[논문]클로로필을 제거한 영하구기엽 에탄올 추출물의 항산화 활성

김지은; 배수미; 남유리; 배은영; 이선영

doi:10.4163/jnh.2019.52.1.26

[국내논문] 클로로필을 제거한 영하구기엽 에탄올 추출물의 항산화 활성
Antioxidant activity of ethanol extract of Lycium barbarum's leaf with removal of chlorophyll 원문보기 논문타임라인

Journal of nutrition and health, v.52 no.1, 2019년, pp.26 - 35

김지은 (충남대학교 식품영양학과) , 배수미 (충남대학교 식품영양학과) , 남유리 (충남대학교 식품영양학과) , 배은영 (충남대학교 식품영양학과) , 이선영 (충남대학교 식품영양학과)

초록
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본 연구에서는 구기엽의 항산화 활성을 확인하고자 50%, 70%, 100% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거한 시료를 포함하여 총 4종 시료의 항산화 활성을 비교하였다. 항산화능을 측정하기 위하여 총 폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS radicals 소거능, FRAP assay를 통해 시료의 항산화능을 평가하였다. 또한 $H_2O_2$처리로 산화적 스트레스를 유발한 HepG2세포주에서 추출물 들이 세포보호 효과를 나타낼 수 있는지 알아보고자 ROS 생성, DNA fragmention, 세포의 항산화효소활성 (SOD와 catalase)을 측정하였다. 연구결과, 총 폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS radicals 소거능, 그리고 FRAP value에서 모두 추출용매의 알코올 농도가 높을수록 증가하였고 클로로필 제거 시료가 제거 전 시료에 비하여 월등히 높았다(p < 0.05). HepG2세포에서 세포독성을 확인한 결과 모든 시료에서 $1,000{\mu}g/mL$까지 세포독성을 유발하지 않았다. 모든 추출물들은 $31.3{\mu}g/mL$ 농도부터 $H_2O_2$에 의해 증가한 ROS생성량을 농도 의존적으로 감소시키는 효과를 보였다 (p < 0.05). 모든 추출물은 $250{\mu}g/mL$의 농도로 배양액에 처리하였을 때 세포의 DNA 손상을 억제하는 효과를 보여주었다 (p < 0.05). 또한 $H_2O_2$처리한 세포에 비하여 추출물들을 함께 처리한 세포군의 SOD와 catalase 활성은 정상세포과 유사한 수준으로 강력한 보호효과를 보여주었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 구기엽 에탄올 추출물들은 항산화능이 높으며 고농도까지 세포독성을 보이지 않고 $H_2O_2$에 의해 손상된 간세포를 보호할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 클로로필 제거구기엽 에탄올 추출물은 항산화능이 높고 세포독성과 세포보호 효과가 클로로필 제거전 구기엽 에탄올 추출물과 유사하게 나타나 건강기능식품이나 화장품의 소재로 활용하기에 적절한 소재로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: The aim of this study was to estimate the antioxidant activities of 50%, 70%, and 100% ethanol extracts of Lycium barbarum leaf and chlorophyll removal extract. Methods: The antioxidant activities were estimated by measuring total polyphenol content and by assays of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfate) (ABTS) radical scavenging activities and ferric reducing antioxidant power (FRAP). In addition, reactive oxygen species (ROS) production, DNA fragmentation, and antioxidant enzyme (superoxide dismutase and catalase) activities of the extracts were measured in hydrogen peroxide ($H_2O_2$)-stressed HepG2 cells. Results: The total polyphenol content, DPPH and ABTS radical scavenging activities, and FRAP value of the extracts increased in an ethanol concentration-dependent manner. The antioxidant activities of the chlorophyll-removal extracts were much higher than those of the chlorophyll-containing extracts. Cytotoxicity was not observed in HepG2 cells with extracts up to $1,000{\mu}g/mL$. All extracts inhibited ROS production in a concentration-dependent manner from $31.3{\mu}g/mL$ and inhibited DNA damage at $250{\mu}g/mL$. The SOD and catalase activities of cell lines treated with the extracts and $H_2O_2$ were similar to those of normal cells, indicating a strong protective effect. Conclusion: Lycium barbarum leaf extracts had high antioxidant activities and protected $H_2O_2$-stressed HepG2 cells. Since the chlorophyll-removal extract exhibited higher antioxidant activities than the chlorophyll-containing ones and the cytoprotective effect was similar, chlorophyll removal extract of Lycium barbarum leaf could be developed as ingredients of functional food and cosmetics.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

HepG2 세포에서 구기엽 추출물들의 생리활성을 보기 위하여 선행연구로 세포에 대한 구기엽 추출물들의 안전성을 검토하였고 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. LL50, LL70, LL100, LL100 Ch- 등 구기엽 추출물들은 모두 1,000 μg/mL의 농도까지 세포 생존율에 영향을 주지 않아 독성이 없는 것으로 확인되었다.
간은 인체에서 해독 작용을 하는 기관으로 ROS에 의한 공격을 가장 많이 받는 기관 중 하나로 알려져 있다. 따라서 인간 간암세포주인 HepG2 cell을 대상으로 추출물들의 항산화능을 검토하였다. 본 연구에 사용한 추출물들은 모두 에탄올로 추출하였고 실험 결과 1,000 μg/mL까지 세포증식에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
본 연구는 구기자나무의 부가가치를 높이기 위하여 구기엽의 활용을 증대시키기 위한 연구로 농도를 달리한 에탄올로 추출한 구기엽 시료들의 항산화 활성을 측정하여 비교검토하고 그 중 활성이 높았던 에탄올 추출물로부터 클로로필을 제거한 구기엽 시료의 항산화 활성을 측정하여 비교 검토함으로서 건강기능식품이나 화장품 소재로의 활용가능성을 검토하고자 하였다.
본 연구에서는 추출물의 항산화능을 확인한 후 세포수준에서 항산화능이 발현되는지를 살펴 보고자 하였다. 간은 인체에서 해독 작용을 하는 기관으로 ROS에 의한 공격을 가장 많이 받는 기관 중 하나로 알려져 있다.

제안 방법

항산화 활성 중 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성은 Blois법 [20]을 이용하여 측정하였다. 1.25, 2.5, 5, 10 mg/mL의 농도로 희석한 시료에 0.15 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, SigmaAldrich Co.) 용액을 섞어 가하여 암실에서 정치 후, 517 nm에서 ELISA reader (microplate absorbance spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfate) (ABTS) radical 소거활성 측정은 Fellegrini 등 [21]의 방법으로 측정하였다.
96 well plate에 세포용액을 106cells/mL의 농도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 배양액에 0, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL 농도로 구기엽추출물을 24시간 동안 처리하였다.
, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조회사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하 였다. Catalase 활성은 균질화한 세포액을 1,000 g에서 15분간 원심 분리하고 상등액을 취하여 catalase activity colorimetric/flourometric assay kit (Biovision Inc., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조회사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다.
DNA는 20 μg/mL ethidium bromide 로 염색하여 light microscopes (DM 2000, Leica Co., Wetamar, German)을 이용하여 관찰하였다.
)를 측정하였다. DPPH radical 소거활성과 ABTS radical 소거활성을 농도별로 산출하여 IC₅₀값을 구하였다. 양성대조군 시료로는 ascorbic acid를 사용하였다.
HepG2세포에 구기엽 추출물을 처리하였을 때 reactive oxygen species (ROS) 생성에 미치는 영향을 보기 위하여 96 well plate에 5×105cells/mL의 농도로 세포 용액를 분주하여 37°C, 5% CO2배양기에서 24시간 동안 배양한 후 0, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL 농도의 구기엽 추출물을 20시간 처리하였다.
1 mg/mL phenylmethane sulfonyl fluoride) 200 μL를 넣은 후 3분간 초음파 처리하여 균질화하였다. SOD활성은 세포액을 14,000 g에서 5분간 원심 분리한 후 상등액을 취하여 SOD activity assay kit (Biovision Inc., Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조회사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하 였다. Catalase 활성은 균질화한 세포액을 1,000 g에서 15분간 원심 분리하고 상등액을 취하여 catalase activity colorimetric/flourometric assay kit (Biovision Inc.
구기엽 추출물 처리에 따른 세포 내 항산화효소의 활성을 보기 위하여 superoxide dimutase (SOD)와 catalase활성을 측정하였다. Well plate에 10⁶cells/mL농도의 세포용액을 분주하여 37°C, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, 구기엽추출물들을 500 μg/mL 농도로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
구기엽 추출물의 HepG2 세포에 대한 안전성을 측정하기 위하여 water-soluble tetrazolium salts (WST)를 이용한 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 세포용액을 10⁶cells/mL의 농도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 배양액에 0, 15.
구기자나무의 부가가치를 높이고자 구기엽의 활용가능성을 검토하고 또한 구기엽을 소재화할 때 일부 바람직하지 않은 영향을 보이고 있는 엽록소를 제거한 후 생리활성 들이 유지되는지를 검토하고자 각 추출물들의 항산화와 효능을 우선 검토하였다. 그 결과 전반적으로 50%나 70% 에탄올 추출물에 비하여 100% 에탄올 추출물의 항산화 효능이 높았으며 클로로필을 제거한 시료가 제거 전 시료에 비하여 항산화 효능이 높았다.
)을 섞어 색소를 침전시켰다. 그 후 charcoal column과 silica gel column chromatography를 사용하여 클로로필을 제거하였다.
농도별로 희석한 시료 10μL에 ABTS solution 200μL를 혼합하여 암소에서 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 측정하였다.
또한 H2O2처리로 산화적 스트레스를 유발한 HepG2세포주에서 추출물 들이 세포보호 효과를 나타낼 수 있는지 알아보고자 ROS 생성, DNA fragmention, 세포의 항산화효소활성 (SOD와 22) catalase)을 측정하였다.
배양 후 EZ-Cytox WST assay reagent (Daeil Lab Service CO., Ltd., Seoul, Korea)를 10μL씩 첨가하고 2시간 후에 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
배양 후 phosphate-buffered saline (PBS)으로 1회 세척하고 20 μM의 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA; Sigma-Aldrich Co.)를 각 well에 100 μL 첨가한 다음 30분 후에 excitation 485 nm, emission 535 nm의 조건에서 DCF-DA fluorescence를 Beckman Coulter DTX 500 Multimode Detector (Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 측정하였다.
, Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 -20°C에서 냉동보관하면서 실험에 사용하였다. 본 연구에 사용된 구기엽 추출물의 총 폴리페놀 함량 및 항산화활성을 측정하여 그 활성이 가장 높게 측정된 구기엽 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거하고 항산화능을 평가하였다. 클로로필 제거 방법을 간략하면 다음과 같다.
본 연구에서는 구기엽의 항산화 활성을 확인하고자 50%, 70%, 100% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거한 시료를 포함하여 총 4종 시료의 항산화 활성을 비교하였다. 항산화능을 측정하기 위하여 총폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS radicals 소거능, FRAP assay를 통해 시료의 항산화능을 평가하였다.
, Wetamar, German)을 이용하여 관찰하였다. 슬라이드 당 DNA를 50개씩 읽었으며 Komet 5.5 image analyzing system (Andor Co., Nottingham, UK)으로 분석하였다.
실험실에서 건조 잎을 100g씩 계량하여 50%, 70%, 100% 에탄올을 중량의 8배수가 되도록 첨가하고 3시간 동안 70°C에서 3회 반복 교반 추출하였다.
위의 ROS 생성 억제 효과 실험 결과, 모든 군에서 추출물의 농도 62.5 μg/mL부터 유의한 차이를 보였으므로 62.5 μg/mL농도와 최고 농도인 1,000 μ g/mL의 중간 값인 250 μg/mL로 세포에 추출물을 처리하여 DNA 손상에 미치는 효과를 검토하였다.
본 연구에서는 구기엽의 항산화 활성을 확인하고자 50%, 70%, 100% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거한 시료를 포함하여 총 4종 시료의 항산화 활성을 비교하였다. 항산화능을 측정하기 위하여 총폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS radicals 소거능, FRAP assay를 통해 시료의 항산화능을 평가하였다. 또한 H₂O₂처리로 산화적 스트레스를 유발한 HepG2세포주에서 추출물 들이 세포보호 효과를 나타낼 수 있는지 알아보고자 ROS 생성, DNA fragmention, 세포의 항산화효소활성 (SOD와 22) catalase)을 측정하였다.

대상 데이터

), 20 mM FeCl3 · 6H2O (Sigma-Aldrich Co.)를 각각 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP reagent를 제조하였다.
2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfate) (ABTS) radical 소거활성 측정은 Fellegrini 등 [21]의 방법으로 측정하였다. ABTS 용액은 7 mM ABTS (Sigma-Aldrich Co.)-140 mM K₂S₂O₈(Sigma-Aldrich Co.) 혼합용액을 absolute ethanol과 1:88 비율로 섞어 제조하였다. 농도별로 희석한 시료 10μL에 ABTS solution 200μL를 혼합하여 암소에서 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도 (Bio-Rad Laboratories, Inc.
HepG2세포는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 1% penicillin- streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Victoria, Australia)을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco)을 사용하여 37°C, 5% CO2조건의 배양기 (BB15, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
구기엽 시료는 중국 Ningxia 지역에서 재배된 Lycium barbarum의 어린 잎을 3 ~ 4월에 채취하여 자연 건조한 것을 중국의 Zaokang Goji Berry Inc. (Yinchuan, Ningxia, China)로부터 구입하여 사용하였다. 실험실에서 건조 잎을 100g씩 계량하여 50%, 70%, 100% 에탄올을 중량의 8배수가 되도록 첨가하고 3시간 동안 70°C에서 3회 반복 교반 추출하였다.
DPPH radical 소거활성과 ABTS radical 소거활성을 농도별로 산출하여 IC₅₀값을 구하였다. 양성대조군 시료로는 ascorbic acid를 사용하였다. 추출물의 FRAP에 의한 환원력 실험은 Benzie와 Strain법 [22]으로 측정하였다.
) 150 μL 를 가해 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. 항산화 활성 중 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성은 Blois법 [20]을 이용하여 측정하였다.

데이터처리

3) Different superscripts (a-b) in a column indicate significant differences at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.
4) Different superscripts (a-c) in a column indicate significant differences at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.
SPSS (SPSS Ststistics 24, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 통계처리를 하였으며, 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
각 군간의 평균값의 차이에 대한 유의성 검증은 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA) 과 사후검증으로 Duncan’s multiple range test를 이용하여 α = 0.05 수준에서 실시하였다.

이론/모형

2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfate) (ABTS) radical 소거활성 측정은 Fellegrini 등 [21]의 방법으로 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis방법 [19]으로 측정하였다. 2N Folin-Ciocalteu’s phenol regent (Sigma-Aldrich Co.
양성대조군 시료로는 ascorbic acid를 사용하였다. 추출물의 FRAP에 의한 환원력 실험은 Benzie와 Strain법 [22]으로 측정하였다. Sodium acetate buffer (pH 3.
)를 사용하였다. 항산화 활성 중 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성은 Blois법 [20]을 이용하여 측정하였다. 1.

성능/효과

9% 제거된 것으로 확인되었다 [Table 1]. 100% 에탄올 추출물의 수율은 20.5%이었으며, 클로로필 제거 100% 에탄올 추출물의 수율은 16.4%로 클로로필을 제거로 인해 수율이 20% 감소하였다. 또한 50%, 70%, 100%의 에탄올로 추출한 구기엽 추출물 (LL50, LL70, LL100)과 구기엽 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거한 시료 (LL100 Ch-)의 폴리페놀 함량을 측정한 결과, LL100의 총 폴리페놀 함량은 140.
ABTS radical 소거활성을 측정한 결과 LL50, LL70, LL100군들의 IC50값은 각각 0.55 ± 0.01 mg/mL, 0.49 ± 0.00 mg/mL, 0.27 ± 0.00 mg/mL이었다.
또한 세포가 분비하는 항산화 효소인 SOD와 catalase를 측정한 결과, H₂O₂로 산화적 스트레스를 준 세포에서는 현저하게 효소활성이 저하되었지만 추출물들을 처리한 세포 군에서는 SOD 활성이 정상세포군의 수준으로 증가하여 강력한 보호효과를 보여주었다. Catalase 활성도 유사한 결과를 보여주었으나 LL50과 LL70군에서는 정상세포군에 비하여 catalase의 활성이 더 높아졌다. 항산화 효소 중의 하나인 SOD는 산화적 스트레스에 의해 세포 내에서 과잉 생성되는 O₂^-를 H₂O₂와 산소로 변화시키며, catalase 는 H₂O₂를 산소와 물로 변환시키는 역할을 통해 세포 내 radical을 소거함으로써 산화적 스트레스를 보호하는 것으로 알려져 있다 [39].
Catalase 활성을 측정한 결과, 정상대 조군 (271.18 ± 19.35 nmol/min/mL)에 비해 H2O2 단독처리군의 catalase 활성 (191.51 ± 26.98 nmol/min/mL)이 29% 낮아졌으며, 구기엽 추출물을 함께 처리한 모든 군에서 catalase 활성이 유의하게 높아졌다 (LL50, LL70, LL100, LL100 Ch- 군 각각 325.18 ± 32.27 nmol/min/mL, 324.51 ± 35.60 nmol/min/mL, 292.29 ± 22.72 nmol/min/mL, 252.07 ± 41.22 nmol/min/mL, p < 0.05).
DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과, LL50, LL70, LL100군들의 IC50값은 각각 1.01 ± 0.01 mg/mL, 0.82 ± 0.03 mg/mL, 0.34 ± 0.02 mg/mL였고 LL100 Ch-군의 IC 50값은 0.14 ± 0.05 mg/mL로 추출용매의 알코올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거능은 높아졌으며 클로로필을 제거한 시료의 DPPH radical 소거활성은 클로로필 제거 하지 않은 시료에 비해 2배 이상 높았다.
3% 감소하였다. H₂O₂ 단독처리군에 비해 LL100군의 tail DNA, tail length, tail moment는 각각 42%, 29.2%, 49.5% 감소하였으며 LL100 Ch-군의 경우 각각 23.5%, 31.6%, 55% 감소하였다. 그러나 추출 용매의 농도에 따른 차이나 LL100 군과 LL100 Ch-군간의 차이는 관찰되지 않았다.
2에나타내었다. H₂O₂를 처리하여 산화 스트레스를 유도한 세포는 정상세포에 비해 ROS 생성량이 14% 증가하였다. LL50, LL70, LL100, LL100 Ch-를 H₂O₂와 함께 처리한 경우 H₂O₂단독처리군에 비해 낮아졌는데, LL50군의 ROS 생성량은 15.
HepG2 cell에서 추출물들의 ROS 생성량의 억제효과와 DNA 보호효능이 있는지를 실험한 결과, 모든 추출물들이 31.3 μg/mL부터 농도의존적으로 ROS의 생성을 억제하는 효과를 보여주었으며 250 μg/mL의 농도로 배양액에 처리하였을 때 DNA 손상으로부터 세포를 보호하는 효과를 보여주었다.
HepG2 세포에 H2O2 를 처리하였을 때 정상세포군에 비하여 tail DNA 는 31.6 %, tail length는 51%, tail moment는 71.1% 증가 하였다 (p < 0.05).
LL100 Ch- 처리군에서는 31.25 μg/mL의 농도부터 ROS 생성량이 유의하게 감소하였으며 1,000 μg/mL일 때 H2O2 단독처리군에 비해 36%정도 ROS 생성량이 감소하였다 (p < 0.05).
LL100 Ch-군의 IC50값은 0.08± 0.05 mg/mL로 클로로필 제거 전에 비하여 ABTS radical 소거활성이 약 3배 이상 증가하였고 이는 ascorbic acid (IC50 값, 0.02 ± 0.00 mg/mL)의 25% 수준이었다.
이러한 결과는 위에서 설명한대로 총폴리페놀 함량의 증가와 관련이 있을 것으로 사료된다. LL100군의 DPPH radical과 ABTS radical 소거능은 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 대비 각각 24%와 7% 수준이었으나 클로로필 제거 후 각각 57%, 25% 수준으로 증가하였다. Khalaf 등 [29]은 약용식 물들의 메탄올 추출물의 DPPH 소거능을 ascorbic acid와 비교한 결과 IC50값이 ascorbic acid보다 높은 것 (Camellia sinesis Linn.
05). LL50 처리군에서 tail DNA는 H₂O₂ 단독처리군과 비슷하였으나, tail length는 36%, tail moment 는 46% 감소하였다. LL70 처리군은 H₂O₂ 단독처리군에 비해 tail DNA가 28.
LL50, LL70, LL100, LL100 Ch- 등 구기엽 추출물들은 모두 1,000 μg/mL의 농도까지 세포 생존율에 영향을 주지 않아 독성이 없는 것으로 확인되었다.
LL50, LL70, LL100, LL100 Ch-를 H2O2와 함께 처리한 경우 H2O2 단독처리군에 비해 낮아졌는데, LL50군의 ROS 생성량은 15.6 μg/mL의 저농도부터 유의하게 감소하였으며 1,000 μg/mL 농도에서는 H2O2 단독처리군에 비해 ROS 생성량이 34% 감소되었다 (p < 0.05).
LL50 처리군에서 tail DNA는 H₂O₂ 단독처리군과 비슷하였으나, tail length는 36%, tail moment 는 46% 감소하였다. LL70 처리군은 H₂O₂ 단독처리군에 비해 tail DNA가 28.5%, tail length는 26.8%, tail moment 는 44.3% 감소하였다. H₂O₂ 단독처리군에 비해 LL100군의 tail DNA, tail length, tail moment는 각각 42%, 29.
LL70군에서는 31.3 μg/mL의 농도부터, LL100군에서는 15.6 μg/mL의농도부터 유의하게 ROS 생성량이 감소하였으며 1,000 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 H2O2 단독처리군에 비해 ROS 생성은 각각 32%와 33% 감소하였다 (p < 0.05).
SOD 활성을 측정한 결과, 정상대조군 (14.84 ± 0.45 U/mL)에 비해 H2O2 단독처리군의 SOD 활성 (5.57 ± 1.68 U/mL)은 60% 정도 낮아졌으며, 구기엽 시료를 병행처리한 모든 군의 SOD 활성은 정상대조군과 차이가 없는 정도로 증가하였다 (LL50, LL70, LL100, LL100 Ch- 군 각각 15.57 ± 0.53 U/mL, 15.41 ± 0.54 U/mL, 15.49 ± 0.63 U/mL, 15.41 ± 0.43 U/mL, p < 0.05).
또한 H₂O₂처리한 세포에 비하여 추출물들을 함께 처리한 세포군의 SOD와 catalase 활성은 정상세포과 유사한 수준으로 강력한 보호효과를 보여주었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 구기엽 에탄올 추출물 들은 항산화능이 높으며 고농도까지 세포독성을 보이지 않고 H₂O₂에 의해 손상된 간세포를 보호할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 특히 클로로필 제거 구기엽 에탄올 추출물은 항산화능이 높고 세포독성과 세포보호 효과가 클로로필 제거전 구기엽 에탄올 추출물과 유사하게 나타나 건강기능식품이나 화장품의 소재로 활용 하기에 적절한 소재로 생각된다.
구기엽 추출물들의 DPPH radical 소거활성, ABTS radical 소거활성, FRAP value는 일관성 있게 추출용매의 알코올 농도가 높을수록 증가하였고 클로로필 제거 시료가 제거 전 시료에 비하여 월등히 높았다. 이러한 결과는 위에서 설명한대로 총폴리페놀 함량의 증가와 관련이 있을 것으로 사료된다.
구기자나무의 부가가치를 높이고자 구기엽의 활용가능성을 검토하고 또한 구기엽을 소재화할 때 일부 바람직하지 않은 영향을 보이고 있는 엽록소를 제거한 후 생리활성 들이 유지되는지를 검토하고자 각 추출물들의 항산화와 효능을 우선 검토하였다. 그 결과 전반적으로 50%나 70% 에탄올 추출물에 비하여 100% 에탄올 추출물의 항산화 효능이 높았으며 클로로필을 제거한 시료가 제거 전 시료에 비하여 항산화 효능이 높았다. 천연물 소재의 항산화 효능은 함유되어있는 여러가지 성분에 의존하지만 특히 폴리페놀의 함량과 관계가 있다 [23].
또한 50%, 70%, 100%의 에탄올로 추출한 구기엽 추출물 (LL50, LL70, LL100)과 구기엽 100% 에탄올 추출물에서 클로로필을 제거한 시료 (LL100 Ch-)의 폴리페놀 함량을 측정한 결과, LL100의 총 폴리페놀 함량은 140.51 ± 7.45 mg GAE/g로 LL70의 62.60 ± 5.57 mg GAE/g이나 LL50의 64.74 ± 7.72 mg GAE/g에 비해 유의하게 높았고 LL100 Ch-의 폴리페놀함량은 312.89 ± 10.21 mg GAE/g로 LL100 의 폴리페놀 함량에 대비하여 2배 이상 높았다.
05). 또한 H₂O₂처리한 세포에 비하여 추출물들을 함께 처리한 세포군의 SOD와 catalase 활성은 정상세포과 유사한 수준으로 강력한 보호효과를 보여주었다. 결론적으로 본 연구에서 사용한 구기엽 에탄올 추출물 들은 항산화능이 높으며 고농도까지 세포독성을 보이지 않고 H₂O₂에 의해 손상된 간세포를 보호할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
또한 LL50과 LL100 군들은 250 μg/mL의 농도부터, LL70과 LL100 Ch- 군들은 500 μg/mL의 농도부터 모두 1,000 μg/mL의 농도까지 정상세포군에서 보다 유의 하게 낮은 ROS 생성량을 보여주었다 (p < 0.05).
또한 LL50군과 2) LL70군의 catalase 활성은 정상대조군보다 유의하게 더 높았으며, LL100과 LL100 Ch-는 정상대조군과 비슷한 수준이었다.
05). 또한 구기엽 추출물을 처리한 각군 간의 차이는 보이지 않았으며 클로로필 제거 전후의 차이도 보이지 않았다. Catalase 활성을 측정한 결과, 정상대 조군 (271.
추출물에서 직접 측정한 항산화능은 클로로필 제거 시료가 제거전 시료에 비하여 우수한 항산화 효과를 보여주었으나 HepG2 cell 실험에서는 차이를 확인할 수 없었다. 또한 세포가 분비하는 항산화 효소인 SOD와 catalase를 측정한 결과, H₂O₂로 산화적 스트레스를 준 세포에서는 현저하게 효소활성이 저하되었지만 추출물들을 처리한 세포 군에서는 SOD 활성이 정상세포군의 수준으로 증가하여 강력한 보호효과를 보여주었다. Catalase 활성도 유사한 결과를 보여주었으나 LL50과 LL70군에서는 정상세포군에 비하여 catalase의 활성이 더 높아졌다.
05). 모든 추출물은 250 μg/mL의 농도로 배양액에 처리하였을 때 세포의 DNA 손상을 억제하는 효과를 보여주었다 (p < 0.05). 또한 H₂O₂처리한 세포에 비하여 추출물들을 함께 처리한 세포군의 SOD와 catalase 활성은 정상세포과 유사한 수준으로 강력한 보호효과를 보여주었다.
3% 정도 줄일 수 있다고 보고하였고 이 결과는 구기자 분말이간 세포를 산화적 스트레스로부터 보호할 수 있음을 뜻한다. 본 연구결과, 구기엽 역시 구기자 분말이나 다당체와 유사한 효과를 보여주었으며 클로로필 제거 구기엽은 제거 전 구기엽 시료와 유사한 항산화능을 보이고 있었다. 추출물에서 직접 측정한 항산화능은 클로로필 제거 시료가 제거전 시료에 비하여 우수한 항산화 효과를 보여주었으나 HepG2 cell 실험에서는 차이를 확인할 수 없었다.
본 연구에 사용한 추출물들은 모두 에탄올로 추출하였고 실험 결과 1,000 μg/mL까지 세포증식에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
본 연구에서 사용한 구기엽 에탄올 추출물들은 항산화 능이 높으며 고농도까지 세포독성을 보이지 않고 H₂O₂에의해 손상된 간세포를 보호할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 추출 용매의 알코올 농도가 높을수록 추출물의 항산화능은 증가하였고 특히 클로로필 제거 구기엽 에탄올 추출물은 클로로필을 제거하지 않은 구기엽 에탄올 추출물보다 시료의 항산화능이 높고 세포독성과 세포보호 효과가 유사하게 나타나 건강기능식품이나 화장품의 소재로 활용하기에 적절한 소재로 생각된다.
본 연구에서 사용한 방법으로 클로로필을 제거하였을때 그 제거율을 보기 위하여 100% 에탄올 추출물과 이로부터 클로로필을 제거한 시료의 클로로필 a 함량을 측정한 결과, 클로로필 a가 99.9% 제거된 것으로 확인되었다 [Table 1]. 100% 에탄올 추출물의 수율은 20.
천연물 소재의 항산화 효능은 함유되어있는 여러가지 성분에 의존하지만 특히 폴리페놀의 함량과 관계가 있다 [23]. 본 연구에서 추출물 들의 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 에탄올 50%와 70%로추출한 시료들의 총폴리페놀 함량은 100% 에탄올 추출물에 비하여 낮았다. 유사한 다른 연구를 살펴보면 Liu 등 [24] 구기엽 80% 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량은 92.
시료의 FRAP value를 측정한 결과 LL50, LL70, LL100군들에서 각각 0.15 ± 0.01 mM, 0.16 ± 0.01 mM, 0.37 ± 0.01 mM였으며, LL100 Ch-군의 FRAP value는 1.28 ± 0.08 mM로 클로로필 제거 전에 비하여 유의하게 높았다.
연구결과, 총 폴리페놀 함량, DPPH와 ABTS radicals 소거능, 그리고 FRAP value에서 모두 추출용매의 알코올 농도가 높을수록 증가하였고 클로로필 제거 시료가 제거 전 시료에 비하여 월등히 높았다 (p < 0.05).
에의해 손상된 간세포를 보호할 수 있는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 추출 용매의 알코올 농도가 높을수록 추출물의 항산화능은 증가하였고 특히 클로로필 제거 구기엽 에탄올 추출물은 클로로필을 제거하지 않은 구기엽 에탄올 추출물보다 시료의 항산화능이 높고 세포독성과 세포보호 효과가 유사하게 나타나 건강기능식품이나 화장품의 소재로 활용하기에 적절한 소재로 생각된다.

후속연구

또한 시료 종류의 차이에 따른 성분의 차이도 다른 결과를 도출하는 원인이 될 수 있다. 그러므로 추후 후속 연구들을 통하여 본 연구에서 사용한 클로로필 제거 방법에 따른 시료의 폴리페놀 함량의 증가 요인을 검증하여야할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	구기자 (Lycii fructus)란?	구기자 (Lycii fructus)는 가지과 (Solanceae)에 속한 구기자 나무의 성숙한 과실을 건조한 것으로 우리나라를 비롯한 중국, 대만, 일반 등지에서 자생하거나 재배되고 있는 생약재로 한방에서는 인삼 등과 함께 독성이 없는 120종의 상약 (上藥)군으로 취급하고 있다 [1]. 구기자나무의 종류는 상당히 많으나 그 열매를 식용으로 사용하는 나무 중 잘 알려진 것으로 한국의 청양 등에서 주로 재배되는 Lycium chinense Miller와 중국, 티벳, 몽고 등에서 재배되는Lycium barbarum Linne (영하구기자)로 볼 수 있다 [2].
	클로로필 제거 여부에 따른 폴리페놀 함량의 차이는?	녹색 식물에서 클로로필의 제거를 위한 시도와 이에 따른 항산화능에 대한 연구는 기존에 몇 건 수행되었는데 대부분 클로로필 제거 전 시료가 제거 후 시료에 비하여 항산화 효능이 감소되는 것으로 보고되고 있다 [25-27]. Benjakul 등 [28] Leucaenaleucocephala종자의 물 추출물 제조 시 클로로필 제거 여부에 따라 폴리페놀 함량이 달라지는지를 비교하였는데 이 연구에서는 클로로필 제거 후 (43.1 ± 0.06 g GA/l00g) 시료의 폴리페놀 함량이 제거 전 (56.2 ± 0.01 g GA/100g) 시료에 비하여 더 낮게 나타났다. 그러나 이에 따른 항산화 효능의 차이는 크지 않았는데 이러한 결과는 클로로필 제거 시 사용한 용매, 클로로포름에 의해 일부 극성이 낮으며 항산화능은 크지 않은 페놀 화합물들이 함께 제거되었기 때문이라고 저자들은 설명하고 있다.
	구기엽 에탄올 추출물에서 클로로필 제거 방법은?	클로로필 제거 방법을 간략하면 다음과 같다. 구기엽 에탄올 추출물을 클로로포름 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 용해시킨 후 메탄올 (Sigma-Aldrich Co.)을 섞어 색소를 침전시켰다. 그 후 charcoal column과 silica gel column chromatography를 사용하여 클로로필을 제거하였다.

참고문헌 (41)
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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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