[논문]황칠나무 추출물의 항산화 및 간세포보호효과

이창용; 양민혜; 문전옥

황칠나무 추출물의 항산화 및 간세포보호효과
Antioxidant and Hepatoprotective Effects of the Ethanol Extract of Dendropanax morbifera Leveille on the t-Butyl Hydroperoxide-Induced HepG2 Cell Damages 원문보기

생약학회지, v.50 no.1, 2019년, pp.32 - 36

이창용 (부산대학교 약학대학) , 양민혜 (부산대학교 약학대학) , 문전옥 (부산대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Dendropanax morbifera Leveille, an endemic species in Korea, is best known as a tree that produces a resinous sap. Although D. morbifera is used in folk medicine for various diseases, its active ingredients are largely unknown. In this study, we investigated antioxidative activities of ethanolic extracts of three parts of this plant including leaves, debarked stems, and roots. The root extracts exhibited strong 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH) scavenging activity compared with leaf or stem extracts. The root extracts showed hepatoprotective activity against t-butyl hydroperoxide-induced HepG2 cells, and reduced the ROS level in the cells. The root fractions lowered the mRNA level of COX-2 on lipopolysaccharide-stimulated Raw246.7 cells. These results suggest that ethanolic root extracts of D. morbifera are a source of antioxidant and hepatoprotective compounds, which indicate a potential for a botanical drug.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Effect of Dendropanax morbifera root (A), stem (B), and leaf (C) extracts on HepG2 cell damage induced by t-BHP. Cell viability was assessed using MTT assays. Data shown represent means ± standard deviation of triplicate experiments.
표 Table I. Effects of the ethanolic extracts from Dendropanax morbifera on DPPH radical scavenging activity
그림 Fig. 2. Effects of Dendropanax morbifera root (A), stem (B), and leaf (C) extracts on cellular reactive oxygen species (ROS) levels. HepG2 cells were treated with 30 μM t-BHP and loaded with 2',7'-dichlorofluorescin-acetate (DCFDA). Levels of ROS were measured with DCF fluorescence and expressed as fluorescence intensity compared to control.
그림 Fig. 3. Effects of Dendropanax morbifera root extracts on COX-2 mRNA expression after lipopolysaccaride (LPS) treatment. RT-PCR was performed to measure COX-2 mRNA expression in Raw264.7 cells.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 간기능개선을 목적으로 민간에서 사용되고 있는 황칠나무를 잎, 줄기, 뿌리 분획으로 나누어 각각 에탄 올로 추출하여 그 추출물의 항산화효과와 간세포보호효과 와의 관계를 비교 검토한 것이다. 황칠나무의 추출물은 높은 항산화효과를 보였는데 그 세기는 뿌리, 줄기와 잎의 순이었다.
본 연구에서는 간보호효과를 지닌 유효성분을 규명하기 위한 연구의 일환으로 황칠나무의 잎, 줄기 및 뿌리를 에탄 올을 사용하여 따로 추출하고, 이들 에탄올 추출분획을 이 용하여 각 분획의 항산화활성을 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 포촉능을 사용하여 비교 검토하였다. 간세 포주를 이용하여 t-butyl hydroperoxide(t-BHP)로 유도된 세포상해에 대하여 황칠나무 추출물이 간세포 보호 기능효과를 발휘하는지를 비교 검토하였다.

제안 방법

8) 에탄올에 농도를 달리한 황칠나무 추출물 100 μl와 100 μM DPPH용액 100 μl를 96 well plate에 혼합하여 30분간 실온에 차광시켜 방치시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
9) Cell viability는 1 mg/ml의 MTT solution 을 각 well당 50 μl씩 주입하여 37o C에서 4시간 동안 재배 양한 후 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다.
DPPH 라디칼 소거능 − 황칠나무 추출물의 항산화능은 DPPH라디칼에 대한 환원력으로 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거능 측정 − 항산화능은 DPPH라디칼에 대한 환원력으로 측정하였다.
5o C에서 1분 (35 cycles), 72^o C에서 1분(1 cycles), 72^o C에서 5분(1 cycle) 반응시켰다. PCR 산물은 ethidium bromide를 첨가한 agarose gel에 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정 도를 구했다. 밴드의 강도는 UV light illumination(Gel Doc/ ChemiDoc imager, Azure) 소프트웨어에 의해 정량분석 하 였다.
PCR은 PromegaGoTaq FlexiDNA Polymerase PCR kit를 사용하여 1 μg cDNA와 GAPDH(forward: 5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′, reverse: 5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′), COX-2(forward: 5′-CCA GAG CAG AGA GAT GAA ATA CCA-3′, reverse: 5′-GCA GGG CGG GAT ACA GTT C-3′) Primer (Bioneer, 대전)를 포함하는 20 μl 반응액으로 수행하였다.
t-BHP 유도 세포 독성에 대한 간세포보호효과 검토 − 96 well plate에 HepG2 cells을 1×104 cells/ml로 seeding하여 24시간 37o C에서 배양한 후 세포가 잘 부착되면, 황칠나무 추출물을 농도별로 4시간 전 처리한 후 t-BHP(30 μM)로 3시간 처리하였다.
본 연구에서는 간보호효과를 지닌 유효성분을 규명하기 위한 연구의 일환으로 황칠나무의 잎, 줄기 및 뿌리를 에탄 올을 사용하여 따로 추출하고, 이들 에탄올 추출분획을 이 용하여 각 분획의 항산화활성을 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 포촉능을 사용하여 비교 검토하였다. 간세 포주를 이용하여 t-butyl hydroperoxide(t-BHP)로 유도된 세포상해에 대하여 황칠나무 추출물이 간세포 보호 기능효과를 발휘하는지를 비교 검토하였다.
PCR 산물은 ethidium bromide를 첨가한 agarose gel에 전기영동한 후 자외선 광으로 유전자 발현정 도를 구했다. 밴드의 강도는 UV light illumination(Gel Doc/ ChemiDoc imager, Azure) 소프트웨어에 의해 정량분석 하 였다. ¹¹⁾
12) 본 실험에서도 최종 농도가 30 μM이 되게 t-BHP를 3시간 처리하였을 때의 cell viability는 대조군의 약 50%정도로 감소하였다. 이때 농도를 달리한 황칠나무의 뿌리, 줄기 및 잎 추출물을 4 시간 전처리하여 t-BHP의 간세포주에 대한 세포 독성에 미치는 영향을 각각 살펴보았다. 대조군의 cell viability를 100%로 보고 t-BHP 처리군의 cell viability를 0으로 하여 비교하였을 때, 뿌리 추출물은 농도의존적으로 세포보호효과를 나타내었으며 50, 100, 150 및 200 μg/ml를 전처리하였을 경우 각각 15.
황칠나무 추출 − 건조된 황칠나무의 뿌리(143.8 g), 잎 (77.0 g), 줄기(291.3 g)를 각각 95% EtOH 2 L씩 2 회 반복하여 초음파 추출하였다.

대상 데이터

A260/A280 nm의 비율이 1.8~2.0 범위 내의 값을 갖는 RNA를 0.2 μg/μl로 정량하여 total RNA 시료로 실험에 사용하였다.
2 μg/μl로 정량하여 total RNA 시료로 실험에 사용하였다. cDNA 합성은 iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하였고. PCR은 PromegaGoTaq FlexiDNA Polymerase PCR kit를 사용하여 1 μg cDNA와 GAPDH(forward: 5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′, reverse: 5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′), COX-2(forward: 5′-CCA GAG CAG AGA GAT GAA ATA CCA-3′, reverse: 5′-GCA GGG CGG GAT ACA GTT C-3′) Primer (Bioneer, 대전)를 포함하는 20 μl 반응액으로 수행하였다.
t-BHP, DPPH, 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFDA), lipopolysaccharide(LPS), 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromides(MTT)와 Trolox는 Sigma-Aldrich사에서 구입하여 사용하였다.
기기 및 시약 − 세포배양에서 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지와 fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin 용액은 Hyclone 제품을 구입해 사용하였다.
세포주배양 − HepG2 cells과 Raw264.7 cells은 한국 세포 주 은행에서 구입하여 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용된 황칠나무(Dendropanax morbifera Leveille)는 2017년 보길도에서 채취한 것을 구입하여 사용하였으며, 양민혜(부산대학교 약학대학) 교수가 감별하였고, 표본(PNU-0051)은 부산대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관 중이다.

데이터처리

통계분석 − 실험결과의 통계적인 유의성은 Student’s t-test 로 분석하였으며 p value가 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

Effect of Dendropanax morbifera root (A), stem (B), and leaf (C) extracts on HepG2 cell damage induced by t-BHP. Cell viability was assessed using MTT assays. Data shown represent means ± standard deviation of triplicate experiments.

성능/효과

12) 본 실험에서도 최종 농도가 30 μM이 되게 t-BHP를 3시간 처리하였을 때의 cell viability는 대조군의 약 50%정도로 감소하였다.
7 cells은 murine 마크로파지 계통의 세 포로서 LPS 등의 자극에 의해 염증성 인자의 분비를 상승시킨다. ¹⁴⁾ 본 실험에서 LPS로 Raw264.7 cells을 자극하였을 때 염증성 단백질인 COX-2의 mRNA 발현량을 증가시키는 데 반해서 뿌리 추출물을 전 처리하였을 경우 COX-2의 mRNA 발현양이 감소되는 것을 알 수 있다(Fig. 3). 이 결과는 황칠나무의 뿌리 추출물이 간에서 항염증효과를 나타낼 가능성을 보여준다.
황칠나무의 추출물은 높은 항산화효과를 보였는데 그 세기는 뿌리, 줄기와 잎의 순이었다. 각 추출물의 간세포보호효과를 검토한 결과 특히 뿌리 분획의 효과가 큰 것으로 나타났는데 이는 뿌리 추출 물의 간세포내의 ROS 생성 억제능과도 일치하는 결과를 보였다. 잎과 줄기는 뿌리와 비교할 때 간세포보호효과가 상대적으로 크지 않은 것으로 보인다.
대조군의 cell viability를 100%로 보고 t-BHP 처리군의 cell viability를 0으로 하여 비교하였을 때, 뿌리 추출물은 농도의존적으로 세포보호효과를 나타내었으며 50, 100, 150 및 200 μg/ml를 전처리하였을 경우 각각 15.5, 26.7, 49.3 및 80.5%의 세포보호효과 를 보였다(Fig. 1A).
대표적인 라디칼 소거제인 Trolox의 IC50이 15.80 μM인 실험계에서 황칠나무의 뿌리(DMR), 줄기(DMS) 및 잎(DML) 추출물의 IC50은 각각 40.74, 52.74, 108.98 μg/ml로서 세 분획 모두 DPPH라디칼 소거능을 보이고 있으나 뿌리 추출물의 라디칼 소거능이 가장 높았다(Table I).
3). 이 결과는 황칠나무의 뿌리 추출물이 간에서 항염증효과를 나타낼 가능성을 보여준다.
1B와 1C) 뿌리 추출물의 결과와 비교할 때 상대적으로 그 효과가 약한 것을 알 수 있었다. 이 결과를 근거로 할 때, 황칠나무 추출물의 간세포보호효과는 뿌리 분획에 포함되어 있는 유효 성분이 가장 큰 기여를 할 가능성이 제시되었다.
3 g)를 각각 95% EtOH 2 L씩 2 회 반복하여 초음파 추출하였다. 이를 진공농축기를 이용하여 감압 하에 농축한 결과, 황칠나무 뿌리 추출물(0.8 g, 수율 0.6%), 잎 추출물(5.8 g, 수율 7.5%), 줄기 추출물(1.1 g, 수율 0.4%) 을 얻었다. 각 추출물은 사용 용도에 따라 DMSO 또는 에탄올에 녹여 사용하였다.
1A). 줄기와 잎의 추출물을 전 처리한 후 tBHP를 처리하였을 경우에도 추출물의 농도가 높아짐에 따라 세포보호효과는 상승하였으나(Fig. 1B와 1C) 뿌리 추출물의 결과와 비교할 때 상대적으로 그 효과가 약한 것을 알 수 있었다. 이 결과를 근거로 할 때, 황칠나무 추출물의 간세포보호효과는 뿌리 분획에 포함되어 있는 유효 성분이 가장 큰 기여를 할 가능성이 제시되었다.

후속연구

²⁾ 잎 추출물이 생식샘 저하증³⁾에 효과가 있고, 항비만 , ⁴⁾ 면역기능개선⁵⁾과 파킨슨질환 개선⁶⁾에 효과가 있을 가능성도 보고되었다. 또한 항산화 효과, 항염증효과, 항혈소판 응집효과와 항암효과를 지님에 따라 갱년기 여성장애에 도움을 줄 수 있는 천연물으로의 개발 가능성을 제시하고 있다. ⁶⁾
잎과 줄기는 뿌리와 비교할 때 간세포보호효과가 상대적으로 크지 않은 것으로 보인다. 민간에서 널리 사용되는 황칠나무의 간보호효과를 검토할 때, 우선적으로 뿌리에 포함된 유효성분의 규명이 간보호 효과를 지닌 건강기능성 식품의 개발에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	황칠나무(Dendropanax morbifera Leveille)는 무엇인가?	황칠나무(Dendropanax morbifera Leveille)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 상록활엽수로 우리나라의 제주도와 전남도서지역에서 자생하고 있다. 황칠나무의 껍질에 상처를 낼 때 분비되는 황색 수액은 예로부터 목공예품의 고급 도료로 사용해 왔고 민간에서 잎은 차로, 황칠나무의 추출물은 혈행개선, 면역력강화, 당뇨병 등에 약재로 사용해 왔다.
	황칠나무의 추출물은 어떤 용도로 사용되어 왔는가?	황칠나무(Dendropanax morbifera Leveille)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 상록활엽수로 우리나라의 제주도와 전남도서지역에서 자생하고 있다. 황칠나무의 껍질에 상처를 낼 때 분비되는 황색 수액은 예로부터 목공예품의 고급 도료로 사용해 왔고 민간에서 잎은 차로, 황칠나무의 추출물은 혈행개선, 면역력강화, 당뇨병 등에 약재로 사용해 왔다.
	황칠나무의 추출물은 분획에 따라 간세포보호효과가 어떻게 달라지는가?	본 연구는 간기능개선을 목적으로 민간에서 사용되고 있는 황칠나무를 잎, 줄기, 뿌리 분획으로 나누어 각각 에탄올로 추출하여 그 추출물의 항산화효과와 간세포보호효과와의 관계를 비교 검토한 것이다. 황칠나무의 추출물은 높은 항산화효과를 보였는데 그 세기는 뿌리, 줄기와 잎의 순이었다. 각 추출물의 간세포보호효과를 검토한 결과 특히 뿌리 분획의 효과가 큰 것으로 나타났는데 이는 뿌리 추출물의 간세포내의 ROS 생성 억제능과도 일치하는 결과를 보였다. 잎과 줄기는 뿌리와 비교할 때 간세포보호효과가 상대적으로 크지 않은 것으로 보인다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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