[논문]Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병 발생

송민아; 최인영; 송정흡; 이귀재; 신현동

doi:10.5423/rpd.2019.25.1.33

Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병 발생
Ocurrence of Clubroot Caused by Plasmodiophora brassicae on Kohlrabi in Korea 원문보기

Research in plant disease = 식물병연구, v.25 no.1, 2019년, pp.33 - 37

송민아 (제주도농업기술원) , 최인영 (전라북도농업기술원) , 송정흡 (제주도농업기술원) , 이귀재 (전북대학교 환경생명자원대학) , 신현동 (고려대학교 환경생태공학부)

초록
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2016년부터 2018년까지 제주도내 농가포장에서 재배되고 있는 콜라비에 뿌리혹병 지속적으로 발생(최고발병률 27.2%)했다. 초기 감염은 뿌리털 부분이 정상주 뿌리털에 비해 비대했으며, 병이 진전되면서 뿌리 중심부에 혹이 형성되고, 잎이 시들고 끝이 누렇게 변했다. P. brassicae 휴면포자 현탁액을 이용한 병원성 검정결과 접종 50일 후에 병원성을 나타냈다. 병원균은 콜라비 세포조직 안에 빈 곳 없이 무수히 많은 휴면포자를 형성하며, 휴면포자는 단세포로 무색, 원형 또는 타원형, 크기는 직경 $3-5{\mu}m$이다. 콜라비 뿌리혹병원균의 ITS rDNA 염기서열 분석, 계통수 작성 결과 P. brassicae로 동정했다. 따라서 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 'Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병'으로 명명하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

From 2016 to 2018, approximately 15% of kohlrabi were observed displaying significant clubroot symptoms in farmer's fields in Jeju, Korea. The initial infection appeared as hypertrophy of root hairs, and as the disease progressed, galls formation occurred on the main roots, finally disease progress resulted in yellowing and wilting of leaves. Pathogenicity was proven by artificial inoculation of plants with resting spore suspension, fulfilling Koch's postulates. The resting spore is one-celled, spherical and subspherical, colorless, and $3-5{\mu}m$ in diameter. On the basis of the morphological characteristics and phylogenetic analyses of internal transcribed spacer rDNA, the causal agent was identified as Plasmodiophora brassicae. To our knowledge, this is the first report on the occurrence of P. brassicae on kohlrabi in Korea.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Typical clubroot symptoms naturally infected kohlrabi caused by Plasmodiophora brassicae. (A) The infected crop showing wilt symptoms and plants loss. (B) Galls produced on the roots. (C) Close-up of clubroot symptoms. Clubroot for 50 days after inoculation with resting spores suspension for pathogenicity test.
그림 Fig. 2. Scanning electron and light micrographs of immature and mature resting spores in clubroot of kohlrabi. (A-E) Resting spores inside cell tissues in clubroot galls. (F) Resting spores released from cell tissues.
그림 Fig. 3. Phylogenetic tree obtained through the neighbor-joining method using the MEGA 6.06 program based on the internal transcribed spacer ribosomal DNA (rDNA) sequence of our isolate of Plasmodiophora brassicae, and that of other fungi retrieved from GenBank. The numbers above the nodes are the bootstrap values obtained from 1,000 replicates. The isolates obtained in this study are shown in boldface.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 ‘Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병’으로 명명하고자 한다.
따라서 발병 및 병징, 병원성 검정, 균학적 특징 및 염기서열 분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 ‘Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병’으로 명명하고자 한다.
이병주에서 발생한 뿌리혹병의 균학적 특성 및 rDNA 염기서열 분석을 기초로 ‘Plasmodiophora brassicae’로 동정하였고, 콜라비 유묘에 인공 접종하여 병원성을 확인하였다. 따라서 본 연구는 콜라비 뿌리혹병의 발병 및 병징, 병원성 검정, 균학적 특징 및 염기서열 분석결과에 대하여 보고한다.

제안 방법

병원성 검정을 위한 휴면포자의 현탁액은 콜라비에 형성된 뿌리혹에서 Cho 등(2003), Williams (1966)의 방법을 변형하여 추출한 후 사용하였다. 4℃에서 2개월간 보관된 콜라비 뿌리혹에 휴면포자가 들어있는지를 현미경으로 확인한 후, 뿌리혹 40 g에 멸균수 50 ml을 넣고 유발과 유봉을 사용하여 마쇄하였다. 마쇄된 현탁액은 3장의 거즈로 찌꺼기를 걸렀으며, 추출된 현탁액은 2,500 rpm에서 5분동안 원심 분리하였다.
5% agarose gel에서 분리한 후 PCR purification kit (Core-one^TM, Core-bio, Korea)를 사용하였다. ABI 3130 auto sequencer를 이용하여 ITS1과 ITS4의 염기서열을 분석하였으며, ITS rDNA 염기서열은 GenBank database (National Centre for Biotechnology Information [NCBI], US National Institute of Health Bethesda, http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)에서 확인하였다. 계통학적 분석은 MEGA 6.
DIC (differential interference contrast) 모듈이 장착된 광학현미경(AXIO, Zeiss)의 관찰을 위해 -20℃로 설정된 cryomicrotome (Leica cryostat CM3050S, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 20 µm 두께로 절편을 제작한 후, 슬라이드 글라스에 올려놓고 400에서 1,000배로 관찰하였다.
뿌리혹이 형성된 콜라비 뿌리 1 g을 액체질소를 넣고 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의　internal transcribed spacer (ITS) 영역을 분석하기 위해 ITS1/ITS4 primer를 사용하여 PCR로 증폭했으며(White 등, 1990), 증폭된 산물은 정제를 위해 1.5% agarose gel에서 분리한 후 PCR purification kit (Core-one^TM, Core-bio, Korea)를 사용하였다. ABI 3130 auto sequencer를 이용하여 ITS1과 ITS4의 염기서열을 분석하였으며, ITS rDNA 염기서열은 GenBank database (National Centre for Biotechnology Information [NCBI], US National Institute of Health Bethesda, http://blast.
또한 형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 보완하기 위하여 염기서열 분석을 하였다. 뿌리혹이 형성된 콜라비 뿌리 1 g을 액체질소를 넣고 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.
병원균의 균학적 특징 및 rDNA의 ITS 염기서열 분석. 병원균의 형태적 특징은 뿌리혹이 형성된 콜라비 뿌리를 직접 절단하여 주사전자현미경(JSM-5410LV; JEOL, Japan)과 광학현미경으로 관찰하였다. DIC (differential interference contrast) 모듈이 장착된 광학현미경(AXIO, Zeiss)의 관찰을 위해 -20℃로 설정된 cryomicrotome (Leica cryostat CM3050S, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 20 µm 두께로 절편을 제작한 후, 슬라이드 글라스에 올려놓고 400에서 1,000배로 관찰하였다.
병원성 검정. 병원성 검정을 위한 휴면포자의 현탁액은 콜라비에 형성된 뿌리혹에서 Cho 등(2003), Williams (1966)의 방법을 변형하여 추출한 후 사용하였다. 4℃에서 2개월간 보관된 콜라비 뿌리혹에 휴면포자가 들어있는지를 현미경으로 확인한 후, 뿌리혹 40 g에 멸균수 50 ml을 넣고 유발과 유봉을 사용하여 마쇄하였다.
또한 형태적 특징을 기초로 한 병원균의 동정을 보완하기 위하여 염기서열 분석을 하였다. 뿌리혹이 형성된 콜라비 뿌리 1 g을 액체질소를 넣고 마쇄한 후, DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의　internal transcribed spacer (ITS) 영역을 분석하기 위해 ITS1/ITS4 primer를 사용하여 PCR로 증폭했으며(White 등, 1990), 증폭된 산물은 정제를 위해 1.
이병주에서 발생한 뿌리혹병의 균학적 특성 및 rDNA 염기서열 분석을 기초로 ‘Plasmodiophora brassicae’로 동정하였고, 콜라비 유묘에 인공 접종하여 병원성을 확인하였다.
병원성 검정을 위한 콜라비(품종 아삭콜)는 72구 모종트레이에 종자를 파종하여 포트에서 10일간 생육된 15개체를 사용하였다. 접종 방법은 포트에서 생육 중인 10개체의 뿌리 부분에 5-10 cm 정도 구멍을 내고 접종원 20 ml를 부었으며, 대조구는 5개체에 멸균수를 동일한 방법으로 부었다. 접종한 모든 식물체를 18-25℃로 유지되는 유리온실에서 관리하였으며, 식물체가 마르지 않도록 정기적으로 관수를 하였다.
접종 방법은 포트에서 생육 중인 10개체의 뿌리 부분에 5-10 cm 정도 구멍을 내고 접종원 20 ml를 부었으며, 대조구는 5개체에 멸균수를 동일한 방법으로 부었다. 접종한 모든 식물체를 18-25℃로 유지되는 유리온실에서 관리하였으며, 식물체가 마르지 않도록 정기적으로 관수를 하였다. 휴면포자가 접종된 콜라비는 50일 이후부터 시들기 시작하였으며, 뿌리부분에는 포장에서 관찰된 모습과 동일한 혹이 형성되었고, 다량의 휴면포자가 관찰되었다.

대상 데이터

발병 및 병징. 2016년부터 2018까지 제주도내 농가포장에서 재배되고 있는 콜라비에 뿌리혹병이 지속적으로 발생하였다. 콜라비 재배농가는 뿌리혹병을 매년 발생하는 것으로 인식하고 있었다.
2016년부터 2018년까지 제주도내 농가포장에서 재배되고 있는 콜라비에 뿌리혹병 지속적으로 발생(최고발병률 27.2%)했다. 초기 감염은 뿌리털 부분이 정상주 뿌리털에 비해 비대했으며, 병이 진전되면서 뿌리 중심부에 혹이 형성되고, 잎이 시들고 끝이 누렇게 변했다.
2016부터 2018년도에 제주도 농가포장에서 재배되고 있는 콜라비(품종 콜리브리)에서 시듦 증상이 나타났다. 시듦 증상을 보이는 개체는 뿌리에 혹을 형성하였다.
2 × 10⁸ spores/ml이었다. 병원성 검정을 위한 콜라비(품종 아삭콜)는 72구 모종트레이에 종자를 파종하여 포트에서 10일간 생육된 15개체를 사용하였다. 접종 방법은 포트에서 생육 중인 10개체의 뿌리 부분에 5-10 cm 정도 구멍을 내고 접종원 20 ml를 부었으며, 대조구는 5개체에 멸균수를 동일한 방법으로 부었다.

데이터처리

cgi)에서 확인하였다. 계통학적 분석은 MEGA 6.06 program을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 작성하였으며, 염기서열의 유전자 거리는 Tamura-Nei parameter model로 계산하였고, bootstrap analysis은 1,000반복으로 수행하였다(Tamura 등, 2013).
DIC (differential interference contrast) 모듈이 장착된 광학현미경(AXIO, Zeiss)의 관찰을 위해 -20℃로 설정된 cryomicrotome (Leica cryostat CM3050S, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 20 µm 두께로 절편을 제작한 후, 슬라이드 글라스에 올려놓고 400에서 1,000배로 관찰하였다. 휴면포자의 형태와 크기(n=50) 등은 AxioVision LE Module Interactive Measurement (Zeiss) 프로그램을 이용하여 측정하였다.

성능/효과

brassicae의 ITS 영역의 길이는 547 bp로 NCBI의 GenBank 등록번호는 MH762161이다. NCBI에서 Blastn search한 결과 캐나다의 카놀라(Canola)와 스위스의 백겨자(Sinapis alba)에서 P. brassicae로 등록된 GenBank accession number KY628944, KY628950, KY628953, EF195335와 100% 상동성을 보였다. 또한 우리나라의 지역별(강릉, 연천, 대전, 해남, 서산, 평창, 횡성)로 수집되어 P.
또한, 식용으로 하는 줄기 부분의 발달이 빈약하여 상품성이 없었다. 그러나 생육 후기에 감염된 개체는 뿌리털 부분에만 감염되어 정상적인 개체와 차이가 없었으며, 시듦 증상이 덜했다. 콜라비 뿌리혹병에 감염된 시료는 고려대학교 진균표본실에 기탁하였다(KUS-F30866).
brassicae로 등록된 GenBank accession number KX430457- KX430462, KX430464-KX430465와 99% 상동성을 보였다. 또한 계통수 작성 결과 콜라비 뿌리혹병의 ITS 염기서열(MH7621691)은 캐나다와 스위스, 그리고 우리나라 각 지역에서 수집된 P. brassicae와 같은 계통으로 분류되었다(Fig. 3).
brassicae로 등록된 GenBank accession number KY628944, KY628950, KY628953, EF195335와 100% 상동성을 보였다. 또한 우리나라의 지역별(강릉, 연천, 대전, 해남, 서산, 평창, 횡성)로 수집되어 P. brassicae로 등록된 GenBank accession number KX430457- KX430462, KX430464-KX430465와 99% 상동성을 보였다. 또한 계통수 작성 결과 콜라비 뿌리혹병의 ITS 염기서열(MH7621691)은 캐나다와 스위스, 그리고 우리나라 각 지역에서 수집된 P.
콜라비 재배농가는 뿌리혹병을 매년 발생하는 것으로 인식하고 있었다. 뿌리혹병은 정식 후 30일부터 발생하기 시작하였으며, 재배기간 중 수분이 많고 토양 온도가 상승하는 3월에 최고발병률(27.2%)을 보였다. 농가포장에서 재배되는 품종간의 발병률 차이는 없었으며, ‘콜리브리’와 ‘아삭콜’에서 모두 발병하였다(Fig.
‘순무양배추’ 또는 ‘구경양배추’라고도 하며, 양배추와 순무를 교배시킨 채소이다. 열량이 낮고 섬유질이 풍부해서 다이어트와 변비 개선에 좋으며, 수분과 비타민 C 함유량이 높아 피로 해소, 노화 방지, 당뇨 예방에 효과적이다. 비대한 줄기는 샐러드나 생식용, 채로 썰어서 피클이나 물김치로, 잎은 쌈채소나 녹즙 등으로 이용된다(Lee 등, 2010).
병원균은 콜라비 세포조직 안에 빈 곳 없이 무수히 많은 휴면포자를 형성하며, 휴면포자는 단세포로 무색, 원형 또는 타원형, 크기는 직경 3-5 µm이다. 콜라비 뿌리혹병원균의 ITS rDNA 염기서열 분석, 계통수 작성 결과 P. brassicae로 동정했다. 따라서 균학적 특징, 병원성 검정, ITS rDNA 염기서열 비교분석 등의 결과를 바탕으로 이 병은 우리나라에서 지금까지 보고되지 않은 ‘Plasmodiophora brassicae에 의한 콜라비 뿌리혹병’으로 명명하고자 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	콜라비란 무엇인가?	gongylodes L.)는 십자화과(Brassicaceae) 배추속(Brassica)에 속한다. ‘순무양배추’ 또는 ‘구경양배추’라고도 하며, 양배추와 순무를 교배시킨 채소이다. 열량이 낮고 섬유질이 풍부해서 다이어트와 변비 개선에 좋으며, 수분과 비타민 C 함유량이 높아 피로 해소, 노화 방지, 당뇨 예방에 효과적이다.
	P. brassicae의 생활사는 무엇인가?	휴면포자는 토양 내에서 오랫동안 살아남을 수 있도록 내구성이 갖추어져 있다. 이들 휴면포자는 1차 유주포자(primary zoospore)를 방출한다. 1차 유주포자가 식물체 뿌리털 표면에 접근하여 세포벽을 관통한다. 이 단계를 뿌리털감염 단계라고 한다. 뿌리털 안에서는 병원균이 1차 변형체(primary plasmodia)를 형성한다. 변형체 안에서는 핵분열이 동시에 일어나고, 이어서 유주포자낭(zoosporangia)으로 분열한다. 각각의 유주포자낭 안쪽에 4-16개의 2차 유주포자(secondary zoospore)가 형성되어 토양에 방출하게 된다. 2차 유주포자는 뿌리의 피질층에 침투하는데 이를 피질감염(cortical infection)이라고 한다. 침입한 뿌리 세포 내에서 병원균은 세포 비대와 관련된 2차 변형체(secondary plasmodia)로 진행되고 그 다음은 조직 내에서 혹이 형성된다. 변형체는 마침내 휴면포자의 새로운 세대로 발전하여 토양 내에서 살아간다(Devos 등, 2005; Kageyama와 Asano, 2009).
	P. brassicae의 기주식물은 무엇인가?	P. brassicae의 기주식물은 뿌리털과 피질층(cortical stage)을 가지고 있는 십자화과가 대부분으로 그 중에 꽃양배추(Brassica oleracea)의 여러 품종, 서양 채소류(방울다다기양배추, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워, 케일, 콜라비), 순무류(순무, 순무평지), 동양 엽채류(배추), 그리고 유채, 머스터드, 겨자, 갓, 무, 꽃무, 애기장대 등이다(Dixon, 2009).

참고문헌 (16)

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Choi, I. Y., Kim, J., Ju, H. J., Park, J. H. and Shin, H. D. 2015. First report of Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum on kohlrabi in Korea. Res. Plant Dis. 21: 27-31.
Devos, S., Vissenberg, K., Verbelen, J. P. and Prinsen, E. 2005. Infection of chinese cabbage by Plasmodiophora brassicae leads to a stimulation of plant growth: impacts on cell wall metabolism and hormone balance. New phytol. 166: 241-250.

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Suwabe, K., Tsukazaki, H., Iketani, H., Hatakeyama, K., Fujimura, M., Nunome, T. et al. 2003. Identification of two loci for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae Woronin) in Brassica rapa L. Theor. Appl. Genet. 107: 997-1002.

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Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. and Kumar, S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729.

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The Korean Society of Plant Pathology. 2009. List of plant disease in Korea. 5th ed. The Korean Society of Plant Pathology, Suwon, Korea. 853 pp.
White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungi ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR - Protocols and Applications - A Laboratory Manual, eds. by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninski and T. J. White, pp. 315-322. Academic Press, San Diego, CA, USA.
Williams, P. H. 1966. A system for the determination of races of Plasmodiophora brassicae that infect cabbage and rutabaga. Phytopathology 56: 624-626.

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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