To investigate the effect of Bombycis Corpus on male osteoporosis, we performed Dual Energy X-Ray Absorptiometry(DEXA) and histochemical methods. The animals were used ICR-based male mice of 8 weeks and 50 weeks, respectively. ICR male mice at 8 weeks were used in the control group, and ICR male mic...
To investigate the effect of Bombycis Corpus on male osteoporosis, we performed Dual Energy X-Ray Absorptiometry(DEXA) and histochemical methods. The animals were used ICR-based male mice of 8 weeks and 50 weeks, respectively. ICR male mice at 8 weeks were used in the control group, and ICR male mice at 50 weeks were used in aging group and Bombycis Corpus group(BC group). In the aging group, 0.5 ml of distilled water was administered once a day for 6 months. In BC group, Bombycis Corpus(0.78g/kg) was dissolved in distilled water for 6 months once a day. As a result, Bombycis Corpus decreased bone loss, increased bone density by reducing the loss of bone matrix in the femur due to aging, and increased osteoblast - induced osteopontin(OPN) and osteocalcin(OPC) positivite reaction. In addition, administration of Bombycis Corpus decreased Reaction of activation of nuclear factor kappa B ligand(RANKL) positive reaction, increased osteoprotegerin(OPG) positive reaction, and decreased matrix metalloproteinase-3(MMP-3) and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG) positivite reaction. Taken together, Bombycis Corpus increases the activity of osteoblasts, inhibits osteoclast function, promotes osteoblast function, inhibits bone tissue degradation, and inhibits bone loss due to oxidative stress. It was observed that Bombycis Corpus reduced bone loss and increased bone density caused by aging to improve male osteoporosis. Therefore, Bombycis Corpus may be used as a preventive and therapeutic agent for male osteoporosis.
To investigate the effect of Bombycis Corpus on male osteoporosis, we performed Dual Energy X-Ray Absorptiometry(DEXA) and histochemical methods. The animals were used ICR-based male mice of 8 weeks and 50 weeks, respectively. ICR male mice at 8 weeks were used in the control group, and ICR male mice at 50 weeks were used in aging group and Bombycis Corpus group(BC group). In the aging group, 0.5 ml of distilled water was administered once a day for 6 months. In BC group, Bombycis Corpus(0.78g/kg) was dissolved in distilled water for 6 months once a day. As a result, Bombycis Corpus decreased bone loss, increased bone density by reducing the loss of bone matrix in the femur due to aging, and increased osteoblast - induced osteopontin(OPN) and osteocalcin(OPC) positivite reaction. In addition, administration of Bombycis Corpus decreased Reaction of activation of nuclear factor kappa B ligand(RANKL) positive reaction, increased osteoprotegerin(OPG) positive reaction, and decreased matrix metalloproteinase-3(MMP-3) and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG) positivite reaction. Taken together, Bombycis Corpus increases the activity of osteoblasts, inhibits osteoclast function, promotes osteoblast function, inhibits bone tissue degradation, and inhibits bone loss due to oxidative stress. It was observed that Bombycis Corpus reduced bone loss and increased bone density caused by aging to improve male osteoporosis. Therefore, Bombycis Corpus may be used as a preventive and therapeutic agent for male osteoporosis.
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문제 정의
이에 저자는 여성골다공증 개선에 효과를 나타내는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라 생각하였다. 따라서白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 수컷 생쥐를 대상으로 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
제안 방법
0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분 동안 반응시켜 핵 염색하고, Biebrichscalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리한 후 광학현미경(BX51. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
Sodium pentobarbital로 마취하고. x-ray absorptiometry(Inalyzer, Medikors, 서울, 대한민국)를 통해 골 손실을 분석하였다.
白殭蠶 추출물은 白殭蠶(Bombycis Corpus, BC) 300 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 후 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하여 동결건조기로 건조하였고, 본 과정을 통해 분말 17.09 g을 얻었다.
면역조직화학 결과를 조사하기 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하여 수치화 (means ± standard deviation) 하였다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 지역을 x40 또는 x400배율에서 촬영한 다음 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상분석 하였다. 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc.
골다공증 발병기전에 관여하는 Reaction of activation of nuclear factor kappa B ligand (RANKL, 1:50, Santa CruzBiotec, USA)과 osteoprotegerin (OPG, 1:50, Santa CruzBiotec, USA), 골성조직의 분해에 관여하는 matrixmetalloproteinase-3 (MMP-3, 1:50, Santa Cruz Biotec, USA)의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐를 사용하였고, 노화군과 白殭蠶군은 50주령의 ICR계 생쥐를 사용하였다. 노화군은 별다른 처치 없이 증류수 0.5 ㎖를 1일 1회씩 6개월 동안 투여하였고, 白殭蠶군은 白殭蠶 추출물(0.78g/kg)을 D.W에 녹여 1일 1회씩 6개월 동안 투여하였다.
대퇴골 뼈기질의 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다.
이에 저자는 여성골다공증 개선에 효과를 나타내는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라 생각하였다. 따라서白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 수컷 생쥐를 대상으로 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
면역조직화학 결과를 조사하기 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하여 수치화 (means ± standard deviation) 하였다.
반면 본 실험의 경우 수컷 노화쥐를 대상으로 DEXA와 조직화학적 실험방법을 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과를 종합해보면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며 골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실 감소 및 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
뼈모세포에서 생성되는 osteocalcin (OPC)과 osteopontin (OPN)의 분포변화를 조사하기 위해 mouse anti OPC와 mouse anti OPN를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 뼈조직절편을 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다.
산화스트레스에 의한 유전자손상에 관여하는 8-OHdG(1:100,Santa Cruz Biotec, USA)의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
실험군은 정상군(control group)과 노화군(Aging group), 白殭蠶군(Bombycis Corpus group, BC group) 총 3군으로 분류하였다.
여성 골다공증에 대하여 이미 개선효과가 입증된 白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
. 이 연구에서는 Micro-CT를 이용하여 소주골의 용적과 두께를 측정하였고, in vitro assay에서 alkaline phosphatase, type Ⅰ collagen 및 mineralization의 농도를 측정하였다. 그 결과 白殭蠶은 뼈 성장인자인 BMP-2의 신호전달 경로를 통해 조골세포의 분화를 유도하였으며, 이를 통해 소주골의 부피와 두께를 증가시켜 골다공증을 개선시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
이에 여성 골다공증의 개선에도 효과를 보이는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라고 생각하여 Dual Energy X-Ray Absorptiometry(DEXA)와 조직화학적 방법을 통하여 실험을 진행해보았다.
흰쥐를 ether로 마취하여 대퇴골을 적출한 후 대퇴골 주위의 지방 및 근육들을 제거하고 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였으며, 고정된 대퇴골은 탈회액 (decalcification solution,BBC, UK)에 12시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
대상 데이터
8주령의 수컷 ICR계 생쥐(샘타코, 한국)와 50주령의 수컷 ICR계 생쥐(중앙실험동물, 한국)는 구입한 후 온도 23±2 ℃, 습도 55±5 %의 항온항습실에서 일주일 적응시킨 후 사용하였고, 적응기간 동안 사료와 음수는 자유 섭취케 하였다
정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐를 사용하였고, 노화군과 白殭蠶군은 50주령의 ICR계 생쥐를 사용하였다. 노화군은 별다른 처치 없이 증류수 0.
데이터처리
통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)를 사용하였으며,one-way ANOVA 시행을 통해 유의성 (P<0.05)을 검증하고 Duncan’s multiple range test로 사후 검증하였다.
성능/효과
X-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, control군에 비해 aging군의 대퇴골에서 골손실의 증가가 관찰되었지만, BC군에서는 aging군에 비해 대퇴골의 골손실이 감소되었다.
. 白殭蠶을 투여하였을 때 8-OHdG 양성반응은 aging군에 비해 감소된 것은 白殭蠶이 활성산소로 발생하는 산화스트레스에 의한 골 손실을 억제함으로써 골다공증을 개선시킨다는 사실을 보여준다.
골다공증 발병기전에 관여하는 RANKL, OPG, 골성조직의 분해에 관여하는 MMP-3의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, RANKL 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 64% 감소되었고, OPG 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 120% 증가되었으며, MMP-3 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 36% 감소되었다.
이 연구에서는 Micro-CT를 이용하여 소주골의 용적과 두께를 측정하였고, in vitro assay에서 alkaline phosphatase, type Ⅰ collagen 및 mineralization의 농도를 측정하였다. 그 결과 白殭蠶은 뼈 성장인자인 BMP-2의 신호전달 경로를 통해 조골세포의 분화를 유도하였으며, 이를 통해 소주골의 부피와 두께를 증가시켜 골다공증을 개선시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
그 결과, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켰으며, 뼈모세포에서 생성되는 OPN과 OPC 양성반응을 증가시켰다. 또한 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고,OPG 양성반응은 증가하였으며 MMP-3 양성반응과 8-OHdG 양성반응은 감소하였다.
반면 본 실험의 경우 수컷 노화쥐를 대상으로 DEXA와 조직화학적 실험방법을 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과를 종합해보면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며 골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실 감소 및 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 白殭蠶은 남성 골다공증에 대한 예방 및 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
대퇴골내 뼈기질의 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시한 결과, 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간은 control군에 비해 aging군에서 증가되었지만, BC군에서는 aging군에 비해 감소되었다.
그 결과, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켰으며, 뼈모세포에서 생성되는 OPN과 OPC 양성반응을 증가시켰다. 또한 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고,OPG 양성반응은 증가하였으며 MMP-3 양성반응과 8-OHdG 양성반응은 감소하였다.
또한 골밀도는 control군에 비해 aging군의 골밀도가 감소되었지만, BC군의 골밀도는 Aging군에 비해 60% 증가하였다.
먼저 x-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, 白殭蠶의 투여로 대퇴골의 골손실이 감소하였으며 이는 증가된 골밀도 수치에서도 확인할 수 있었다. 또한 대퇴골내 뼈기질을 관찰하였을 때 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간도 白殭蠶의 투여로 감소하였다. 즉, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시킴으로써 골다공증을 개선시키는 것으로 생각된다.
먼저 x-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, 白殭蠶의 투여로 대퇴골의 골손실이 감소하였으며 이는 증가된 골밀도 수치에서도 확인할 수 있었다. 또한 대퇴골내 뼈기질을 관찰하였을 때 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간도 白殭蠶의 투여로 감소하였다.
이렇게 RANKL과 OPG는서로 균형을 맞추며 골밀도를 유지하게 된다27-29). 본 실험에서 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고, OPG 양성반응은 증가하였기 때문에 白殭蠶은 파골세포의 작용은 억제하고 조골세포의 작용은 촉진함으로써 골다공증 개선효과를 나타내는 것으로 생각된다.
뼈모세포에서 생성되는 osteopontin (OPN)과 osteocalcin(OPC)의 분포변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, OPN 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 145% 증가하였고, OPC 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 150% 증가하였다.
산화스트레스에 의한 유전자손상에 관여하는 8-OHdG의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, 8-OHdG양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 62% 감소되었다.
이상의 실험결과를 종합하면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며,골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 白殭蠶은 남성 골다공증에 대한 예방 및 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
퇴행성 골다공증은 어떤 것과 관계되는가?
전체적으로 뼈의 형성보다 뼈의 재흡수가 더 많이 일어나는 질환을 골다공증이라고 하는데, 골다공증의 가장 흔한 형태는 퇴행성 골다공증으로 대부분 고령, 폐경과 관계된다. 노화가 진행되면 운동기능 및 체력이 저하되는데, 이는 근골격계 및 몸을 구성하는 물질들을 약화시키며, 심폐기능과 면역 기능 저하로 이어져 골다공증, 근위축, 고혈압, 당뇨 등의 만성 질병이 발생하게 된다16) .
연구 및 진료의 관심대상이 골다공증이 다발하는 폐경 이후의 여성에게 집중되는 원인은 무엇인가?
보통 골다공증이라는 질환은 여성만의 질환으로 여겨져 대부분의 골다공증에 대한 연구 및 진료의 관심대상은 골다공증이 다발하는 폐경 이후의 여성에게 집중되어 있었다. 그 이유로 여성에게는 여성호르몬의 급격한 감소에 의한 폐경이라는 확실한 기준점이 있어 골다공증에 대한 진단 및 치료, 예방이 비교적 손쉽게 가능하지만 남성의 경우 확실히 드러나는 신체증상이 없어 골절이 있기 전까지는 골다공증에 대해 인지하지 못하기 때문이다. 또한 연령 증가에 따라 골다공증의 유병률도 급격히 증가하고 있고, 척추나 고관절에 골절이 발생하였을 때 사망률은 여성보다 남성에게서 더 높게 나타나고 있으므로9-11) 남성 골다공증에 대한 연구가 필요함에도 불구하고 여성 골다공증 관련 연구보다 미흡한 실정이다.
골다공증이 발생하는 원인으로 무엇이 언급되는가?
골다공증이 발생하는 원인으로 유전적 요인, 인종적 요인, 영양적 요인 및 연령, 성별, 호르몬 분비, 체중, 활동량, 음주, 카페 인, 흡연 등 다양한 원인들이 있지만5-7) , 아직까지 뚜렷하게 밝혀진 원인은 없으며, 치료법도 경구용 골다공증치료제가 있지만 많은 단 점이 있어8) 기존 치료제의 단점을 보완하면서 골다공증 개선 효과 를 갖춘 치료제 개발이 필요하다.
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