[논문]대두 발효물(Bio-Peptone®)의 광노화 억제 효과

김은주; 심명국; 정아람; 김애정

doi:10.15230/scsk.2019.45.1.27

대두 발효물(Bio-Peptone®)의 광노화 억제 효과
Anti-photoaging Effects of Fermented Soybean (Bio-Peptone®) 원문보기

大韓化粧品學會誌 = Journal of the society of cosmetic scientists of Korea, v.45 no.1, 2019년, pp.27 - 36

김은주 (경기대학교 일반대학원 대체의학과) , 심명국 (제니트리 기업 부설 피부과학연구소) , 정아람 (제니트리 기업 부설 피부과학연구소) , 김애정 (경기대학교 대체의학대학원)

초록
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대두(Glycine max)는 식물성 단백질이 풍부한 식품 중 하나로, 생리활성물질을 다량 함유하고 있어 심혈관질환, 비만 등에 효능이 있을 뿐 아니라 피부 개선 효과도 있는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 대두 단백질을 유산균인 Lactobaillus Rhamnosus 균주에 의해 발효한 대두발효물의 광노화 예방 효과를 조사하기 위해 자외선으로부터 기인한 세포독성에 대한 보호 효과 및 콜라겐 생성, 티로시나아제 활성, 멜라닌 색소 생성에 대한 평가를 실시하였다. 결과로서 대두발효물 처리군은 피부섬유아세포에서 자외선으로 유도된 세포독성을 억제하여 보호 효과를 나타내었으며, 세포 내 콜라겐 합성을 증가시켜 주름 개선의 가능성을 확인하였다. 또 다른 실험에서 티로시나아제 활성 및 멜라닌 색소 생성을 억제하여 피부 개선 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 대두발효물이 자외선으로부터 유도되는 주름, 색소 침착 등의 피부 손상을 예방하는 새로운 기능성 소재로서의 활용 가능성을 가지는 것으로 평가된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Soybean (Glycine max), as one of the foods with high plant proteins, contains a large amount of bioactive compounds and known to be effective in cardiovascular disease and obesity as well as in improving skin condition. The purpose of this study was to investigate the anti-photoaging effects of soybean fermented with Lactobacillus Rhamnosus ($Bio-Peptone^{(R)}$) by assessment of cytotoxicity against UVB, collagen synthesis after UVB-irradiation, tyrosinase activity, and melanin synthesis. Results showed that $Bio-Peptone^{(R)}$ protected skin fibroblasts against UVB-induced cytotoxicity and increased type I collagen synthesis. Furthermore, $Bio-Peptone^{(R)}$ significantly inhibited tyrosinase activity and reduced melanin contents. This study suggests that $Bio-Peptone^{(R)}$ has protective effects against UVB-induced skin damage. Thus, it is concluded that $Bio-Peptone^{(R)}$ is able to prevent skin damage against UVB and thus acts as anti-photoaging materials by protecting skin forming wrinkles and skin pigments.

주제어

표/그림 (7)

그림 Figure 1. Production of a fermented soybean (Bio-Peptone^®) with Lactobacillus Rhamnosus.
그림 Figure 2. LC-MS profile analysis of fermented soybean (Bio-Peptone^®). MS chromatogram (A) and MS spectrum of 6 major peaks (B) in MS chromatogram at retention time 1.61, 3.82, 7.44, 10.46, 15.82, and 20.26 min.
그림 Figure 3. Effects of Bio-Peptone^® on viability of HDF and B16F10 cell line. (A) HDF cells were treated with Bio-Peptone^® at indicated concentration for 24 h. (B) B16F10 cells were treated with Bio-Peptone^® at indicated concentration for 24 h. Cell viabilities were determined as described in the materials and methods. Values represent the mean normalized cell viability value (mean ± SD, N = 3). The value of untreated cells was taken as 100%. * p < 0.05 and ** p < 0.01. All experiments were repeated at least three times.
그림 Figure 4. Protective effects of Bio-Peptone^® on cell viability of human dermal fibroblasts (HDF) against UVB-induced cell damage. (A) HDF cells were irradiated UVB at indicated various dose. (B) HDF cells were treated with Bio-Peptone^® at indicated concentration for 24 h and irradiated UVB at 50 mJ/cm2. (C) Photo-micrography by phase-contrast microscopy on cell viabilities against UVB-irradiated HDF cells. Cell viabilities were determined as described in the materials and methods. Values represent the mean normalized cell viability value (mean ± SD, N = 3). The value of untreated cells was taken as 100%. * p < 0.05 and ** p < 0.01. All experiments were repeated at least three times.
그림 Figure 5. Effects of Bio-Peptone^® on type I collagen synthesis of (A) human dermal fibroblasts (HDF) and (B) UVB-irradiated HDF cell line. HDF cells were treated with Bio-Peptone^® at indicated concentration for 24 h (B) and irradiated UVB at 50 mJ/cm2. Type I collagen synthesis were determined as described in the materials and methods using a sandwich immunoassay kit. Values represent the mean normalized value (mean ± SD, N = 3). The value of untreated cells was taken as 100%. * p < 0.05 and ** p < 0.01. All experiments were repeated at least three times.
그림 Figure 6. Inhibitory effects of tyrosinase enzymatic activity with Bio-peptone^®. Arbutin was treated as positive control and Bio-Peptone^® was treated at indicated concentration for 24 h. 100 unit mushroom tyrosinase solution was added. Tyrosinase activity were determined as described in the materials and methods using colormetric methods. Values represent the mean normalized value (mean ± SD, N = 3). The value of untreated cells was taken as 100%. * p < 0.05 and ** p < 0.01. All experiments were repeated at least three times.
그림 Figure 7. Inhibitory effects of Bio-Peptone^® on the IBMX-induced melanin synthesis of melanocyte B16F10 cells. B16F10 were treated with arbutin as positive control and Bio-Peptone^® at indicated concentration for 24 h, stimulated with 0.1 mM of IBMX for additional 48 h. (A) Cellular melanin contents in the melanocyte B16F10 cells. (B) Cultured-cell micro-photographs were taken by phase contrast microscopy for melanin accumulation in B16F10 cells. Values represent the mean melanin contents value (mean ± SD, N = 3). The value of untreated cells was taken as 100%. * p < 0.05 and ** p < 0.01. All experiments were repeated at least three times.

AI 본문요약
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문제 정의

대두발효물을 첨가한 모든 처리군에서 콜라겐 합성이 촉진되었으며, 특히 800 ppm에서는 약 250%에 가까운 콜라겐 합성 촉진효과를 보여주어 유의적인 결과를 나타내었다. 따라서 대두발효물은 피부의 탄력을 증대시키거나 장기적으로 노화로 인한 주름 생성을 방지할 수 있는 소재로서의 가능성을 확인하였다.
따라서 본 연구에서는 유산균인 Lactobacillus Rhamnosus 균주로 대두 단백질을 발효하여 대두발효물(Bio-Peptone®)을 제조하고, 대두발효물이 자외선으로 유도된 피부섬유아세포 손상에 대한 보호 효과 및 콜라겐 생성 촉진 효과, tyrosinase 효소 활성 저해, 멜라닌 색소 과발현 저해에 미치는 영향을 측정하여 광노화 억제 효과를 확인함으로써 자외선에 대한 피부 보호 효과를 갖는 기능성 소재로의 이용 가능성을 검토하였다.
따라서 tyrosinase 활성을 억제시키면 자외선 노출로 인한 멜라닌 색소의 과발현을 억제시킬 수 있다. 본 연구에서는 대두발효물이 멜라닌 생합 성에서 촉매제로 작용하는 tyrosinase 활성 저해 효과를 확인하기 위해 dopachrome의 방법을 이용하여 tyrosinase inhibition assay를 진행하였다(Figure 6). 실험 결과 0 - 2000ppm의 농도에서 농도 의존적으로 tyrosinase 저해 효과가 나타났으며, 500 ppm 이상의 농도에서는 대조군과 비교하였을 때 약 20 - 40%의 저해 효과를 확인하였다.
본 연구에서는 효소 분해 및 발효 과정을 통해 대두발 효물을 제조하여 자외선 조사에 따른 피부 광노화 억제 효과를 확인하고자 UVB 조사에 의한 피부세포 손상 억제 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 멜라닌 색소 생성 억제 효과 및 티로시나아제 발현 억제 효과를 확인하고자 하였다.

제안 방법

PBS를 이용하여 세척하고, 기질용액 (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine, TMBZ)을 처리한 후 상온에서 20 min 반응시키고, stop solution을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Enzyme linked immunosorbent assay 방법으로 측정하여 총 단백질 양으로 보정하여 생성된 type Ⅰ 콜라겐을 계산하였다.
UVB로 유도되는 피부 세포 손상 및 독성에 대한 보호 효과를 확인하기 위해 HDF 세포에 대두발효물을 처리하고 UVB를 조사하여 세포 손상을 유도한 뒤 세포 생존율을 측정하였다. UVB 조사량은 Figure 4A의 결과를 바탕으로 50 mJ/cm² 의 세기로 설정하였다.
대두발효물의 멜라닌 색소 생성 저해 효과를 측정하기 위해 멜라노마 세포인 B16F10에 IBMX를 처리하여 멜라닌 색소 형성을 유도한 뒤, 대두발효물을 처리하여 멜라닌 색소 생성 저해 효과를 측정하였다. 대두발효물은 선행된 결과를 통해 가장 피부 개선 효과가 뛰어난 800 ppm의 농도로 정하여 실험을 진행하였다. Figure 7A에서 IBMX를 첨가한 세포에서 멜라닌 색소가 약 140%로 증가한 반면, IBMX와 대두발효물 800 ppm을 함께 처리한 처리군에서는 멜라닌색소의 생성률이 115%로 감소하여 미백 효과를 나타내었음을 확인하였다.
대두발효물의 type Ⅰ 콜라겐 생합성 촉진 효과를 확인하기 위해 procollagen type Ⅰ C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara Bio, Tokyo, Japan)를 사용하여 type Ⅰ collagen 생성량을 측정하였다. 6-well plate에 배양한 섬유아세포에 시료를 처리한 뒤, 세포 배양액을 회수하였다.
이에 MMPs를 저해하고, 콜라겐 합성을 촉진시킬 수 있는 천연 소재의 개발이 광노화의 해결책으로 제시되고 있다. 대두발효물의 광노화 억제 효과를 알아보기 위해 UVB로 손상된 세포에서의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다. Figure 5B에서 나타난 바와 같이 50 mJ/cm² 의 UVB 조사로 섬유아세포의 콜라겐 합성이 약 40%로 저해된 상황에서도 대두발효물 처리군에 서는 콜라겐 합성이 증가하여 800 ppm에서 92%, 1000 ppm에서 140%로 뛰어난 콜라겐 합성 촉진 효과를 보여주었다.
멜라닌 색소는 극한의 환경으로부터 피부의 저항력을 높이고 자외선으로부터 피부를 보호하는 작용을 하지만, 과도한 멜라닌 생성은 인체에 색소 침착 등의 반응을 일으키며, 피부 손상을 촉진한다[21]. 대두발효물의 멜라닌 색소 생성 저해 효과를 측정하기 위해 멜라노마 세포인 B16F10에 IBMX를 처리하여 멜라닌 색소 형성을 유도한 뒤, 대두발효물을 처리하여 멜라닌 색소 생성 저해 효과를 측정하였다. 대두발효물은 선행된 결과를 통해 가장 피부 개선 효과가 뛰어난 800 ppm의 농도로 정하여 실험을 진행하였다.
배양액을 제거하고, FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지와 대두발효물을 각각 100, 500, 800, 1000, 2000 ppm의 농도로 처리하고 24 h 배양하였다. 대두발효물의 세포 독성은 WST-1 분석법을 변형하여 측정하였다. 흡광도 측정을 위해 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm, 620 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 효과를 대조군에 대한 백분율로 산출하여 세포의 생존비를 계산하였다.
멜라닌 생합성 단계에 관여하는 tyrosinase 저해 활성을 확인하기 위해 tyrosinase inhibition assay를 진행하였다. 양성 대조군으로 미백 효과로 잘 알려진 arbutin을 사용하였으며, 기질로서 인산나트륨 완충용액 (pH 6.
세포 배양기에서 24 h 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고, FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지와 대두발효물을 각각 100, 500, 800, 1000, 2000 ppm의 농도로 처리하고 24 h 배양하였다. 대두발효물의 세포 독성은 WST-1 분석법을 변형하여 측정하였다.
세포 내부에서 합성된 프로콜라겐은 외부로 분비되며 아미노 및 카르복시 말단의 펩티드가 절단되면서 콜라겐 섬유로 중합한다고 보고되어 있고, 분리된 펩티드를 측정함으로써 콜라겐 생합성을 파악할 수 있다[26]. 본 연구에서는 HDF 세포에서 대두발효물에 대한 type Ⅰ 콜라겐의 합성 촉진 효능을 확인하였다 (Figure 5A). 대두발효물을 첨가한 모든 처리군에서 콜라겐 합성이 촉진되었으며, 특히 800 ppm에서는 약 250%에 가까운 콜라겐 합성 촉진효과를 보여주어 유의적인 결과를 나타내었다.
양성 대조군으로 미백 효과로 알려진 arbutin을 사용하였다. 세포는 PBS로 수세하고 현미경(phase contrast microscope, OLYMPUS, Tokyo, Japan)을 이용하여 멜라닌 색소 생성 여부를 관찰하였다. 이후 lysis buffer를 첨가하여 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 얻어진 pellet을 멜라닌 함량 측정에 사용하였다.
cells/well 로 분주하고 37 ℃, 5% CO 2 세포 배양기에서 배양하여 안정화시켰다. 시료를 농도별로 조제하여 0.1 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine; Sigma Aldrich, USA)와 함께 처리한 뒤 48 h 배양하여 세포 내 멜라닌 색소 생성을 유도 하였다. 양성 대조군으로 미백 효과로 알려진 arbutin을 사용하였다.
1% formic acid (Sigma aldrich, USA)가 포함된 증류수 (Burdick & Jackson, Korea)와 아세 토니트릴(Sigma Aldrich, USA) 용매를 용출 용매로 사용하였다. 시험물질의 분자량 확인을 위해서 LS-MS 분석은 positive ion ([M + H]⁺) 모드를 이용하였으며, mass range를 115 ~ 1,500까지 분석 확인하였다.
8)을 혼합하여 37 ℃ 항온기에서 5 min pre-incubating하여 사용하였다. 이후 시료액에 기질용액 L-DOPA를 첨가하여 37 ℃에서 10 min 반응시키고 반응액이 든 시험관을 급냉시켜 반응을 중지시킨 뒤 475 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 tyrosinase 효소 저해 활성을 확인하였다.
대두발효물은 농도별로 처리하여 37 ℃, 5% CO₂세포 배양기에서 24 h 배양하였다. 자외선 조사 직전에 PBS로 수세하고, PBS를 세포가 잠길 정도로 넣은 다음 뚜껑을 열고 조사하였다. 자외선은 UV Lamp (312 nm, VL-6LM, Vilber Lourmat, France)를 이용하였다.
대두는 대표적인 식물성 단백질 식품으로 단백질 함량이 높으며, 적절한 가공법을 통해 생성된 다양한 생리활성 물질은 생리작용을 나타내어 기능성 소재로 개발이 가능 하다[2]. 제조된 대두발효물의 성분 및 분자량을 확인하기 위하여 고분해능 액체크로마토그래피 질량분석기(LC-MS) 장비를 이용하여 LC-MS 분석을 실시하였으며, 그 결과는 Figure 2에 나타내었다. LC-MS를 이용하여 대두발효물에서 얻어진 total ion chromatogram에서는 다양한 피크들이 확인되었으며(Figure 2A), 얻어진 total ion chromatogram의 peak들에 대한 주요 피크들의 분자량은 positive mode에서 [M + H]⁺ 형태로 분석되었다.
조제된 대두발효물은 LTQ Orbitrap XL 질량분석기 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)와 Accela UPLC (Thermo Fisher Scientific, San Jose, USA)를 사용하여 성분 및 분자량을 분석하였다. 분석에 사용한 Column은 Acquity BEC C18 Column (150 × 2 mm, 1.
대두발효물의 세포 독성은 WST-1 분석법을 변형하여 측정하였다. 흡광도 측정을 위해 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm, 620 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 효과를 대조군에 대한 백분율로 산출하여 세포의 생존비를 계산하였다.

대상 데이터

0.1% formic acid (Sigma aldrich, USA)가 포함된 증류수 (Burdick & Jackson, Korea)와 아세 토니트릴(Sigma Aldrich, USA) 용매를 용출 용매로 사용하였다.
배양 배지는 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)과 1% penicillin- streptomycin (100 units/mL)이 함유된 high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Korea)을 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 대두발효물은 Figure 1의 공정으로 제조되었다. 즉 isolated soy protein (Sigma Aldrich, USA)에 pepsin (Sigma Aldrich, USA)을 혼합하여 37 ℃에서 4 h 동안 효소 분해시켜 얻은 soy peptone에 MRS medium에서 종균배양(seed culture)된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus) 균종을 넣고 혼합한 후 35 ℃에서 72 h 이상 배양하여 발효시켰다.
본 실험에 이용한 인간 진피 섬유아세포주인 HDF (human dermal firoblasts)와 멜라닌 세포주인 B16F10 (human epidermal melanocytes)은 Innoprot (Bizkaia, Spain)에서 분양받아 사용하였다. 배양 배지는 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)과 1% penicillin- streptomycin (100 units/mL)이 함유된 high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Korea)을 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하여 사용하였다.
분석에 사용한 Column은 Acquity BEC C18 Column (150 × 2 mm, 1.7 μm, Waters, Dublin, Ireland)을 사용하였다.
1 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine; Sigma Aldrich, USA)와 함께 처리한 뒤 48 h 배양하여 세포 내 멜라닌 색소 생성을 유도 하였다. 양성 대조군으로 미백 효과로 알려진 arbutin을 사용하였다. 세포는 PBS로 수세하고 현미경(phase contrast microscope, OLYMPUS, Tokyo, Japan)을 이용하여 멜라닌 색소 생성 여부를 관찰하였다.
멜라닌 생합성 단계에 관여하는 tyrosinase 저해 활성을 확인하기 위해 tyrosinase inhibition assay를 진행하였다. 양성 대조군으로 미백 효과로 잘 알려진 arbutin을 사용하였으며, 기질로서 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 10 mM L-DOPA (Sigma Aldrich, USA)를 용해한 후 사용하였다. 효소의 활성을 위해 DW, 시료액, 100 unit tyrosinase (Sigma Aldrich, USA), 인산나트륨 완충액(pH 6.
자외선 조사 직전에 PBS로 수세하고, PBS를 세포가 잠길 정도로 넣은 다음 뚜껑을 열고 조사하였다. 자외선은 UV Lamp (312 nm, VL-6LM, Vilber Lourmat, France)를 이용하였다. 자외선 조사 직후 FBS를 포함하지 않는 세포배양액으로 교환해주고 37 ℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다.
8)에 10 mM L-DOPA (Sigma Aldrich, USA)를 용해한 후 사용하였다. 효소의 활성을 위해 DW, 시료액, 100 unit tyrosinase (Sigma Aldrich, USA), 인산나트륨 완충액(pH 6.8)을 혼합하여 37 ℃ 항온기에서 5 min pre-incubating하여 사용하였다. 이후 시료액에 기질용액 L-DOPA를 첨가하여 37 ℃에서 10 min 반응시키고 반응액이 든 시험관을 급냉시켜 반응을 중지시킨 뒤 475 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 tyrosinase 효소 저해 활성을 확인하였다.

데이터처리

모든 분석 자료는 3 회 반복하여 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 대조군과 실험군 사이의 유의성 검정은 SPSS 12.0K (SPSS Inc., Chicago, USA)를 이용하여 t-test와 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.

이론/모형

100 unit mushroom tyrosinase solution was added. Tyrosinase activity were determined as described in the materials and methods using colormetric methods. Values represent the mean normalized value (mean ± SD, N = 3).

성능/효과

대두 발효물에서 확인된 대부분의 피크의 중량 평균 분자량이 100∼500 Da 사이로, 대두단백질이 유산균을 이용한 분해 및 발효공정을 통해 분자량이 낮은 생리활성물질이 생성되었음을 확인할 수 있다.
대두 추출물은 항노화 효과 뿐 아니라 UVB에 의한 염증 반응을 억제하여 자외선으로부터 보호 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다[6]. 대두발효물 또한 UVB에 의해 감소한 세포 생존율을 증가시켰으며, 이는 대두발 효물이 섬유아세포에서 UVB에 대한 세포 손상 및 독성을 감소시켜 세포 사멸을 저해함으로써 UVB로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있다는 것을 시사한다. 더욱이 실험 결과 Figure 3A에서 800 ppm에서 가장 높은 세포 생존률을 보인 것과는 달리 Figure 4에서 1000 ppm에서 가장 높은 세포 생존률을 나타낸 것을 보아 대두발효물은 세포 증식 이외에 또 다른 메커니즘을 통해 자외선에 대한 보호효과를 나타낼 것으로 생각되며, 메커니즘에 대한 더 많은 연구가 앞으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 HDF 세포에서 대두발효물에 대한 type Ⅰ 콜라겐의 합성 촉진 효능을 확인하였다 (Figure 5A). 대두발효물을 첨가한 모든 처리군에서 콜라겐 합성이 촉진되었으며, 특히 800 ppm에서는 약 250%에 가까운 콜라겐 합성 촉진효과를 보여주어 유의적인 결과를 나타내었다. 따라서 대두발효물은 피부의 탄력을 증대시키거나 장기적으로 노화로 인한 주름 생성을 방지할 수 있는 소재로서의 가능성을 확인하였다.
대두는 예로부터 섭취되어 온 체내안전성이 확보된 소재로 기능성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 다양한 연구에 활용되어 왔다[2,3]. 따라서 본 연구에서 제조된 대두 발효물도 HDF 세포와 B16F10 세포 모두에서 세포 독성을 나타내지 않아 대두발효물의 안전성 및 세포증식 효과를 확인하였으며, 이는 곧 대두 발효물의 미용 기능성 소재로서 연구 가능성을 확인할 수 있는 결과이다.
Figure 4B에 나타난 바와 같이 UVB를 조사하지 않은 대조군에 비해 UVB 조사 군에서 약 48%로 세포 생존율이 감소하였으나, UVB 조사 후 대두발효물을 처리한 군에서 세포 생존율이 증가하여 유의적인 세포 생존율을 보여주었다. 또한 현미경을 통해 관찰한 결과에서도 자외선 조사 후 대두발효물을 처리한 군에서 세포 밀집도(cell confluence)가 증가하였으며, 800 -1000 ppm에서 높은 밀집도를 나타내어 자외선에 의한 세포 손상으로부터 보호 효과를 나타내었음을 확인하였다 (Figure 4C). 대두 추출물은 항노화 효과 뿐 아니라 UVB에 의한 염증 반응을 억제하여 자외선으로부터 보호 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다[6].
Figure 7A에서 IBMX를 첨가한 세포에서 멜라닌 색소가 약 140%로 증가한 반면, IBMX와 대두발효물 800 ppm을 함께 처리한 처리군에서는 멜라닌색소의 생성률이 115%로 감소하여 미백 효과를 나타내었음을 확인하였다. 또한 현미경을 통해 멜라닌 색소 생성 저해효과를 관찰한 결과, 대두발효물이 멜라닌 세포에서 멜라닌 색소 생성을 효과적으로 저해한다는 사실을 확인할 수 있었다(Figure 7B).
LC-MS를 이용하여 대두발효물에서 얻어진 total ion chromatogram에서는 다양한 피크들이 확인되었으며(Figure 2A), 얻어진 total ion chromatogram의 peak들에 대한 주요 피크들의 분자량은 positive mode에서 [M + H]⁺ 형태로 분석되었다. 분석 결과 m/z 182.0815 ([M + H]⁺), m/z 166.0865 ([M + H]⁺), m/z 223.1708 ([M + H]⁺), m/z 231.1708 ([M + H]⁺), m/z 245.1867 ([M + H]⁺), m/z 279.1711 ([M + H]⁺) 피크들이 확인되었다(Figure 2B). 대두 발효물에서 확인된 대부분의 피크의 중량 평균 분자량이 100∼500 Da 사이로, 대두단백질이 유산균을 이용한 분해 및 발효공정을 통해 분자량이 낮은 생리활성물질이 생성되었음을 확인할 수 있다.
의 UVB 조사로 콜라겐 합성이 대조군에 비해 약 40%로 저해된 상황에서도 대두발효물을 첨가한 군에서는 콜라겐 합성 효과가 증가하여 콜라겐 합성 촉진 효과를 보여주어 자외선으로부터 피부를 효과적으로 보호하는 광노화 억제 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 tyrosinase 활성을 저해하며, IBMX로 멜라닌 생성을 유도한 세포에서도 멜라닌 색소 합성을 억제함으로써 미백 활성을 확인하였다. 이들 결과로부터 대두발효물은 자외선으로부터 손상된 피부세포를 보호하고 자외선으로 유도되는 피부 주름을 예방하거나 광노화 저해효과를 가지는 천연 미용 기능성 소재로서의 개발 가능성을 나타낸다.
2004년 김선영 등의 연구에 따르면 대두의 isoflavone 은 UV로 유도되는 MMP-1의 분비를 감소시키며, 콜라겐 생성을 촉진하여 광노화 저해 효과를 입증한 바 있다[27]. 상기의 결과를 종합하여 볼 때, 대두발효물은 피부세포에서 콜라겐 합성을 촉진하며, 자외선을 조사한 세포에서도 콜라겐 합성을 유도하여 자외선에 의한 광노화를 예방하여 주름 생성을 효과적으로 저해 시킬 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 대두발효물이 멜라닌 생합 성에서 촉매제로 작용하는 tyrosinase 활성 저해 효과를 확인하기 위해 dopachrome의 방법을 이용하여 tyrosinase inhibition assay를 진행하였다(Figure 6). 실험 결과 0 - 2000ppm의 농도에서 농도 의존적으로 tyrosinase 저해 효과가 나타났으며, 500 ppm 이상의 농도에서는 대조군과 비교하였을 때 약 20 - 40%의 저해 효과를 확인하였다. 이를 통해 대두발효물은 tyrosinase의 활성을 저해시킴으로써 tyrosine으로부터 멜라닌 색소의 생성을 감소시켜 피부 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
인체 피부 섬유아세포에서 농도에 따라 UVB로 유도되는 세포사멸이 감소하여 1000 μg/mL에서는 대조군에 비해 약 80%의 세포 생존율을 보여 주었으며, 또한 50mJ/cm2 의 UVB 조사로 콜라겐 합성이 대조군에 비해 약 40%로 저해된 상황에서도 대두발효물을 첨가한 군에서는 콜라겐 합성 효과가 증가하여 콜라겐 합성 촉진 효과를 보여주어 자외선으로부터 피부를 효과적으로 보호하는 광노화 억제 효과가 있음을 확인하였다.

후속연구

대두발효물 또한 UVB에 의해 감소한 세포 생존율을 증가시켰으며, 이는 대두발 효물이 섬유아세포에서 UVB에 대한 세포 손상 및 독성을 감소시켜 세포 사멸을 저해함으로써 UVB로부터 피부를 효과적으로 보호할 수 있다는 것을 시사한다. 더욱이 실험 결과 Figure 3A에서 800 ppm에서 가장 높은 세포 생존률을 보인 것과는 달리 Figure 4에서 1000 ppm에서 가장 높은 세포 생존률을 나타낸 것을 보아 대두발효물은 세포 증식 이외에 또 다른 메커니즘을 통해 자외선에 대한 보호효과를 나타낼 것으로 생각되며, 메커니즘에 대한 더 많은 연구가 앞으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.
뿐만 아니라 tyrosinase 활성을 저해하며, IBMX로 멜라닌 생성을 유도한 세포에서도 멜라닌 색소 합성을 억제함으로써 미백 활성을 확인하였다. 이들 결과로부터 대두발효물은 자외선으로부터 손상된 피부세포를 보호하고 자외선으로 유도되는 피부 주름을 예방하거나 광노화 저해효과를 가지는 천연 미용 기능성 소재로서의 개발 가능성을 나타낸다.
이를 통해 대두발효물은 tyrosinase의 활성을 저해시킴으로써 tyrosine으로부터 멜라닌 색소의 생성을 감소시켜 피부 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	파장의 길이에 따라 자외선이 피부에 끼치는 영향은 어떻게 달라지는가?	지표면에 도달하는 자외선의 대부분은 UVA이며, UVB는 오존층 및 대기층에서 대부분 흡수되고 10% 정도만 지구표면에 도달한다. UVC는 오존층에서 차단되어 지표면에 도달하지 않아 피부에 영향을 주지 않는다[11]. 또한 광선의 파장이 길수록 피부 속으로 더 깊이 투과한다. 피부의 두께에 따라 차이가 있지만, UVB는 강한 에너지를 가지고 있으나 파장이 짧기 때문에 주로 표피와 상부 진피까지 침투되어 영향을 미치는 반면, UVA는 긴 파장으로 하부 진피에 영향을 미칠 수 있다[12,13].
	대두의 효능은 무엇인가?	대두는 건물 중 40∼48%의 단백질을 함유하고 있는 식물성 단백질 공급원이며, 체내 안전성이 확보된 식물성 소재로 다양한 기능성 연구에 활용되고 있다[2,3]. 최근 연구에서는 대두가 영양성분 이외에도 심혈관 질환, 당뇨, 비만 등에 효과가 있을 뿐 아니라 콜라겐 생성, 멜라닌 억제, 항염증 및 항노화와 같은 피부 개선 기능성이 보고되어 대두에 대한 관심이 지속적으로 증가하고 있다[4-6].
	대두(Glycine max)란 무엇인가?	대두(Glycine max)는 식물성 단백질이 풍부한 식품 중 하나로, 생리활성물질을 다량 함유하고 있어 심혈관질환, 비만 등에 효능이 있을 뿐 아니라 피부 개선 효과도 있는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 대두 단백질을 유산균인 Lactobaillus Rhamnosus 균주에 의해 발효한 대두발효물의 광노화 예방 효과를 조사하기 위해 자외선으로부터 기인한 세포독성에 대한 보호 효과 및 콜라겐 생성, 티로시나아제 활성, 멜라닌 색소 생성에 대한 평가를 실시하였다.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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