF) 유발: 사육환경에서 적응시킨 후 cisplatin (Sigma, USA) 5 mg/kg을 saline에 녹여 복강에 1회 주사하여 ARF를 유발하였다. 유발 5시간 후부터 침자 및 약침을 시술하였다.
2) 군 분리: 실험군은 ARF을 유발하지 않고 무처치한 Normal군(n=5), ARF을 유발시킨 후 무처치한 Control군(n=5), ARF을 유발시킨 후 신수(BL23)에 자침한 Acu군(n=5), ARF을 유발시킨 후 신수(BL23)에 0.3571 mg/kg/20 μl의 농도로 澤瀉약침을 시술한 AR-PA1군(n=5), ARF을 유발시킨 후 신수(BL23)에 1.7855 mg/kg/20 μl의 농도로 澤瀉약침을 시술한 AR-PA2군(n=5)으로 나누었다.
4) 체중 및 신장 무게 측정: 체중은 전자저울(CAS, China)을 사용하여 실험기간 중 1회/2일 씩 동일 시간대에 개체별 무게를 측정하였으며, 실험 종료 후 좌측, 우측 신장을 적출하여 renal hilum에 위치한 신정맥 및 신동맥 등을 제거한 후 무게를 측정하였다.
5) 채혈 및 혈청학적 검사: 약침처치 종료 3일 후 심장 천자하여 혈액을 채취하였으며, 채혈에 의하여 얻어진 혈액에서 원심분리기(VS 6000CFI, Vision, Korea)를 이용하여 20분간 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 이를 이용하여 BUN (mg/dl),creatinine (mg/dl)등 혈청학적 검사(Dri-chem 4000i, Fujifilm,Japan)를 시행하였다.
Greenview nucleic acid gel stain (IO Rodeo, 1:10,000)를포함한 1.5% agarose gel상에서 위의 방법으로 증폭된 TNF-α,IL-6, Cu-Zn SOD, GPx의 DNA를 0.5x TBE buffer (80 mMTris-HCL, 80 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3)로 100 V에서 전기 영동시켜 관찰한 후 Image Station (Samsung, Korea)을이용하여 촬영하였고, Alphaease FC StandAlone Software (AlphaInnotech, U.S.A.)를 이용하여 측정하였다.
PCR temperature cycle은 cDNA의 증폭을 위하여 300초 동안 95°C에서 pre-denaturation, 40초 동안 94°C에서 melting, 40초 동안 55°C에서 annealing, 90초 동안 72°C에서 extension하는 과정을 34회 반복하여 수행하고, 마지막 cycle에서 600초 동안 72°C에서 extension단계를 거쳐 TNF-α 유전자증폭은 primer (senseprimer: 5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3', antisense primer: 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAAT-3'), IL-6 유전자증폭은 primer (senseprimer: 5'-TGCTGGTGACAACAACGGCC-3', antisense primer:5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3'), Cu-Zn SOD 유전자증폭은 primer (senseprimer: 5'-GCAGAAGGCAAGCGGTGAAC-3',antisense primer: 5'-TAGCAGGACAGCAGATGAGT-3'), glutathione peroxidase (GPx) 유전자증폭은 primer (senseprimer:5'-CTCTCCGCGGTGGCACAGT-3', antisense primer: 5'-CCACCACCGGGTCGGACTAC-3') 이용하여 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)에서 시행하였다.
. 그리하여 澤瀉약침이 이러한 신장조직의 산화적 스트레스에 대한 억제 효과도 있는지 확인하기 위해 Cu-Zn SOD, GPx의 변화를 알아보았다.
약침은 insulin syringe (31G×8 mm, BD, USA)을 사용하여 각각의 혈위에 20 μl를 주입하였다. 또한 Acu군은 신수(BL23)에 약침액을 시술하지 않고 insulin syringe만 자입하였다.
신수(BL23) 澤瀉약침이 급성신부전에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 백서에 cisplatin을 주입하여 급성신부전을 유발시킨 후,澤瀉약침을 신수(BL23) 상응 부위에 1일 1회씩 8일간 시술하고,체중, 신장무게, TNF-α, IL-6, Cu-Zn SOD, GPx, 혈청BUN 및 creatinine 변화를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
이를 통해 최종적으로 25 g의시료을 얻었다. 실험군에 따라 시료를 각각 생리식염수로 희석한 후, pH meter (Orion, USA)을 사용하여 산도를 pH 7로 조절하여 냉장 보관하였다가 시술시 사용하였다.
약침은 insulin syringe (31G×8 mm, BD, USA)을 사용하여 각각의 혈위에 20 μl를 주입하였다.
원심분리로 얻어진 상층액과 500 μl의 isopropanol (sigma, USA)을 첨가하여 5분 동안 실온상태에서 방치한 후 RNA pellet을 얻기 위해 8분간 4°C,14,000 rpm에서 원심분리하고, 원심분리로 생긴 pellet에 냉장 보관된 70% ethanol과 DEPC를 함께 넣고 5분간 4°C, 7,500 rpm에서 원심분리 후 pellet만 남기고 모두 제거하고, 남은 ethanol은 5분간 실온에 건조한 다음 DEPC-treated water에 녹여 spectrophotometer (Eppendorf, Germany)에서 OD260 값을 읽어 RNA의 순도 및 농도를 정량하였다.
1) Acute Renal Failure (ARF) 유발: 사육환경에서 적응시킨 후 cisplatin (Sigma, USA) 5 mg/kg을 saline에 녹여 복강에 1회 주사하여 ARF를 유발하였다. 유발 5시간 후부터 침자 및 약침을 시술하였다.
이러한 염증성 cytokine은 유도된 급성신부전 상태에서 활성도가 증가하므로38,39) 본 실험에서 IL-6과 TNF-α의 감소여부를 알아보았다.
이에 본 저자는 신수(BL23) 澤瀉약침이 cisplatin으로 유발된 급성신부전에 미치는 영향과 그 작용기전을 확인하기 위해, 급성신부전을 유발하지 않고 무처치한 Normal군, 급성신부전을 유발시킨후 무처치한 Control군, 급성신부전을 유발시킨 후 신수(BL23) 상응 부위에 자침 시술한 Acu군, 급성신부전을 유발시킨 후 신수(BL23) 상응 부위에 澤瀉약침을 각각 저농도(0.3571 mg/kg/20 μl) 및 고농도(1.7855 mg/kg/20 μl)로 시술한 AR-PA1군과 AR-PA2 군으로 나누고, 각 군의 체중, 신장무게, TNF-α, IL-6, Cu-Zn SOD,GPx, 혈청BUN, 혈청 creatinine 변화를 관찰하여 비교하였다.
침자 및 약침 처치는 ARF 유발 후 5 시간째부터 1회/일 간격으로 동일 시간대에 신수(BL23) 좌ㆍ우측에 총 8회 시술하였다. 약침은 insulin syringe (31G×8 mm, BD, USA)을 사용하여 각각의 혈위에 20 μl를 주입하였다.
대상 데이터
1) 동물: 약 160∼180 g 체중의 Sprague Dawley계의 백서를 항온항습(실내온도 24∼26°C , 습도 40∼60%) 환경의 사육장내에서 물과 고형사료(Pellet, GMO, 한국)를 충분히 공급하면서 실험실 환경에 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 동안 물과 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
)로 표시하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS (version 21, SPSS)를 이용하였으며, 비모수적 방법 Mann-Whitney U test를 시행하였다9). 실험군간의 통계적 유의성은 p 값이 0.
실험 성적은 평균값과 표준오차(mean±S.E.)로 표시하였다.
성능/효과
(1) Total RNA 분리: 채혈이 끝난 후 신장을 적출하여 신장 조직을 급속 냉동시켜 분석할 때까지 −70°C에서 보관하였다.
1. 체중변화를 관찰한 결과, Control군에 비해 澤瀉약침 시술군(AR-PA1군, AR-PA2군)에서 일부 유의한 증가를 보였다.
2. 신장무게는 Control군에 비해 모든 실험군에서 유의한 변화가 없었다.
3. TNF-α 변화를 관찰한 결과, Acu군, AR-PA1군, AR-PA2군 모두 Control군에 비해 유의하게 감소하였다.
4. IL-6 변화를 관찰한 결과, Control군에 비해 모든 실험군에서 유의한 변화가 없었다.
5. Cu-Zn SOD 변화를 관찰한 결과, AR-PA2군에서 Control군에 비해 유의하게 증가하였다.
6. GPx 변화를 관찰한 결과, 澤瀉약침 시술군(AR-PA1군,AR-PA2군)에서 Control군에 비해 유의하게 증가하였다.
7. 혈청 BUN, creatinine 변화를 관찰한 결과, Control군에 비해 모든 실험군에서 유의한 변화가 없었다.
Control군은 Normal군에 비해 우측신장무게가 유의하게 증가하였고(p＜0.05), 다른 모든 실험군에서는 control군에 비해 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 2).
Normal군에 비하여 control군에서 유의하게 증가하였으며(p＜0.01), Acu군(p＜0.01), AR-PA1군(p＜0.05), AR-PA2군(p＜0.05)은 Control군에 비해 유의한 감소를 보였다(Fig. 3).
Normal군에 비하여, Control군에서 유의하게 증가하였으며(p＜0.01), Control군에 비해 모든 실험군에서 유의한 변화를 보이지 않았다(Fig. 7).
TNF-α는 Normal군에 비하여 Control군에서 유의하게 증가하였고, Control군에 비하여 Acu군, AR-PA1군, AR-PA2군 모두 유의성 있게 감소하였으며, 특히 Acu군에서 가장 많이 감소하였다(Fig. 3).
澤瀉약침이 사구체기능 회복에 효과가 있는지 알아보기 위해 혈청 BUN, creatinine 수치를 관찰한 결과, BUN은 Normal군에 비하여 Control군에서 유의하게 증가하였으나, Control군에 비해Acu, AR-PA1, AR-PA2군에서 모두 유의한 변화가 없었고(Fig. 7),혈청 creatinine의 결과도 이와 같았다(Fig. 8). 즉 澤瀉약침은 급성신부전에서의 사구체기능 회복효과는 없는 것으로 보인다.
그 결과 Cu-Zn SOD는 Control군에 비해 AR-PA2군에서 유의한 증가를 보였으며(Fig. 5), 또한 GPx는 Control군에 비해 AR-PA1, AR-PA2 두 군에서 유의한 증가를 보였다(Fig. 6). 따라서 신수(BL23) 澤瀉약침이 신장조직의 산화적 스트레스를 방어하는 효능이 있다고 볼 수 있다.
그 결과 체중은 Normal군에 비하여 Control군은 모든 측정일에 유의하게 감소하였고, Control군에 비하여 AR-PA1군, AR-PA2군에서 체중 증가를 보였으며, 모든 측정일에 유의하지는 않았으나 부분적으로 유의한 증가를 보였다(Fig. 1). 반면 신장무게는 Normal군에 비하여 Control군은 우측신장무게의 유의한 증가를보였으나, Acu군, AR-PA1군, AR-PA2군에서 모두 유의한 변화가 없었다(Fig.
따라서 cisplatin으로 유발된 급성신부전에서 澤瀉약침은 신장조직에서의 TNF-α 증가와 관련한 염증반응 대한 완화효과 및 신장조직의 산화적 스트레스에 대한 방어효과는 있으나 사구체 기능의 회복이나, 신장종창의 억제 효과는 기대할 수 없는 것으로 사료된다.
1). 반면 신장무게는 Normal군에 비하여 Control군은 우측신장무게의 유의한 증가를보였으나, Acu군, AR-PA1군, AR-PA2군에서 모두 유의한 변화가 없었다(Fig. 2). 이는 신수(BL23) 澤瀉약침이 급성신부전으로 인한신장종창에는 영향을 미치지 않으며, cisplatin으로 인한 이차적인 체중감소에 대해서는 약간의 완화효과가 있다고 볼 수 있다.
이상의 결과를 요약하면, 신수(BL23) 澤瀉약침은 cisplatin으로 유발된 급성신부전 백서의 신장무게, BUN 및 creatinine, 그리고 IL-6에는 유의한 영향이 없었고, 백서의 체중변화에서는 일부에서만 유의한 증가를 보인 반면, TNF-α에서 유의한 감소를, Cu-Zn SOD, GPx의 유의한 증가를 나타내었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비핍뇨성 급성신부전이 증가하는 이유는?
급성신부전이 의심되는 가장 흔한 증상이 핍뇨인 반면, 최근에는 비핍뇨성 급성신부전이 증가하는 추세이다. 그 이유는 cisplatin 등의 항암제나 항생제, 방사선 조영제 등과 같은 신장독성 물질 때문에 발생하는 신부전이 증가하기 때문이다10).
신장독성 약물의 부작용은?
급성신부전(Acute renal failure, ARF)은 신장의 급격한 배설기능 저하로 인해 핍뇨 또는 무뇨를 나타내는 증후군이며 수분, 염분, 체내 BUN, creatinine의 급격한 상승이 나타난다1). 신장독성 약물의 사용은 급성신부전의 흔한 원인 중 하나로2), 그 중 하나인 cisplatin은 단독 혹은 다른 항암제와의 병용으로 난소암, 고환암, 방광암, 두경부암, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 신경모세포종 등 가장 광범위하게 쓰이는 항암제이나, 치료받은 사람의 25%에서 신장기능장애가 나타난다3).
급성신부전이란?
급성신부전(Acute renal failure, ARF)은 신장의 급격한 배설기능 저하로 인해 핍뇨 또는 무뇨를 나타내는 증후군이며 수분, 염분, 체내 BUN, creatinine의 급격한 상승이 나타난다1). 신장독성 약물의 사용은 급성신부전의 흔한 원인 중 하나로2), 그 중 하나인 cisplatin은 단독 혹은 다른 항암제와의 병용으로 난소암, 고환암, 방광암, 두경부암, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 신경모세포종 등 가장 광범위하게 쓰이는 항암제이나, 치료받은 사람의 25%에서 신장기능장애가 나타난다3).
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