[논문]Agarase를 생산하는 Persicobacter sp. DH-3의 분리 및 β-agarase의 특성

허다혜; 이동근; 이상현

doi:10.5352/jls.2019.29.2.158

Agarase를 생산하는 Persicobacter sp. DH-3의 분리 및 β-agarase의 특성
Isolation of an Agarase-producing Persicobacter sp. DH-3 and Characterization of its β-agarase 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.2 = no.226, 2019년, pp.158 - 163

허다혜 (신라대학교 일반대학원 그린화학융합공학과) , 이동근 (신라대학교 제약공학과) , 이상현 (신라대학교 일반대학원 그린화학융합공학과)

초록
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이 연구의 목적은 agarase를 생산하는 새로운 해양 박테리아를 분리하는 것이다. Agarase는 agarose를 가수분해하여 다양한 생리활성을 가지는 agarooligosaccharides 또는 neoagarooligosaccharides를 생성할 수 있다. 전라남도의 여수연안에서 채취한 해수로부터 DH-3 균주를 분리하였다. DH-3 균주는 16S rDNA 서열분석을 통하여 Persicobacter sp. DH-3로 명명하였다. 세포 외로 분비된 효소는 Persicobacter sp. DH-3의 배양액으로부터 얻었으며, 특성연구에 사용하였다. 20, 30, 40, 50, 60 및 $70^{\circ}C$에서의 온도별 상대활성은 각각 50, 55, 70, 100, 90 및 50%였다. pH 5, 6, 7 및 8에서의 pH별 상대활성은 각각 75, 100, 90, 75%였다. 본 효소는 20 mM Tris-HCl 완충액에서 pH 6.0 및 $50^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었다. 본 효소는 한천이 액체상태로 존재하는 $50^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었으므로 산업적으로 유용한 효소로 판단된다. 본 효소는 20, 30 및 $40^{\circ}C$에서 2시간 동안 열처리하여도 80% 이상의 잔존활성을 보였다. TLC 분석결과, Persicobacter sp. DH-3 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarohexaose와 neoagarotetraose를 생성하였으므로 ${\beta}$-agarase로 확인되었다. Zymogram 분석결과, Persicobacter sp. DH-3는 적어도 45, 70 및 140 kDa 크기의 3종류 이상의 한천분해효소를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로, Persicobacter sp. DH-3 유래 agarase는 기능성을 가진 neoagarooligosaccharides의 생산에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to isolate a new marine agarase-producing bacterium. Agarase can hydrolyze agar and agarose to produce agarooligosaccharides or neoagarooligosaccharides, which possess many physiological functions. Strain DH-3 was isolated from seawater collected from the coast of Yeosu at Jeollanam province, Korea. A 16S rDNA sequence analysis showed this strain to be Persicobacter sp. DH-3. Extracellular agarase was prepared from culture media of Persicobacter sp. DH-3 and used for characterization. Relative activities at 20, 30, 40, 50, 60, and $70^{\circ}C$ were 50, 55, 70, 100, 90, and 50%, respectively. Relative activities at pH 5, 6, 7, and 8 were 75, 100, 90, and 75%, respectively. The enzyme showed maximum activity at $50^{\circ}C$ in a 20 mM Tris-HCl buffer at pH 6. This enzyme could be useful, as agar is in liquid state at $50^{\circ}C$. Agarase activities were maintained at 80% or more for 2 hr at 20, 30, and $40^{\circ}C$. Thin layer chromatography analysis suggested that Persicobacter sp. DH-3 produced extracellular ${\beta}$-agarases as it hydrolyzed agarose to produce neoagarohexaose and neoagarotetraose. In addition, zymogram analysis confirmed that Persicobacter sp. DH-3 produces at least three agar-degrading enzymes with molecular weights of 45, 70, and 140 kDa. Therefore, it is expected that agarases from Persicobacter sp. DH-3 could be used to produce functional neoagarooligosaccharides.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Phylogenetic tree based on almost complete 16S rDNA sequence comparing strain DH-3 with other bacteria. The numbers at the branch are bootstrap values and numbers in parenthesis are accession numbers at NCBI.
그림 Fig. 2. The growth curve (□) of Persicobacter sp. DH-3 and the production of agarase (■) in the presence of 0.2% (w/v) agar. The highest level of agarase was reached at the period of lag phase.
그림 Fig. 3. Effects of reaction temperatures on agarase activities. The reactions were carried out at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min.
그림 Fig. 4. Effects of pHs on the agarase activities. 20 mM Tris-HCl buffer (pH 5.0-8.0) and GTA buffer (pH 8.0-9.0) were used. The reactions were carried out at 50℃ in 1 ml of corresponding buffer and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min.
그림 Fig. 5. Remaining activities of agarase after heat treatments for defined times. The enzyme solutions were pre-incubated at 20 (■), 30 (◆), 40 (▼), 50 (●), 60 (○) and 70℃ (□) for 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 hr. The reactions were then carried out at 50℃ in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.5 ml of heat-treated enzyme solution for 30 min.
그림 Fig. 6. Zymogram analysis of agarases. The molecular masses of the enzymes were 45, 70 and 140 kDa. (Lane M size markers; lane E, agarases).
그림 Fig. 7. TLC analysis of the hydrolyzed products of agarose by agarase. The reactions were carried out at 50℃ in Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% (w/v) agar and 0.5 ml of enzyme solution for 5, 10, 15, 20, 25 and 30 min. The reaction mixtures were developed by TLC. (G, Dgalactose; NA, neoagarooligosaccharides; NA2, neoagarobiose; NA4, neoagarotetraose; NA6, neoagarohexaose).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 한천분해능을 가진 보고되지 않은 새로운 해양세균을 국내연안에서 분리하여 동정하였으며, 분리한 세균이 생산하는 한천분해효소의 특성을 검토하여 산업적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하고자 하였다.

제안 방법

멸균한 백금이를 사용해 Marine broth 2216 고체배지에 함몰을 나타내는 균체 (colony)를 새로운 Marine broth 2216 고체배지에 순수분리하여 한천분해활성을 가지는 균주를 선별하였고, 이 균주를 DH-3 균주로 명명하였다. DH-3 균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 NCBI의 Blast 검색하여 다른 균주와의 유사도를 확인하여 균주 동정에 사용하였으며, Clustal 프로그램(ClustalW2)을 통해 다중염기 배열(multiple alignment)을 실시하고 MEGA 7.
새로운 agarase를 생산하는 균주를 얻기 위해 전라남도 여수 연안의 해수를 시료액으로 사용했으며, 시료액을 멸균된 증류수로 희석하여 Marine broth 2216 (Difco, Detroit, USA) 고체배지에 도말하여 27℃에서 배양하였다. 멸균한 백금이를 사용해 Marine broth 2216 고체배지에 함몰을 나타내는 균체 (colony)를 새로운 Marine broth 2216 고체배지에 순수분리하여 한천분해활성을 가지는 균주를 선별하였고, 이 균주를 DH-3 균주로 명명하였다. DH-3 균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열을 분석하였다.
반응이 끝난 후 루골용액 (Lugol’s solution)을 겔에 분사하여 agarase 활성을 나타내는 단백질들의 위치를 확인하였다.
2% (w/v) agar가 첨가된 Marine broth 2216 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크에 배양액을 접종하고 27℃, 250 rpm에서 7일동안 진탕배양하였다. 진탕배양하면서 24시간 마다 배양액의 일부를 채취하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성 측정에 이용하였다. 균주의 생육 현황은 흡광도 600 nm에서 측정한 광학밀도로 결정하였다.
효소액을 이용하여 한천의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 표준기질용액 1 ml에 효소액 0.5 ml를 혼합하여 50℃에서 5, 10, 15, 20, 25, 30분간 반응시킨 후 Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석하였다. n-Butanol/acetic acid/H₂O (2/1/1 (v/v/v)) 용액을 이용해 전개시켰으며, 10% H₂SO₄ 로 가시화시켰다.
한천분해 효소의 활성은 1분당 1 μmole의 galactose를 생산해 내는 효소의 양을 1 unit로 정의하였고 galactose를 이용해 표준적정곡선을 작성하였다.
한천분해효소의 pH에 따른 활성을 측정하기 위해 0.2% (w/v)의 한천을 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 5.0-8.0) 및 20 mM GTA (pH 8.0-9.0) 완충용액을 사용하여 50℃에서 각 pH에 따른 효소활성을 측정하였다.
0) 완충용액을 이용하였다. 효소액 0.5 ml와 표준기질용액 1 ml를 혼합하여 20, 30, 40, 50, 60, 70℃의 온도 에서 효소액의 활성을 측정하였다.
효소액 0.5 ml을 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에서 각 0.5, 1, 1.5, 2시간 열처리한 후, 표준기질용액 1 ml와 혼합하여 50℃에서 30분간 반응시켰으며, 열처리하지 않은 효소액의 활성과 비교 하였다.
효소액에 포함되어 있는 agarase의 분자량을 확인하기 위해 0.1% agarose (LMP, Promega, USA)를 포함하는 12.5% (w/v) polyacrylamide gel에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 효소액의 전기영동이 끝난 후에 SDS를 제거하기 위하여 0.
효소액을 이용하여 한천의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 표준기질용액 1 ml에 효소액 0.

대상 데이터

Marine broth 2216 고체배지에서 한천을 분해하는 균주를 선별하였다. 분리된 균주의 16S rDNA 염기서열을 비교한 결과, Persicobacter sp.
05% (w/v) tryptone이 존재할 때에는 한천이 없으면 agarase 활성이 거의 없었다. 본 연구에 사용된 Marine broth 2216 배지에는 peptone이 0.5% (w/v), yeast extract가 0.1% (w/v) 함유되어 있고 나머지는 무기이온들로 조성되어 있다. 본 연구에서 한천분해효소의 활성이 생장곡선과 비례하는 양상을 보인 것은 세균생장의 단백질원으로 사용되는 peptone과 yeast extract 의 전체농도가 Persicobacter sp.
새로운 agarase를 생산하는 균주를 얻기 위해 전라남도 여수 연안의 해수를 시료액으로 사용했으며, 시료액을 멸균된 증류수로 희석하여 Marine broth 2216 (Difco, Detroit, USA) 고체배지에 도말하여 27℃에서 배양하였다. 멸균한 백금이를 사용해 Marine broth 2216 고체배지에 함몰을 나타내는 균체 (colony)를 새로운 Marine broth 2216 고체배지에 순수분리하여 한천분해활성을 가지는 균주를 선별하였고, 이 균주를 DH-3 균주로 명명하였다.
표준기질용액으로 0.2% (w/v)의 한천을 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 이용하였다. 효소액 0.
n-Butanol/acetic acid/H₂O (2/1/1 (v/v/v)) 용액을 이용해 전개시켰으며, 10% H₂SO₄ 로 가시화시켰다. 표준물질로는 D-galactose (ACROS, USA) 및 neoagarooligosaccharide [4]를 사용하였다.

데이터처리

DH-3 균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 NCBI의 Blast 검색하여 다른 균주와의 유사도를 확인하여 균주 동정에 사용하였으며, Clustal 프로그램(ClustalW2)을 통해 다중염기 배열(multiple alignment)을 실시하고 MEGA 7.0.26 프로그램의 Neighbor-joining method와 bootstrap method (n=1,000)로 분석한 후 계통분류학적 위치를 파악하였다.

이론/모형

한천분해효소의 활성측정은 DNS법을 사용해 측정하였다[6]. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법으로 환원당을 측정하는 방법이며, DNS 시약은 NaOH 13.

성능/효과

6에 나타내었다. 0.1% (w/v) agarose를 포함한 12.5% (w/v) polyacrylamide gel에서 전기영동하여 140 kDa, 70 kDa, 45 kDa의 분자량을 나타내는 3개의 한천분해효소가 확인되었다. Persicobacter sp.
0) 완충용액으로 나타났다. 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액에서의 활성을 100%로 하였을 때, pH 5, 7, 8에서도 75% 이상의 활성을 보였다. pH 6에서 최적활성을 나타내는 한천분해효소를 생성하는 균주는 Maribactersp.
Persicobacter sp. CCB-QB2 [2] 균주는 배지에 0.5% (w/v) tryptone이 존재할 때에는 한천의 존재유무와 상관없이 agarase 활성이 생장에 비례하는 양상을 보였고, 배지에 0.05% (w/v) tryptone이 존재할 때에는 한천이 없으면 agarase 활성이 거의 없었다. 본 연구에 사용된 Marine broth 2216 배지에는 peptone이 0.
분리된 균주의 16S rDNA 염기서열을 비교한 결과, Persicobacter sp. CCB-QB2 [2] 및 Persicobacter psychrovividus NBRC 101262와 98%의 높은 유사성을 나타내었다. 따라서 분리한 균주를 Persicobacteraceae과(Family)의 Persicobacter 속(Genus) 균주에 속하는 Persicobacter sp.
이들 균주들에 비해 Persicobacter sp. DH-3가 생산하는 한천분해효소의 최적 활성 온도가 높은 것을 알 수 있었다.
DH-3의 한천분해효소는 neoagarohexaose와 neoagarotetraose를 생산하는 것으로 보아 β-agarase임을 알 수 있었다.
50℃ 이상의 온도에서는 30분간 열처리하면 활성을 현저히 잃어버리므로 Persicobacter sp. DH-3의 한천분해효소는 내열성을 가지고 있지 않은 것을 확인할 수 있었다. 다른 균주의 한천분해효소의 열안정성은 Simiduia sp.
DH-3의 한천분해 활성은 1일째보다 2일째가 높았으며, 2일째부터 6일째까지는 오차범위 내에서 비슷하였다. 한천분해 효소의 활성은 균주 생장곡선의 지체기까지 증가되는 것으로 판단되었다.
3에 나타내었다. 효소액이 한천분해 최적활성을 보이는 온도는 50℃이었고, 50℃에서의 활성을 100%로 하였을 때, 60℃에서도 90%의 상대활성을 보였으므로 비교적 높은 온도에서 최적활성을 보이는 agarase로 판단되었다. 다른 균주의 한천분해효소의 최적 온도는 Maribacter sp.

후속연구

국내에서는 생산량이 수 천 톤에 달하지만 일부만 사용되고 대부분의 한천은 방치되고 있다[7, 11]. 방치되고 있는 한천을 이용하여 고부가가치 물질을 생산하면 생산 어민의 소득증대와 수산 경제 발전향상에 이바지할 수 있을 것이다. 한편 한천의 분해로 생성되는 올리고당은 생리활성이 높아 화장품, 의약품, 식품생산에 사용되고 있고 보습, 미백, 세균의 생장 억제와 대식세포 활성화와 같은 유용한 기능을 나타낸다[5, 11].

참고문헌 (12)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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