[논문]재조합단백질 GRP_BA 및 GG1234를 이용한, 상온상압조건에서의 In vitro 탄산칼슘 결정화

손채연; 송우호; 최현석; 최유성

doi:10.9713/kcer.2019.57.2.205

[국내논문] 재조합단백질 GRP_BA 및 GG1234를 이용한, 상온상압조건에서의 In vitro 탄산칼슘 결정화
In vitro CaCO3 Crystallization at Room Temperature and Atmospheric Pressure Using Recombinant Proteins GRP_BA and GG1234 원문보기

Korean chemical engineering research = 화학공학, v.57 no.2, 2019년, pp.205 - 209

손채연 (충남대학교 응용화학공학과) , 송우호 (충남대학교 응용화학공학과) , 최현석 (충남대학교 응용화학공학과) , 최유성 (충남대학교 응용화학공학과)

초록
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바이오미네랄의 독특한 구조 및 생물학적 물성은 다양한 의료 및 산업용 분야에서 활용할 수 있는 뛰어난 잠재력을 지니고 있어 최근 관심이 증대되고 있다. 껍질 메트릭스 단백질에 의해 조절되는 탄산칼슘 생광물화는 이러한 바이오 미네랄의 생성 메커니즘을 이해하기 위한 대표적인 모델로 활용되고 있다. 본 연구에서는 진주조개 프리즘층에 존재하는 껍질 메트릭스 단백질인 GRP_BA 재조합단백질과 껍질 메트릭스 단백질의 특성과 유사한 인공단백질 GG1234를 이용하여, 상온상압 조건에서 in vitro 탄산칼슘 결정화를 진행하였다. 대표적인 탄산칼슘 결정화 방법인 $CaCl_2$ 용액과 $(NH_4)_2CO_3$ 증기를 활용하였을 때, 두 단백질 모두 상온상압 조건에서 전형적인 능면체의 방해석 결정 성장을 저해하였고, 하위단위의 작은 방해석 결정이 뭉쳐진 장미모양리본 형태의 구형 방해석 성장을 유도하였다. 이러한 실험결과는 두 단백질에서 나타나는 블록으로 구성된 무정형 단백질의 특성에 의해 야기된 것으로 추정되며, 이러한 측면에서 본 연구는 껍질 메트릭스 단백질에 의해 조절되는 탄산칼슘 생광물화 현상의 이해를 높이는 데 기여할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The exquisite structure and attractive biological properties of biominerals have great potential and increased interest for use in a wide range of medical and industrial applications. Calcium carbonate biomineralization, mainly controlled by shell matrix proteins, has been used as a representative model to understand the biomineralization mechanism. In this study, in vitro calcium carbonate crystallization was carried out under room temperature and atmospheric pressure using recombinant shell matrix protein GRP_BA and artificial shell matrix protein GG1234. Both proteins inhibited the growth of typical rhombohedral calcite crystals in the calcium carbonate crystallization using $CaCl_2$ solution and $(NH_4)_2CO_3$ vapor, and spherulitic calcite crystals with rosette-like structures were synthesized in both the presence of GRP_BA and GG1234. These results might be caused by the properties of block-like domain structure and intrinsically disordered proteins. We expect that this study can contribute to enhance understanding of the calcium carbonate biomineralization controlled by shell matrix proteins.

Keyword

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. (a) Schematic representation of the amino acid sequence of GRP_BA, where red letters indicate acidic amino acid residues. Yellow and green boxes are two domains, respectively. (b) Schematic representation of the amino acid sequence of GG1234, where red letters indicate acidic amino acid residues. Yellow and green boxes are two domains, respectively.
그림 Fig. 2. Scanning electron microscope (SEM) images of CaCO₃ precipitates obtained at 20 ℃ and 1 atm aftera 20 h incubation using 10 mM CaCl₂ solution and (NH₄)₂CO₃ vapor with no GRP_BA (a), 250 μg/mL GRP_BA (b), 500 μg/mL GRP_BA (c), 750 μg/mL GRP_BA (d), 500 μg/mL Asp (e), 500 μg/mL Glu (f) and 500 μg/mL BSA (g).
그림 Fig. 3. Scanning electron microscope (SEM) images of CaCO₃ precipitates obtained at 20 ℃ and 1 atm after a 20 h incubation using the ammonium carbonate vaporization method based on 10 mM CaCl₂ solution and (NH₄)₂CO₃ vapor with no GG1234 (a), 200 μg/mL GG1234 (b), 400 μg/mL GG1234 (c) and 600 μg/mL GG1234 (d).
$Fig. 4. X-ray diffraction (XRD) spectra of CaCO3 precipitates obtained at 20 ℃ and 1 atm after a 20 h incubation using the ammonium carbonate vaporization method based on 10 mM CaCl2 solution and (NH4)2CO3 vapor with no GG1234 (a), 200 μg/mL GG1234 (b), 400 μg/mL GG1234 (c) and 600 μg/mL GG1234 (d). Peaks indicated by asterisks correspond to the calcite phase of the XRD data.$ 그림 Fig. 4. X-ray diffraction (XRD) spectra of CaCO₃ precipitates obtained at 20 ℃ and 1 atm after a 20 h incubation using the ammonium carbonate vaporization method based on 10 mM CaCl₂ solution and (NH₄)₂CO₃ vapor with no GG1234 (a), 200 μg/mL GG1234 (b), 400 μg/mL GG1234 (c) and 600 μg/mL GG1234 (d). Peaks indicated by asterisks correspond to the calcite phase of the XRD data.

AI 본문요약
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문제 정의

마찬가지로 GRP_BA 또한 상기 아미노산 서열 특성에 기초하여 이러한 액상의 전구물질 형성에 관여할 것으로 기대되었으나, 아직까지 액상 형태의 전구 물질을 생성하는 조건을 찾지 못하였다. 하지만, 단백질 1차 구조적 특성 또한 탄산칼슘 결정화에 충분히 영향을 줄 수 있으므로, 본 연구에서는 GRP_BA 단 백질이 결정 형성에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. 그리고 GG1234는 선행연구에서 GRP_BA와 달리 코아세르베이트를 형성하여 필름 형태의 탄산칼슘 결정에 관여하여 GRP_BA와 다른 특성을 보였지만, 선행 연구에서의 코아세르베이트를 이용하지 않고 GG1234 단백질 자체를 활용하여 GRP_BA와 마찬가지로 GG1234 단백질 자체가 탄산칼슘 결정화에 어떤 영향을 주는지 알아보았다.

가설 설정

두 경우 모두 능면체의 방해석 형태의 탄산칼슘 결정성장을 저해하였고, 하위단위 방해석 결정이 뭉쳐진 장미모양리본 형태의 구형의 방해석 결정 성장을 유도하였다. 본 연구에서 GRP_BA와 GG1234는 상온상압의 실험조건에서 나노입상 형성 및 응집에 기반한 바이오미네랄의 성장을 유도하지는 않았다. 하지만, 본 연구결과는 껍질 메트릭스 단백질에 의해 조절되는 탄산칼슘의 생광물화 현상에 대한 이해를더욱 높이는 데 기여할 것이고, 유무기복합화에 의한 탄산칼슘 생광물화 조절 및 이에 기반한 바이오미네랄 소재 개발에 밑거름이 될 것으로 기대된다.

제안 방법

이러한 측면에서, 본 논문에서는 상기 GRP_BA와 GG1234 단백질을 이용하여 수중의 특정 조건이 아닌 대기중에서의 가장 보편 적인 조건인 상온(20°C), 상압(1 atm) 조건에서 CaCl2 용액과 (NH4)2CO3 증기를 이용한 탄산칼슘 결정화를 진행하였고, 그결과를 주사전자현미경을 이용한 형태분석과 X선 회절패턴을 통한 탄산칼슘의 다형성을 분석하였다.
상기 실험에 대한 대조군으로 500 μg/mL의 BSA(Bovine serum albumin) 단백질과 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu) 을 각각 포함하고 있는 10 mM CaCl2 용액에서도 동시에 진행하였다.
간략히 설명하면 50 µg/mL의 엠피실린이 포함된 400mL LB 배지에 상기 벡터가 포함된 대장균 세포를 접종하여, 37°C에서 진탕배양하였고, 단백질 발현을 유도하기 위하여 흡광도(OD600)값이 0.8-1.0 이 되었을 때 단백질 발현 유도물질인 Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종농도가 0.2 mM 되도록 첨가하였고, 37°C에서 4시간 동안 추가로 배양한 후, 배양된 세포를 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다.
본 연구팀은 최근 여러 형태의 진주조개 껍질 유래의 껍질 메트릭스 단백질과 껍질 메트릭스 단백질의 특성을 함유하는 인공단백질을 유전자재조합을 통하여 확보하고 대장균 균주를 이용하여 성공적으로 발현, 정제하였다[5-8]. 그 중, 진주조개 프리즘층(prismatic layer)에 존재하는 글리신을 다량 함유한 단백질인 GRP_BA는 대장균에서 재조합하여 생산하였을 때 95% 이상의 순도로 30 mg/L 농도로 얻어졌고, 얻어진 단백질은 Ca²⁺와 효율적으로 복합체를 형성하며 특정수용액 조건에서 다양한 바이오미네랄에서 공통적으로 관찰되는 나노입상(nanogranules)의 구체로 구성된 구형의 방해석 (spherulitic calcite) 형성에 관여하는 것을 파악하였다[8].
상기 실험에 대한 대조군으로 500 μg/mL의 BSA(Bovine serum albumin) 단백질과 아스파라긴산(Asp), 글루탐산(Glu) 을 각각 포함하고 있는 10 mM CaCl₂ 용액에서도 동시에 진행하였다. 이후, 결정화에 의해 유리 표면에 침전된 탄산칼슘 결정은 증류수로 세척하여 상온에서 건조하였고, 결정의 형태를 정확히 확인하기 위하여 얻어진 샘플을 금으로 코팅하고 이를 주사전자현 미경(SEM) (SNE-4500M; SEC Co., Suwon, Korea)으로 관찰하였 다. 또한 얻어진 결정의 X-선 회절패턴을 X-선 회절분석기(XRD) (D/MAX-2200; Rigaku Co.
, Suwon, Korea)으로 관찰하였 다. 또한 얻어진 결정의 X-선 회절패턴을 X-선 회절분석기(XRD) (D/MAX-2200; Rigaku Co., Tokyo, Japan)로 분석하였다.
본 연구에서는 우선 GRP_BA와 GG1234 단백질의 아미노산 1차 구조 분석을 진행하였다. 진주조개의 프리즘층에서부터 아미노산 서열 정보가 얻어진 GRP_BA은 전체적으로 글리신(Gly) (25%), 세린(Ser) (10.
본 연구에서는 재조합 껍질 메트릭스 단백질 GRP_BA와 인공단백질 GG1234를 이용하여 상온상압 조건에서 CaCl₂용액과 (NH₄)₂CO₃증기에 의한 in vitro 탄산칼슘 결정화를 진행하였다. 두 경우 모두 능면체의 방해석 형태의 탄산칼슘 결정성장을 저해하였고, 하위단위 방해석 결정이 뭉쳐진 장미모양리본 형태의 구형의 방해석 결정 성장을 유도하였다.
하지만, 단백질 1차 구조적 특성 또한 탄산칼슘 결정화에 충분히 영향을 줄 수 있으므로, 본 연구에서는 GRP_BA 단 백질이 결정 형성에 어떤 영향을 주는지 알아보았다. 그리고 GG1234는 선행연구에서 GRP_BA와 달리 코아세르베이트를 형성하여 필름 형태의 탄산칼슘 결정에 관여하여 GRP_BA와 다른 특성을 보였지만, 선행 연구에서의 코아세르베이트를 이용하지 않고 GG1234 단백질 자체를 활용하여 GRP_BA와 마찬가지로 GG1234 단백질 자체가 탄산칼슘 결정화에 어떤 영향을 주는지 알아보았다.

이론/모형

GRP_BA와 GG1234 단백질을 이용한 in vitro 탄산칼슘 결정화는 대표적인 결정화 방법인 CaCl₂ 용액과(NH₄)₂CO₃ 증기에 의한 방법을 이용하여 상온상압 조건에서 진행하였다. Fig.

성능/효과

본 연구에서는 우선 GRP_BA와 GG1234 단백질의 아미노산 1차 구조 분석을 진행하였다. 진주조개의 프리즘층에서부터 아미노산 서열 정보가 얻어진 GRP_BA은 전체적으로 글리신(Gly) (25%), 세린(Ser) (10.2%), 알라닌(Ala) (6%)이 많은 부분을 차지하고있는 무정형단백질(Intrinsically disordered proteins)의 서열특성을 갖고 있으며, Glu(8.6%)과 Asp(6.3%)를 함유하여 단백질의 평균 pI 값이 3.64인 산성으로 나타났다. 또한, 단백질에 flexibility를 부여하는 대표적인 아미노산으로 알려진 Gly이 풍부한 도메인(Fig.
2(e))과 Glu (Fig. 2(f))을 포함하는 CaCl₂ 용액을 이용하여 위와 동일한 조건에서 결정화를 진행하여 GRP_BA의 영향이 단백질을 구성하는 Asp 및 Glu 아미노산으로부터 야기되었는지 알아보았으나, 본 실험의 조건에서는이전의 선행보고와 달리 아미노산 이탄산칼슘의 결정 성장에 별 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 또한, GRP_BA과 유사하게산성 pI 값을 갖지만 3차구조를 명확하게 갖는 구형단백질인 BSA(pI 값 4.
2(f))을 포함하는 CaCl₂ 용액을 이용하여 위와 동일한 조건에서 결정화를 진행하여 GRP_BA의 영향이 단백질을 구성하는 Asp 및 Glu 아미노산으로부터 야기되었는지 알아보았으나, 본 실험의 조건에서는이전의 선행보고와 달리 아미노산 이탄산칼슘의 결정 성장에 별 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 또한, GRP_BA과 유사하게산성 pI 값을 갖지만 3차구조를 명확하게 갖는 구형단백질인 BSA(pI 값 4.7)을 이용하여 마찬가지로 상기 결정화를 진행하였으나, 이 경우에도 GRP_BA가 존재할 때 얻어진 장미 모양 리본 형태의 구형 결정은 생성되지 않았고 전형적인 방해석 결정이 얻어 졌다(Fig. 2(g)).
3(b)-(d)에서 보듯이 GG1234 단백질의 첨가된 샘플에서, 정도의 차이는 있지만, 앞의 GRP_BA의 경우와 마찬가지로 작은 하위단위의 방해석으로 구성 된 장미모양리본과 같은 구형 결정을 얻을 수 있었고, 이 경우에도 단백질 농도 변화가 결정의 생성 정도에 영향을 주기는 하였으나 결정 모양에 큰 변화가 나타나지 않았으며, 유기물에 의한 바이오 미네랄에서 많이 보여지는 나노입상(nanogranules) 또한 관찰되지 않았다. X-선 회절 실험을 통해 GG1234 단백질에 의해서 얻어진 결정의 형태를 분석하였을 때, SEM 이미지 상에서 예상되었던 대로, 모든 경우에서 전형적인 방해석의 X-선 회절 패턴을 얻을 수 있 었다(Fig. 4). 이러한 실험결과는, 동일한 단백질인 GRP_BA와 GG1234 단백질을 이용한 수용액상에서의 탄산칼슘 결정화 및 저온(4°C)에서 수행되었던 본 연구팀의 이전 연구결과에서 얻었던 나노입상의 형성 및 이를 통한 구형 또는 판상의 탄산칼슘 결정 생성과는 상이한 결과이다[7,8,11].

후속연구

본 연구에서 GRP_BA와 GG1234는 상온상압의 실험조건에서 나노입상 형성 및 응집에 기반한 바이오미네랄의 성장을 유도하지는 않았다. 하지만, 본 연구결과는 껍질 메트릭스 단백질에 의해 조절되는 탄산칼슘의 생광물화 현상에 대한 이해를더욱 높이는 데 기여할 것이고, 유무기복합화에 의한 탄산칼슘 생광물화 조절 및 이에 기반한 바이오미네랄 소재 개발에 밑거름이 될 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	바이오미네랄의 관심이 증대되고 있는 이유는 무엇인가?	바이오미네랄의 독특한 구조 및 생물학적 물성은 다양한 의료 및 산업용 분야에서 활용할 수 있는 뛰어난 잠재력을 지니고 있어 최근 관심이 증대되고 있다. 껍질 메트릭스 단백질에 의해 조절되는 탄산칼슘 생광물화는 이러한 바이오 미네랄의 생성 메커니즘을 이해하기 위한 대표적인 모델로 활용되고 있다.
	탄산칼슘(CaCO3)의 생광물화는 어떤 의미를 가지는가?	바이오미네랄의 기계적 물성은 이를 구성하는 개별 물질들의 단순 혼합에 의해 얻어지는 물성을 뛰어넘어 매우 우수한 것으로 알려져 있으나, 아직까지 복잡한 계층적구조(hierarchical organization)에 의해 형성되는 생광물화(biomineralization)에 대한 메커니즘에 대한 이해는 충분히 이루어지지 않았다[1]. 자연계에 존재하는 바이오미네랄 중에서, 가장 풍부하게 존재하는 탄산칼슘(CaCO3)의 생광물화는 생명체의 생광물화 현상을 이해하기 위한 대표적인 모델로서 상대적으로 연구가 많이 이루어져 왔다. 해양 연체류 및 조류의 껍질을 구성하는 탄산칼슘 기반 바이오미네랄은 95% 이상의 탄산칼슘(CaCO3)과 5% 미만의껍질메트릭스단백질(shell matrix proteins)을 포함한 유기물로 구성되어 있으며, 그 중 껍질 메트릭스 단백질은 바이오미네랄 형성을 위한 탄산칼슘 결정의 성장 및 형태의 조절에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다[1-3].

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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