[논문]성인용 치약의 세포독성 평가의 융합적 연구

최유리; 심연수; 장선옥

doi:10.14400/jdc.2019.17.3.305

성인용 치약의 세포독성 평가의 융합적 연구
A convergence study of cytotoxicity evaluation of adult dentifrices 원문보기

디지털융복합연구 = Journal of digital convergence, v.17 no.3, 2019년, pp.305 - 312

최유리 (한림성심대학교 치위생과) , 심연수 (선문대학교 치위생학과) , 장선옥 (한림성심대학교 치위생과)

초록
AI-Helper

본 논문은 치약의 성분이 구강 내 세포에 영향을 미치는 정도를 확인하기 위하여 세포활성도, 세포독성을 평가하고자 하였다. 일반치약 6종, 미백치약 3종, 천연치약 2종, 양성대조군으로 SLS(sodium lauryl sulfate)를 사용하였다. Immortalized human gingiva fibroblast cell 을 사용하여, 세포활성도 평가를 위하여 WST test, 세포 독성평가를 위해 Agar diffusion test를 시행하였다. 일반치약그룹, 미백치약그룹, 천연치약그룹 순으로 세포 생존률이 높게 나타났으며, Agar diffusion test는 일반치약그룹과 미백치약그룹은 높은 세포독성을 나타낸 반면 천연치약그룹은 낮은 독성을 나타냈다. 세포핵염색 결과 세포모양과 핵활성도 또한 천연치약이 가장 높은 활성도를 나타냈고, 미백치약, 일반치약 순으로 나타났다. 본 연구 결과, 치약의 사용목적에 따라 나누어지는 종류와 성분별 세포독성을 확인할 수 있었다. 소비자의 올바른 선택을 위해 치약의 자세한 성분표기가 필요할 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to effect the cell activity and cytotoxicity of dentifrice. For the study, 6 kinds of general dentifrice, 3 kind of whitening dentifrice, 2 kinds of natural dentifrice and SLS(sodium lauryl sulfate) of positive control group. Immortalized human gingiva fibroblast cell was used for the study, WST test for cell activity and Agar diffusion test for cytotoxicity. Agar diffusion test showed high cytotoxicity in general dentifrice test group and whitening dentifrice test group, but low cytotoxicity in natural dentifrice test group. As a result of cell nucleus staining, cell shape and nuclear activity showed that the highest activity in natural dentifrice group, followed by whitening dentifrice group and general dentifrice group. As a result of this study, the cytotoxicity of different ingredient and according to the use to dentifrice. As a result of this study, we confirm cytotoxicity of kind and components according to the purpose of using dentifrice. Therefore, it is necessary to indicate the detailed ingredients of dentifrice for the smart choice of consumers.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. Appliance of dentifrice materials of this study
그림 Fig. 1. Cell viability result of adults dentifrice * different alphabet was statistically significant difference
표 Table 2. Decolorization index
표 Table 3. Cell activity result of dentifrice
그림 Fig. 2. Result of cell morphology and nucleus activity (a) G-1 group, (b) G-2 group, (c) G-3 group, (d) G-4 group, (e) G-5 group, (f) G-6 group, (g) W-1 group, (h) W-2 group, (i) W-3 group, (j) N-1 group, (k) N-2 group (l) PC
표 Table 4. Agar diffusion assay zone grade result

AI 본문요약
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* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

하지만, 치약마다 전 성분을 표기하지 않는 경우도 있어 시판되고 있는 성인용 치약을 제조사에서 제시한 내용에 따라, 일반 치약, 미백 치약, 천연치약으로 구분하여 제품을 평가하고자하였으며 구강 내에 접촉되는 시간과 횟수에 따라 독성 정도가 다르게 나타나고, 실제 구강점막에서 나타나는 독성이 임상적으로 나타나지는 않더라도 세포독성 결과에 따라 구강점막에 나타나는 자극 정도가 다르게 나타날 수 있으리라 보여 진다. 따라서 본 연구에서는 시중에서 판매하고 있는 성인용 치약 제품의 세포활성도와 세포 독성을 평가해보고자 한다.
하지만, 치약마다 전 성분을 표기하지 않는 경우도 있어 시판되고 있는 성인용 치약을 제조사에서 제시한 내용에 따라, 일반 치약, 미백 치약, 천연치약으로 구분하여 제품을 평가하고자하였으며 구강 내에 접촉되는 시간과 횟수에 따라 독성 정도가 다르게 나타나고, 실제 구강점막에서 나타나는 독성이 임상적으로 나타나지는 않더라도 세포독성 결과에 따라 구강점막에 나타나는 자극 정도가 다르게 나타날 수 있으리라 보여 진다. 따라서 본 연구에서는 시중에서 판매하고 있는 성인용 치약 제품의 세포활성도와 세포 독성을 평가해보고자 한다.

제안 방법

5×10⁵ cells/mL)씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ Incubator에서 배양하였다. 배양액의 단층 배양 상태 (배양 용기 면적의 80% 이상)와 세포의 형태를 현미경으로 확인하였다. 배양액을 제거하고 medium(배지 4 mL : FBS 1 mL : agar 5 mL)을 10 mL 첨가 후 굳혔다.
세포 독성 평가를 하기 위해 음성대조군으로 polyethylene film(6 mm)을, 양성대조군으로는 latex(6 mm)를 적용하였다. 지름 6 mm 두께 1 mm의 filter paper위에 각각 치약을 올리고 50 °C 건조로에서 24시간동안 건조시켰다.
이후 현미경으로 염색 여부를 확인한 후 염색약을 제거하고 PBS 10 mL로 씻어내고 건조하고 시험군과 대조군 시편을 위치한 후 24시간 동안 CO₂ Incubator에서 배양하였다. 시편 주변에 세포 사멸 zone의 크기에 따라 0-5로 grade를 구분하였다(Table 2 참고, ISO 10993-5 [17]).
시편아래 세포의 핵염색(Neutral red)을 통한 세포 핵 생존유무와 세포의 모양을 확인하기 위하여, 현미경을 이용하여 사진 촬영을 하였다(x200).
Agar가 굳으면 염색용액 (Neutral red : PBS = 300 µL : 10mL)을 filtering(200 µm filter) 하여 주입하고 은박지로 밀폐 후 30분 동안 CO₂ Incubator에 보관하였다. 이후 현미경으로 염색 여부를 확인한 후 염색약을 제거하고 PBS 10 mL로 씻어내고 건조하고 시험군과 대조군 시편을 위치한 후 24시간 동안 CO₂ Incubator에서 배양하였다. 시편 주변에 세포 사멸 zone의 크기에 따라 0-5로 grade를 구분하였다(Table 2 참고, ISO 10993-5 [17]).
인공타액 제작을 위하여 Gastric mucin 4.4g (Musin from porcine stomach, Sigma, USA), NaCl 0.762g (Sodium Chloride, Duksan Co., Korea), CaCl2 0.462g(Calcium Chloride, Duksan Co., Korea), KH2 PO4 1.476g(Potassium phosphate, Duksan Co., Korea), KCL2.228g (Potassium chloride, Duksan Co., Korea)을 distilled water (D.W) 2L에 넣고 24h 동안 교반시킨 후고압증기 멸균을 시행하였다.
치약시편에 직접 접촉한 세포의 핵 염색과 세포 모양 평가를 통해 치약이 세포에 영향을 주는지 확인하였다. 일반치약과 미백치약에서는 전체적으로 세포의 모양이 뻗어있지 않고 동글한 형태로 활성도가 낮게 나타났으며 핵 염색이 이루어지지 않았음을 볼 수 있었다.
치약의 세포독성평가를 위해 세포만 있는 음성대조군을 기준으로 100 %로 잡고 양성대조군인 SLS 와 각각 치약그룹의 세포 생존률을 확인하였다. 일반치약인 G그룹은 평균 21%로 나타났고, 미백치약인 W그룹은 평균 37%로, 천연치약인 N그룹은 67%로 나타났다.
연구재료는 치약의 실험그룹을 3그룹으로 선정하였다. 합성계면활성제를 함유한 일반치약 6종과 미백치약 3종, 천연치약 2종으로 정하였다. 양성대조군으로는 계면 활성제 sodium lauryl sulfate로 적용하였다(Table 1 참고).

대상 데이터

세포 활성도와 독성 평가를 확인하기 위해 Immortalized human gingiva fibroblast cell(hNOF)를 이용하였다[14].
합성계면활성제를 함유한 일반치약 6종과 미백치약 3종, 천연치약 2종으로 정하였다. 양성대조군으로는 계면 활성제 sodium lauryl sulfate로 적용하였다(Table 1 참고).
연구재료는 치약의 실험그룹을 3그룹으로 선정하였다. 합성계면활성제를 함유한 일반치약 6종과 미백치약 3종, 천연치약 2종으로 정하였다.

데이터처리

치약 종류에 따른 세포독성을 보기 위해서 분산분석 (one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였으며, 사후분석으로 Tukey test를 실시하였다(p<0.05).

이론/모형

세포 활성도 평가를 위해 ISO 10993-12[15]의 규격에 따라 각 치약을 인공 타액에서 0.2g/mL를 37 ℃에서 24 시간 용출 하였다. 각1 x 10⁵ 씩 96well에 세포를 키운 후상층 배지를 제거하였다.
직접적인 치약의 독성평가를 위하여 ISO 7405[16]에 따라 agar diffusion assay를 시행하였다. 세포 부유액을 petri-dish에 10 mL (2.
치약의 세포 독성 정도를 평가하기 위하여, ISO 7405[16]에 따라 배양된 세포위에 건조된 치약을 올려두고 치약의 독성정도에 따라 세포의 사멸의 등급에 따라 결과를 내렸다. 전체적으로 세포의 활성도와 비슷한 경향을 나타냈다.

성능/효과

천연치약 그룹은 시편이 직접적으로 접촉한 하방이나 주변에 전혀 영향을 주지 않은 grade 0을 나타내어 세포독성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다. N-2 그룹은 grade 0을 나타내었고, N-1그룹은 시편과 직접적으로 접촉한 시편 하방에만 사멸범위를 보이는 grade 1의 사멸 범위를 나타내어 직접 접촉한 부위에서만 약간의 독성을 보였다.
음성대조군(세포만 있는 그룹)를 100%로 정하고 세포의 활성도를 비교해본결과, 일반치약 그룹은 세포활성도가 평균 21%로 가장 낮았으며, 이어서 미백치약 평균 37%, 천연치약 평균 67% 순으로 나타났다(Table 3 참고). SLS만 적용한 양성대조군(PC 그룹)은 16%의 세포 활성도를 나타냈으며, 일반치약 중 G-5그룹은 14%로 양성대조군과 비슷한 세포활성도가 나타났다. 또한 미백치약은 W-1그룹은 31%, W-2그룹은 30%, W-3그룹은 50%로 나타났다(Fig 1 참고).
2014년에는 간암을 유발 하는 트리클로산이 치약에 포함되어있어 큰 이슈가 되었으며, 치약제 중 향균성분 및 보존제 조사연구에 의하면 시중에 판매되는 치약에 파옥시벤존산, 벤존산나트륨이 들어가 있었다고 밝혔다[33]. 또한 가습기 살균제로 잘 알려진 CMIT, MIT 성분이 치약에 들어있는 것으로 밝혀져 사회적으로 큰 충격을 주었다. 하지만 여전히 소비자는 의약외품에 분류된 치약의 자세한 성분은 제조사가 표시 하지 않는 이상 소비자는 확인할 수 있는 방법이 없다.
제조사의 SLS 함량 표시가 되어있는 G-2그룹과 G-6그룹은 일반치약그룹에서도 생존률이 높았지만 SLS 사용여부를 확인할 수 없는 그룹들은 세포 생존률이 낮게 나타났다. 또한 미백 치약에서도 SLS함량이 표시되어있는 W-3그룹은 가장 높은 세포 생존률을 나타내 SLS 함량 여부와 자세한 성분 표기하고 있지 않은 W-1그룹, W-2그룹은 생존률이 낮게 나타났다. 이러한 결과는 시판되는 어린이 치약 중 SLS 함량을 표기한 그룹보다 SLS 함량과 자세한 성분 표기를 하지 않은 그룹들의 세포 생존률이 낮게 나타난 결과와 유사하다[27].
본 연구 결과, 치약은 세포 생존률과 세포 독성 등에 영향을 준 것으로 나타났다. 따라서 소비자의 알권리와 선택권을 위해서 구강 내 직접 접촉하는 치약의 주성분 및 보존제 등을 자세히 표기 병행되어야 할 것으로 사료 된다.
세포 독성을 평가할 수 있는 세포사멸범위(zone)를 조사한 agar diffusion test에서는 일반치약그룹과 미백치약그룹은 모두 사멸범위가 시편 주변 0.5 ~ 1cm 이상을 나타내는 grade 3 ~ 4로 조사되어 높은 세포독성을 보였다. 천연치약 그룹은 시편이 직접적으로 접촉한 하방이나 주변에 전혀 영향을 주지 않은 grade 0을 나타내어 세포독성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다.
일반치약그룹, 미백치약그룹, 천연치약그룹 순으로 세포 생존률이 높게 나타났으며, Agar diffusion test는 일반치약그룹과 미백치약그룹은 높은 세포독성을 나타낸 반면 천연치약그룹은 낮은 독성을 나타냈다. 세포핵염색결과 세포모양과 핵활성도 또한 천연치약이 가장 높은 활성도를 나타냈고, 미백치약, 일반치약 순으로 나타났다.
음성대조군(세포만 있는 그룹)를 100%로 정하고 세포의 활성도를 비교해본결과, 일반치약 그룹은 세포활성도가 평균 21%로 가장 낮았으며, 이어서 미백치약 평균 37%, 천연치약 평균 67% 순으로 나타났다(Table 3 참고). SLS만 적용한 양성대조군(PC 그룹)은 16%의 세포 활성도를 나타냈으며, 일반치약 중 G-5그룹은 14%로 양성대조군과 비슷한 세포활성도가 나타났다.
일반치약그룹, 미백치약그룹, 천연치약그룹 순으로 세포 생존률이 높게 나타났으며, Agar diffusion test는 일반치약그룹과 미백치약그룹은 높은 세포독성을 나타낸 반면 천연치약그룹은 낮은 독성을 나타냈다. 세포핵염색결과 세포모양과 핵활성도 또한 천연치약이 가장 높은 활성도를 나타냈고, 미백치약, 일반치약 순으로 나타났다.
치약의 세포독성평가를 위해 세포만 있는 음성대조군을 기준으로 100 %로 잡고 양성대조군인 SLS 와 각각 치약그룹의 세포 생존률을 확인하였다. 일반치약인 G그룹은 평균 21%로 나타났고, 미백치약인 W그룹은 평균 37%로, 천연치약인 N그룹은 67%로 나타났다. 즉 일반치약에서 세포 생존률이 가장 낮게 나타났으며, 미백치약 그룹, 천연치약그룹 순으로 나타났다.
즉 일반치약에서 세포 생존률이 가장 낮게 나타났으며, 미백치약 그룹, 천연치약그룹 순으로 나타났다. 제조사의 SLS 함량 표시가 되어있는 G-2그룹과 G-6그룹은 일반치약그룹에서도 생존률이 높았지만 SLS 사용여부를 확인할 수 없는 그룹들은 세포 생존률이 낮게 나타났다. 또한 미백 치약에서도 SLS함량이 표시되어있는 W-3그룹은 가장 높은 세포 생존률을 나타내 SLS 함량 여부와 자세한 성분 표기하고 있지 않은 W-1그룹, W-2그룹은 생존률이 낮게 나타났다.
일반치약인 G그룹은 평균 21%로 나타났고, 미백치약인 W그룹은 평균 37%로, 천연치약인 N그룹은 67%로 나타났다. 즉 일반치약에서 세포 생존률이 가장 낮게 나타났으며, 미백치약 그룹, 천연치약그룹 순으로 나타났다. 제조사의 SLS 함량 표시가 되어있는 G-2그룹과 G-6그룹은 일반치약그룹에서도 생존률이 높았지만 SLS 사용여부를 확인할 수 없는 그룹들은 세포 생존률이 낮게 나타났다.
국내 시판되는 치약들을 조사한 결과 SLS 함량이 높아짐에 따라 세포 생존률이 유의차 있게 낮아졌다는 보고도 있었다[28]. 즉 제조사가 밝히지 않아 자세한 성분을 확인할 수는 없었던 치약들은 자세한 성분을 밝히고 SLS함량을 표기한 치약들보다 생존률이 낮게 나타났다.
5 ~ 1cm 이상을 나타내는 grade 3 ~ 4로 조사되어 높은 세포독성을 보였다. 천연치약 그룹은 시편이 직접적으로 접촉한 하방이나 주변에 전혀 영향을 주지 않은 grade 0을 나타내어 세포독성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다. N-2 그룹은 grade 0을 나타내었고, N-1그룹은 시편과 직접적으로 접촉한 시편 하방에만 사멸범위를 보이는 grade 1의 사멸 범위를 나타내어 직접 접촉한 부위에서만 약간의 독성을 보였다.
일반치약과 미백치약에서는 전체적으로 세포의 모양이 뻗어있지 않고 동글한 형태로 활성도가 낮게 나타났으며 핵 염색이 이루어지지 않았음을 볼 수 있었다. 천연치약에서는 세포가 뻗어있으며 핵이 명확하게 염색되었음을 확인되었고, 세포독성은 다른 치약과 비교하였을 때 낮게 나타남을 확인할 수 있었다(Fig. 2 참고).
특히 천연치약의 세포활성도는 N-1그룹은 72%, N-2그룹은 62%를 나타내며 N그룹 중 가장 세포활성도가 높게 나타나 치약의 영향이 상대적으로 적게 미침을 알 수 있었다(p<0.05).
또한 Cho 등[31]은 SLS 가 배합된 치약과 배함되지 않은 치약의 영향을 확인한 결과, SLS가 배합된 치약을 사용한 실험군에서 구취가 발생하였다고 하였다. 항균제가 배합 된 세치제 속 SLS 가 배제 시 구강 내 미치는 작용은 습도는 증가하였고, 구취는 감소하였으며, 구강 내 세정 효과는 감소하였다. 이에 기계적으로 구강 위생관리가 잘 되지만, 구취, 구강 건조가 심한 환자에게는 SLS가 배제된 항균제가 결합된 세치제가 효과적일 것으로 사료되며, 개인의 구강 내 특성에 적절한 세치제 선택과 더욱 다양한 세치제 개발이 필요하다고 사료된다.
핵 염색 실험에서는 일반치약그룹과 미백치약그룹은 세포의 모양이 일그러져 있었고, 핵염색이 전혀 나타나지 않아 세포독성이 높게 나타남을 확인할 수 있었지만, 천연치약그룹인 N-1그룹, N-2 그룹은 세포의 핵이 명확하고 붉게 확인되었고 세포의 모양도 건강하게 뻗어있어 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

후속연구

항균제가 배합 된 세치제 속 SLS 가 배제 시 구강 내 미치는 작용은 습도는 증가하였고, 구취는 감소하였으며, 구강 내 세정 효과는 감소하였다. 이에 기계적으로 구강 위생관리가 잘 되지만, 구취, 구강 건조가 심한 환자에게는 SLS가 배제된 항균제가 결합된 세치제가 효과적일 것으로 사료되며, 개인의 구강 내 특성에 적절한 세치제 선택과 더욱 다양한 세치제 개발이 필요하다고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	세포 독성 평가을 하기위해 사용한 방법은 무엇인가요?	직접적인 치약의 독성평가를 위하여 ISO 7405[16]에 따라 agar diffusion assay를 시행하였다. 세포 부유액을 petri-dish에 10 mL (2.5×105 cells/mL)씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 Incubator에서 배양하였다. 배양 액의 단층 배양 상태 (배양 용기 면적의 80% 이상)와 세포의 형태를 현미경으로 확인하였다. 배양액을 제거하고 medium(배지 4 mL : FBS 1 mL : agar 5 mL)을 10 mL 첨가 후 굳혔다. Agar가 굳으면 염색용액 (Neutral red :PBS = 300 µL : 10mL)을 filtering(200 µm filter) 하여 주입하고 은박지로 밀폐 후 30분 동안 CO2 Incubator에 보관하였다. 이후 현미경으로 염색 여부를 확인한 후 염색 약을 제거하고 PBS 10 mL로 씻어내고 건조하고 시험군과 대조군 시편을 위치한 후 24시간 동안 CO2 Incubator에서 배양하였다. 시편 주변에 세포 사멸 zone의 크기에 따라 0-5로 grade를 구분하였다(Table 2 참고, ISO 10993-5 [17]).
	본 연구에서 치약에 들어있는 세제란 무엇인가요?	치약의 주성분 중 세정제는 세마제의 세정작용을 보완하여 치아 표면을 깨끗이 세정하는 작용을 하는 성분 으로 세제(cleaning agent)라고도 하며[2], 세정제는 물의 표면장력을 낮추고 치아 표면에 부착된 물질에 침투하여 떨어지기 쉬운 조건을 만들며, 치아 표면에 부착되어 있는 음식물잔사를 유화시키고 부유시켜 세정작용을 발휘 하는 계면활성제(surface active agents)라고도 한다[4]. 계면활성제는 사용하는 동안 거품을 형성하여 상쾌하고 부드러운 느낌이 나타나게 한다.
	세치제에 배합하는 가장 흔한 성분은 무엇인가요?	현재 세치제에 배합하는 가장 흔한 세 가지의 합성계 면활성제는 sodium lauryl sulfate와 sodium N-lauryl sarcosinate 및 sodium cocomonoglyceride sulfonate이다. 이 중에서 낮은 표면장력으로 치약이 치아 표면 위로잘 흐르게 해주고, 현재의 치약 성분들과도 친화성을 가지는 sodium lauryl sulfate(SLS)와 같은 음이온성 계면 활성제가 가장 많이 세치제에 배합되는 합성중성세제이며[4], 약간의 항균작용도 나타낸다[4,7].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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