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문제 정의
- 이에 저자는 여성골다공증 개선에 효과를 나타내는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라 생각하였다. 따라서白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 수컷 생쥐를 대상으로 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하였다.
- 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분 동안 반응시켜 핵 염색하고, Biebrichscalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리한 후 광학현미경(BX51. Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- Sodium pentobarbital로 마취하고. x-ray absorptiometry(Inalyzer, Medikors, 서울, 대한민국)를 통해 골 손실을 분석하였다.
- 白殭蠶 추출물은 白殭蠶(Bombycis Corpus, BC) 300 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 후 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하여 동결건조기로 건조하였고, 본 과정을 통해 분말 17.09 g을 얻었다.
- 면역조직화학 결과를 조사하기 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하여 수치화 (means ± standard deviation) 하였다. 각 군의 표본에서 임의로 선정된 지역을 x40 또는 x400배율에서 촬영한 다음 positive pixels/20,000,000 pixels로 영상분석 하였다. 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc.
- 골다공증 발병기전에 관여하는 Reaction of activation of nuclear factor kappa B ligand (RANKL, 1:50, Santa CruzBiotec, USA)과 osteoprotegerin (OPG, 1:50, Santa CruzBiotec, USA), 골성조직의 분해에 관여하는 matrixmetalloproteinase-3 (MMP-3, 1:50, Santa Cruz Biotec, USA)의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐를 사용하였고, 노화군과 白殭蠶군은 50주령의 ICR계 생쥐를 사용하였다. 노화군은 별다른 처치 없이 증류수 0.5 ㎖를 1일 1회씩 6개월 동안 투여하였고, 白殭蠶군은 白殭蠶 추출물(0.78g/kg)을 D.W에 녹여 1일 1회씩 6개월 동안 투여하였다.
- 대퇴골 뼈기질의 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 우선 50-60℃ Bouin 용액에서 1시간동안 매염 처리한 다음 70% 에탄올에서 picric acid를 제거하였다.
- 이에 저자는 여성골다공증 개선에 효과를 나타내는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라 생각하였다. 따라서白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 수컷 생쥐를 대상으로 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 면역조직화학 결과를 조사하기 위해 Image pro Plus (Media Cybernetic, USA)을 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하여 수치화 (means ± standard deviation) 하였다.
- 반면 본 실험의 경우 수컷 노화쥐를 대상으로 DEXA와 조직화학적 실험방법을 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과를 종합해보면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며 골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실 감소 및 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 뼈모세포에서 생성되는 osteocalcin (OPC)과 osteopontin (OPN)의 분포변화를 조사하기 위해 mouse anti OPC와 mouse anti OPN를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 뼈조직절편을 proteinase K (20 ㎍/㎖)에 5분 동안 proteolysis 과정을 거친 후 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다.
- 산화스트레스에 의한 유전자손상에 관여하는 8-OHdG(1:100,Santa Cruz Biotec, USA)의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 실험군은 정상군(control group)과 노화군(Aging group), 白殭蠶군(Bombycis Corpus group, BC group) 총 3군으로 분류하였다.
- 여성 골다공증에 대하여 이미 개선효과가 입증된 白殭蠶이 남성 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해 DEXA 및 조직화학적 방법을 이용하여 실험을 진행하였다.
- . 이 연구에서는 Micro-CT를 이용하여 소주골의 용적과 두께를 측정하였고, in vitro assay에서 alkaline phosphatase, type Ⅰ collagen 및 mineralization의 농도를 측정하였다. 그 결과 白殭蠶은 뼈 성장인자인 BMP-2의 신호전달 경로를 통해 조골세포의 분화를 유도하였으며, 이를 통해 소주골의 부피와 두께를 증가시켜 골다공증을 개선시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 이에 여성 골다공증의 개선에도 효과를 보이는 白殭蠶이 남성 골다공증에도 개선효과를 나타낼 것이라고 생각하여 Dual Energy X-Ray Absorptiometry(DEXA)와 조직화학적 방법을 통하여 실험을 진행해보았다.
- 흰쥐를 ether로 마취하여 대퇴골을 적출한 후 대퇴골 주위의 지방 및 근육들을 제거하고 실온에서 24시간동안 10% NBF에 고정하였으며, 고정된 대퇴골은 탈회액 (decalcification solution,BBC, UK)에 12시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
대상 데이터
- 8주령의 수컷 ICR계 생쥐(샘타코, 한국)와 50주령의 수컷 ICR계 생쥐(중앙실험동물, 한국)는 구입한 후 온도 23±2 ℃, 습도 55±5 %의 항온항습실에서 일주일 적응시킨 후 사용하였고, 적응기간 동안 사료와 음수는 자유 섭취케 하였다
- 정상군은 아무런 처치를 하지 않은 8주령의 ICR계 생쥐를 사용하였고, 노화군과 白殭蠶군은 50주령의 ICR계 생쥐를 사용하였다. 노화군은 별다른 처치 없이 증류수 0.
데이터처리
- 통계는 SPSS software (SPSS 23, SPSS Inc., USA)를 사용하였으며,one-way ANOVA 시행을 통해 유의성 (P<0.05)을 검증하고 Duncan’s multiple range test로 사후 검증하였다.
성능/효과
- X-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, control군에 비해 aging군의 대퇴골에서 골손실의 증가가 관찰되었지만, BC군에서는 aging군에 비해 대퇴골의 골손실이 감소되었다.
- . 白殭蠶을 투여하였을 때 8-OHdG 양성반응은 aging군에 비해 감소된 것은 白殭蠶이 활성산소로 발생하는 산화스트레스에 의한 골 손실을 억제함으로써 골다공증을 개선시킨다는 사실을 보여준다.
- 골다공증 발병기전에 관여하는 RANKL, OPG, 골성조직의 분해에 관여하는 MMP-3의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, RANKL 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 64% 감소되었고, OPG 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 120% 증가되었으며, MMP-3 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 36% 감소되었다.
- 이 연구에서는 Micro-CT를 이용하여 소주골의 용적과 두께를 측정하였고, in vitro assay에서 alkaline phosphatase, type Ⅰ collagen 및 mineralization의 농도를 측정하였다. 그 결과 白殭蠶은 뼈 성장인자인 BMP-2의 신호전달 경로를 통해 조골세포의 분화를 유도하였으며, 이를 통해 소주골의 부피와 두께를 증가시켜 골다공증을 개선시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켰으며, 뼈모세포에서 생성되는 OPN과 OPC 양성반응을 증가시켰다. 또한 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고,OPG 양성반응은 증가하였으며 MMP-3 양성반응과 8-OHdG 양성반응은 감소하였다.
- 반면 본 실험의 경우 수컷 노화쥐를 대상으로 DEXA와 조직화학적 실험방법을 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과를 종합해보면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며 골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실 감소 및 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 白殭蠶은 남성 골다공증에 대한 예방 및 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 대퇴골내 뼈기질의 변화를 관찰하기 위해 Masson trichrome 염색을 실시한 결과, 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간은 control군에 비해 aging군에서 증가되었지만, BC군에서는 aging군에 비해 감소되었다.
- 그 결과, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켰으며, 뼈모세포에서 생성되는 OPN과 OPC 양성반응을 증가시켰다. 또한 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고,OPG 양성반응은 증가하였으며 MMP-3 양성반응과 8-OHdG 양성반응은 감소하였다.
- 또한 골밀도는 control군에 비해 aging군의 골밀도가 감소되었지만, BC군의 골밀도는 Aging군에 비해 60% 증가하였다.
- 먼저 x-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, 白殭蠶의 투여로 대퇴골의 골손실이 감소하였으며 이는 증가된 골밀도 수치에서도 확인할 수 있었다. 또한 대퇴골내 뼈기질을 관찰하였을 때 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간도 白殭蠶의 투여로 감소하였다. 즉, 白殭蠶은 연령의 증가로 발생한 대퇴골내 치밀뼈의 뼈기질 유실을 감소시킴으로써 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시킴으로써 골다공증을 개선시키는 것으로 생각된다.
- 먼저 x-ray absorptiometry를 이용한 DEXA를 통해 골밀도를 검사한 결과, 白殭蠶의 투여로 대퇴골의 골손실이 감소하였으며 이는 증가된 골밀도 수치에서도 확인할 수 있었다. 또한 대퇴골내 뼈기질을 관찰하였을 때 치밀뼈내 뼈기질 유실에 따른 빈공간도 白殭蠶의 투여로 감소하였다.
- 이렇게 RANKL과 OPG는서로 균형을 맞추며 골밀도를 유지하게 된다27-29). 본 실험에서 白殭蠶의 투여로 RANKL 양성반응은 감소하였고, OPG 양성반응은 증가하였기 때문에 白殭蠶은 파골세포의 작용은 억제하고 조골세포의 작용은 촉진함으로써 골다공증 개선효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 뼈모세포에서 생성되는 osteopontin (OPN)과 osteocalcin(OPC)의 분포변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, OPN 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 145% 증가하였고, OPC 양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 150% 증가하였다.
- 산화스트레스에 의한 유전자손상에 관여하는 8-OHdG의 변화를 관찰하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시한 결과, 8-OHdG양성반응은 BC군에서 aging군에 비해 62% 감소되었다.
- 이상의 실험결과를 종합하면, 白殭蠶은 뼈모세포의 활성을 증가시키고 파골세포의 작용 억제 및 조골세포의 작용을 촉진시키며,골성조직의 분해 억제와 산화스트레스에 의한 골 손실의 억제를 통해 연령의 증가로 발생한 골손실을 감소시키고, 골밀도를 증가시켜 남성 골다공증을 개선시키는 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 따라서 白殭蠶은 남성 골다공증에 대한 예방 및 치료제로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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