[논문]오이 떡잎의 발달 과정에서 carnitine의 검출과 변화

차현정; 김대재

doi:10.5352/jls.2019.29.4.421

[국내논문] 오이 떡잎의 발달 과정에서 carnitine의 검출과 변화
Measurement of and Changes in L-carnitine Levels in Developing Cucumber Cotyledon 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.4 = no.228, 2019년, pp.421 - 427

차현정 (충북대학교 대학원) , 김대재 (충북대학교 사범대학 생물교육과)

초록
AI-Helper

지방 저장 종자의 발아 시 저장 지방의 유동은 떡잎이 스스로 광합성을 하기 전까지 탄소 에너지원을 공급하기 위한 핵심적인 대사과정이다. 본 연구에서는 오이 종자의 발아와 유식물의 발달 및 노쇠화 과정의 떡잎에서 식물성 카니틴의 검출과 변화를 처음으로 보고하고자 한다. 또한 오이 떡잎의 전 발달과정에서 불포화 지방산의 변화를 조사하였다. 카니틴은 오이 종자의 파종 후 3일째 떡잎에서 14.5 nM 수준으로 최고조에 달하며, 4일째에는 그 절반 수준인 7.2 nM 수준으로 급격하게 감소하였다. 이후 이어지는 3일 동안 7일째까지 카니틴은 ~3.0 nM 수준을 유지하였다. 같은 시기 불포화 지방산의 함량은 카니틴이 최고조에 달하는 파종 후 3일째 급격히 떨어지고, 5일째 저장 지방은 완전히 고갈되는 것으로 보인다. 파종 9일째부터 카니틴은 검출되지 않았으나 떡잎이 절반 노랗게 변한 노쇠화 중기의 떡잎에서 6.8 nM 수준으로 검출되었는데, 이 검출량은 오이 종자의 파종 후 저장 지방이 고갈되어가는 4일째 떡잎에서 검출된 카니틴의 양과 비슷한 수준이다. 파종 5일 이후 광합성 기능을 완전히 확보한 녹색 떡잎에서 불포화 지방산은 일정한 수준을 유지하며, 노쇠화 단계에 접어든 떡잎에서는 세포의 내막 구조물들이 파괴되며 또다시 불포화 지방산의 함량이 다소 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 카니틴과 불포화 지방산의 검출과 변화의 관찰은 오이 떡잎의 발달과정에서 밝혀진 최초의 발견이다. 이것은 오이 종자의 발아와 떡잎의 발달과정에 카니틴 대사와 관련 BOU 유전자 발현이 밀접하게 공조함을 확인한 것이다. 또한 오이 종자의 발아과정에 에너지를 공급하기 위한 글라이옥실산 회로와 더불어 부가적인 탄소원 이동의 경로의 가능성을 뒷받침한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Mobilization of storage lipids is critical for the germination of oil seeds, as they supply carbon and energy until photosynthesis commences in cotyledons. In this study, we determined the levels of plant carnitine and associated changes in these levels from seed germination to cotyledon senescence. We also examined changes in the content of unsaturated fatty acids throughout seedling development. Carnitine levels peaked on day 3 at 14.5 nM in cotyledons and decreased sharply to 7.2 nM on day 4. On development day 3 carnitine levels were maintained at around 3 nM until day 7. The unsaturated fatty acid content dropped by half at the same time as carnitine peaked (day-3), and storage lipids were almost depleted by day 5. Thereafter, carnitine was hardly detected until the second stage of cotyledon senescence, at which stage the carnitine content was 6.8 nM, similar to that on day 4 at the time of fatty acid depletion in the cotyledons. Unsaturated fatty acids levels remained constant in green cotyledons but slightly increased in the senescing cotyledons. The latter can be explained by intracellular breakdown of membrane lipids. This is the first such discovery in developing cotyledons and may offer clues regarding other roles of the acetyl unit transport system in plants. The expression of BOU was closely associated with carnitine metabolism during seed germination and cotyledon development. The results provide support for the possibility of carbon re-routing during the glyoxylate cycle in the supply of energy for early germination and development.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Epigeous growth of cucumber seedlings from day 3 to day 6 after seeds were sown in wet vermiculite.
그림 Fig. 2. Changes in the fresh weight of developing cucumber cotyledon.
그림 Fig. 3. Changes in unsaturated fatty acid content in cucumber cotyledons from dry seed to day 40, the second stage of cotyledon senescence.
그림 Fig. 4. Changes in carnitine content during the development of cucumber cotyledons from the early stage of germination on day 3 to fully grown green cotyledon at day-10, as a photosynthetic leaf-like organ, and in the second stage of cotyledon senescence at day-40.
그림 Fig. 5. A proposed model of lipid mobilization pathways [1, 18]. The triacylglycerol (TAG) form of seed storage lipid undergoes catabolic degradation to fatty acids through acyl CoA within the lipid body.

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

따라서 본 연구에서는 오이의 발아과정에서 수행된 RT-PCR을 적용한 유전자 활성 연구의 결과를 바탕으로 떡잎의 발달 과정 중 식물에서 카니틴 대사의 존재를 탐색하고자 하였다. 앞선 연구 보고에서 확인된 acylcarnitine carrier-like enzyme system (A BOUT DE SOUFFLE [BOU])에 의한 카니틴 운반 시스템[13, 15] 관련 유전자 발현을 통해 확인된 연구의 결과에 따라 유전자 활성의 최적의 시기를 결정하였고, 발아와 노쇠화를 포함하는 발달중인 떡잎에서 카니틴의 존재를 생화학적 분석 기법을 통하여 확인하고자 하였다.
또한 저장 지방의 대부분을 차지하는 90% 정도가 불포화 지방산(linoleic acid 및 oleic acid)으로 구성되어 있어[6, 21] 일반적으로 불포화 지방산의 검출을 통해 정량 하여 조직 내 총지방의 함유량을 추정하게 된다. 따라서 본 연구에서도 불포화 지방산의 검출을 통하여 오이의 발달에 따른 떡잎 내 지방의 변화량을 추정하고자 하였다. 불포화 지방산의 검출에 앞서 총지방의 추출은 Liquid Extraction Kit(Cell BioLabs, USA)을 사용하여 준비하였다.
앞선 연구 보고에서 확인된 acylcarnitine carrier-like enzyme system (A BOUT DE SOUFFLE [BOU])에 의한 카니틴 운반 시스템[13, 15] 관련 유전자 발현을 통해 확인된 연구의 결과에 따라 유전자 활성의 최적의 시기를 결정하였고, 발아와 노쇠화를 포함하는 발달중인 떡잎에서 카니틴의 존재를 생화학적 분석 기법을 통하여 확인하고자 하였다. 또한 발달중인 오이 종자의 전체 지방 중 약 90%를 차지하는 불포화지방산[6, 21]의 변화를 측정하는 연구를 통하여 저장 지방의 양적인 변화를 함께 조사하였고, 동일한 떡잎의 발달과정에서 카니틴 변화와의 연관성을 알아보고자 하였다. 이로부터 확인된 오이 떡잎에서 카니틴 탐색 결과는 박과 식물의 발아과정에서 진행되는 탄소원의 유동 과정에 대한 또 다른 경로의 존재 가능성을 뒷받침할 것으로 사료된다.
앞선 연구에서 오이 종자의 발아 시 저장 지방의 유동에 있어 acetyl unit 통로의 실존 가능성을 예측할 수 있었던 것은 acetylcarnitine 운반 체계와 직접 연관되어 있는 오이 BOU 유전자들의 발현을 확인한 것으로부터 출발하였다[1]. 본 연구에서는 발아 초기와 노쇠화 떡잎에서 미토콘드리아 내막의 BOU를 통로로 이동하는 carnitine의 존재와 변화를 처음으로 확인한 것이다. BOU 시스템은 carnitine을 매개로 하여 미토콘드리아 외막과 내막 단백질인 carnitine palmitoyl transferase I과 II(CPT I and CPT II)를 사용하여 acetyl unit을 세포질로부터 미토콘드리아로 운반하는 수송체계의 하나로 알려져 있으며, 이러한 수송 체계는 균계와 동물계에 더욱 잘 발달되어 있다[25].
따라서 본 연구에서는 오이의 발아과정에서 수행된 RT-PCR을 적용한 유전자 활성 연구의 결과를 바탕으로 떡잎의 발달 과정 중 식물에서 카니틴 대사의 존재를 탐색하고자 하였다. 앞선 연구 보고에서 확인된 acylcarnitine carrier-like enzyme system (A BOUT DE SOUFFLE [BOU])에 의한 카니틴 운반 시스템[13, 15] 관련 유전자 발현을 통해 확인된 연구의 결과에 따라 유전자 활성의 최적의 시기를 결정하였고, 발아와 노쇠화를 포함하는 발달중인 떡잎에서 카니틴의 존재를 생화학적 분석 기법을 통하여 확인하고자 하였다. 또한 발달중인 오이 종자의 전체 지방 중 약 90%를 차지하는 불포화지방산[6, 21]의 변화를 측정하는 연구를 통하여 저장 지방의 양적인 변화를 함께 조사하였고, 동일한 떡잎의 발달과정에서 카니틴 변화와의 연관성을 알아보고자 하였다.
오이 종자의 파종 후 떡잎이 지상으로 출현하는 3일째부터 오이 유식물의 발달에 따른 떡잎의 생체질량(fresh weight)의 변화를 관찰하여 저장 지방의 대사와 떡잎의 생장에 따른 각각의 변화와 추이를 관찰하고자 하였다.

제안 방법

Carnitine 검출의 전과정은 검출용 시약을 제조 판매하는 Sigma-Aldrich (USA)의 측정 원안에 따라 수행하였으며, 기본적으로 carnitine이 존재하지 않는 블랭크(0)를 기준으로 하지만 일반적으로 나타나는 background value가 유의미하게 얻어질 경우 그 값을 확인하고, 시료에서 얻어진 측정값에서 감산하여 측정값은 조정 환산하였다. 측정은 예비 실험의 결과는 제외하고 별도로 진행된 5차례의 본실험에서 얻어진 측정값 중 최상위 값과 최하위 값을 제외한 3차례 실시한 측정실험의 평균값으로 결과를 제시하였다(Fig.
흡광도계를 활용하는 비색탐지(colorimetric detection)는 570 nm의 파장에서 실시하였다. Protocol에 따라 Carnitine Standards 반응과 동시에 검출용 시료로부터 carnitine 탐색을 위한 assay 반응을 상온(20℃)에서 30분 처리한 후 검출을 시도하였다. 오이 떡잎에서의 assay 과정은 반복 실험을 통해 최적의 적정 조건을 확립하였다.
발아중인 오이 떡잎에서의 카니틴 검출은 3차례 이상의 예비 실험과 5차례의 측정 실험중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다. 검출의 신뢰도를 높이기 위하여 두 개의 서로 다른 제조사(Effendorf 와 WTW)의 흡광도계 장비를 사용하여 중복 측정하였다.
오이 떡잎에서의 불포화 지방산의 검출은 3차례의 예비 실험과 5차례의 실제 측정 실험 중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다. 검출의 신뢰도를 높이기 위하여 두 대의 서로 다른 제조사(Effendorf 와 WTW)의 흡광도계 장비를 사용하여 중복 측정하였다.
불포화 지방산의 함량을 조사하기 위한 시료는 카니틴의 검출에서와 같이 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 떡잎과 더불어 마른 종자와 파종 전 12시간 물에 불린 종자 및 파종 후 1일째와 2일째 발아 전 씨앗으로부터 총지방을 추출하여 이것을 검출의 시료로 사용하였다. 노쇠화 단계에서의 실험은 떡잎의 노쇠화를 중기(50% 노쇠화)에서 카니틴과 불포화 지방산의 검출을 실시하였다.
1A), 발아 4일째부터 그 이후의 떡잎에서는 Sudan III를 이용한 간단한 지방 검출의 방법으로는 색깔의 변화를 육안으로 구별하기는 어려웠다. 따라서 보다 정밀한 검출을 위한 방법으로 떡잎의 발달에 따른 지방의 함량 변화를 탐색하고자 일반적으로 사용되는 추출 가능한 불포화 지방산을 검출하는 방법을 사용하였다[7, 19]. 식물성 지방의 대부분은 불포화 지방산이기도 하며 특히 지방 저장 종자의 배유인 떡잎에 저장된 지방의 90% 내외가 불포화 지방산이기 때문이다[6, 14].
오이 종자의 파종 후 떡잎이 지상으로 출현하는 3일째부터 오이 유식물의 발달에 따른 떡잎의 생체질량(fresh weight)의 변화를 관찰하여 저장 지방의 대사와 떡잎의 생장에 따른 각각의 변화와 추이를 관찰하고자 하였다. 마른 종자와 파종 전 12시간 물에 불린 종자를 포함하여 파종 후 24시간 간격을 두고 5쌍의 떡잎을 취하여 각각의 생체질량을 측정하였으며 그 평균값으로 결과를 산출하였다. 또한 여기에서 얻어진 생체질량은 지방 추출 시 사용된 떡잎 시료의 질량을 대입하여 떡잎 한 장 당 지방의 함량을 환산하는데 활용되었다.
) 종자는 멸균 증류수에 담가 4℃에서 12시간 동안 불린 후, 젖은 질석에 파종하여 식물 배양기(Jeio Tech, Korea)에 넣어 발아를 유도하고 재배하였다. 배양기에서는 24시간 연속해서 빛을 주었고, 25℃의 온도와 70%의 습도를 유지하여 환경 변인들을 통제하였다. 카니틴 검출을 위하여 떡잎 시료는 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 후 즉시 본연구의 실험 재료로 사용하였다.
카니틴 검출을 위하여 떡잎 시료는 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 후 즉시 본연구의 실험 재료로 사용하였다. 불포화 지방산의 함량을 조사하기 위한 시료는 카니틴의 검출에서와 같이 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 떡잎과 더불어 마른 종자와 파종 전 12시간 물에 불린 종자 및 파종 후 1일째와 2일째 발아 전 씨앗으로부터 총지방을 추출하여 이것을 검출의 시료로 사용하였다. 노쇠화 단계에서의 실험은 떡잎의 노쇠화를 중기(50% 노쇠화)에서 카니틴과 불포화 지방산의 검출을 실시하였다.
흡광도계를 활용하는 비색탐지(colorimetric detection)는 540 nm의 파장에서 실시하였다. 시약제조회사가 제공하는 실험의 절차와 방법에 따라 Lipid Standards 반응과 동시에 검출용 시료로부터 불포화 지방산의 탐색을 위한 assay 반응을 37 ℃에서 15분 처리한 후 곧 바로 검출을 시행하였다. 이에 앞서 본 연구실에서는 오이 떡잎에서의 assay 과정은 사전 실험을 통해 최적의 적정 조건을 확립하였다.
파종 후 3일(72시간)이 경과하고 떡잎이 지상으로 출현하기 시작하는 상태를 시점으로 24시간을 간격을 두고 검출을 실시하여 발아하거나 발달중인 떡잎을 대상으로 nano mole (nM) 수준에서의 카니틴 존재를 확인하였다(Fig. 4). 카니틴의 검출시약을 제공한 Sigma-Aldrich (USA)의 공인된 검출 데이타에 제시된 사람의 혈장이나 혈청의 카니틴 농도가 10~70 μM 수준임을 감안하면 ~10 nM 수준의 매우 낮은 함량을 나타냈다[11].

대상 데이터

검출용 시료 150 μl를 수거한 후 50 μl를 최종 검출용 시료로 사용하였다.
계획에 따라 정해진 일정에 맞추어 채취된 떡잎 한 장을 곧바로 carnitine 검출을 위한 시료로 사용하였다. 한 장의 오이 떡잎 시료로부터 carnitine 검출 시료의 준비와 carnitine assay는 L-Carnitine Assay Kit (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 수행하였다.
본 연구에 사용할 오이(Cucumis sativus L.) 종자는 멸균 증류수에 담가 4℃에서 12시간 동안 불린 후, 젖은 질석에 파종하여 식물 배양기(Jeio Tech, Korea)에 넣어 발아를 유도하고 재배하였다. 배양기에서는 24시간 연속해서 빛을 주었고, 25℃의 온도와 70%의 습도를 유지하여 환경 변인들을 통제하였다.
배양기에서는 24시간 연속해서 빛을 주었고, 25℃의 온도와 70%의 습도를 유지하여 환경 변인들을 통제하였다. 카니틴 검출을 위하여 떡잎 시료는 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 후 즉시 본연구의 실험 재료로 사용하였다. 불포화 지방산의 함량을 조사하기 위한 시료는 카니틴의 검출에서와 같이 파종 후 3일째부터 10일째 까지의 떡잎을 24시간 간격을 두고 절취한 떡잎과 더불어 마른 종자와 파종 전 12시간 물에 불린 종자 및 파종 후 1일째와 2일째 발아 전 씨앗으로부터 총지방을 추출하여 이것을 검출의 시료로 사용하였다.
또한 실험의 효율성을 위하여 불포화 지방산의 검출은 sulfo-phospho-vanillin (SPV) 방법을 적용한 맞춤 시약인 Liquid Quantification Kit (Cell BioLabs, USA)을 사용하였다. 흡광도계를 활용하는 비색탐지(colorimetric detection)는 540 nm의 파장에서 실시하였다. 시약제조회사가 제공하는 실험의 절차와 방법에 따라 Lipid Standards 반응과 동시에 검출용 시료로부터 불포화 지방산의 탐색을 위한 assay 반응을 37 ℃에서 15분 처리한 후 곧 바로 검출을 시행하였다.
흡광도계를 활용하는 비색탐지(colorimetric detection)는 570 nm의 파장에서 실시하였다. Protocol에 따라 Carnitine Standards 반응과 동시에 검출용 시료로부터 carnitine 탐색을 위한 assay 반응을 상온(20℃)에서 30분 처리한 후 검출을 시도하였다.

데이터처리

모든 비색탐지의 과정은 맞춤형 검출 시약제조사(Sigma-Aldrich, USA)가 제공하는 표준화된 실험 방법에 따라 수행되었다. 발아중인 오이 떡잎에서의 카니틴 검출은 3차례 이상의 예비 실험과 5차례의 측정 실험중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다. 검출의 신뢰도를 높이기 위하여 두 개의 서로 다른 제조사(Effendorf 와 WTW)의 흡광도계 장비를 사용하여 중복 측정하였다.
모든 비색탐지의 과정은 맞춤형 검출 시약제조회사(Cell BioLabs, USA)가 제공하는 표준화된 실험 방법에 따라 수행되었다. 오이 떡잎에서의 불포화 지방산의 검출은 3차례의 예비 실험과 5차례의 실제 측정 실험 중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다. 검출의 신뢰도를 높이기 위하여 두 대의 서로 다른 제조사(Effendorf 와 WTW)의 흡광도계 장비를 사용하여 중복 측정하였다.
Carnitine 검출의 전과정은 검출용 시약을 제조 판매하는 Sigma-Aldrich (USA)의 측정 원안에 따라 수행하였으며, 기본적으로 carnitine이 존재하지 않는 블랭크(0)를 기준으로 하지만 일반적으로 나타나는 background value가 유의미하게 얻어질 경우 그 값을 확인하고, 시료에서 얻어진 측정값에서 감산하여 측정값은 조정 환산하였다. 측정은 예비 실험의 결과는 제외하고 별도로 진행된 5차례의 본실험에서 얻어진 측정값 중 최상위 값과 최하위 값을 제외한 3차례 실시한 측정실험의 평균값으로 결과를 제시하였다(Fig. 4). 카니틴의 존재를 확인하기 위한 첫 번째 예비 연구의 발아 초기 떡잎에서도 카니틴의 함량은 유사한 경향성을 나타냈으나 7일째의 떡잎과 노쇠화 단계에서의 검출 결과는 다소 상이함을 나타냈다[2].

이론/모형

여기서 얻어진 추출 현탁액(crude extract suspension)을 사용하여 이후 총 지방의 추출은 맞춤 시약의 절차와 방법에 따라 진행하였다. 또한 실험의 효율성을 위하여 불포화 지방산의 검출은 sulfo-phospho-vanillin (SPV) 방법을 적용한 맞춤 시약인 Liquid Quantification Kit (Cell BioLabs, USA)을 사용하였다. 흡광도계를 활용하는 비색탐지(colorimetric detection)는 540 nm의 파장에서 실시하였다.
오이 떡잎에서의 assay 과정은 반복 실험을 통해 최적의 적정 조건을 확립하였다. 모든 비색탐지의 과정은 맞춤형 검출 시약제조사(Sigma-Aldrich, USA)가 제공하는 표준화된 실험 방법에 따라 수행되었다. 발아중인 오이 떡잎에서의 카니틴 검출은 3차례 이상의 예비 실험과 5차례의 측정 실험중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다.
이에 앞서 본 연구실에서는 오이 떡잎에서의 assay 과정은 사전 실험을 통해 최적의 적정 조건을 확립하였다. 모든 비색탐지의 과정은 맞춤형 검출 시약제조회사(Cell BioLabs, USA)가 제공하는 표준화된 실험 방법에 따라 수행되었다. 오이 떡잎에서의 불포화 지방산의 검출은 3차례의 예비 실험과 5차례의 실제 측정 실험 중 최대치의 검출 값과 최소치의 검출 값을 제외한 개별 실험으로 측정된 3회의 측정값에 대한 평균값으로 결과를 도출하였다.
먼저 종자와 떡잎의 생체질량을 측정한 후, 각 발달 시기에 따른 추출 가능한 만큼의 생체시료(10~25 mg)를 잘게 쪼개어 50 ml 코니칼 튜브에 넣고 phosphate buffered saline (PBS)를 시료 2 mg 당 1 ml을 첨가하여 4℃에서 파쇄하고 1차 추출물을 확보하였다. 여기서 얻어진 추출 현탁액(crude extract suspension)을 사용하여 이후 총 지방의 추출은 맞춤 시약의 절차와 방법에 따라 진행하였다. 또한 실험의 효율성을 위하여 불포화 지방산의 검출은 sulfo-phospho-vanillin (SPV) 방법을 적용한 맞춤 시약인 Liquid Quantification Kit (Cell BioLabs, USA)을 사용하였다.
계획에 따라 정해진 일정에 맞추어 채취된 떡잎 한 장을 곧바로 carnitine 검출을 위한 시료로 사용하였다. 한 장의 오이 떡잎 시료로부터 carnitine 검출 시료의 준비와 carnitine assay는 L-Carnitine Assay Kit (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 수행하였다. 먼저 떡잎 시료 한 장에 Carnitine Assay Buffer 300 μl를 넣고 파쇄하여 균질화하고, 4℃에서 원심분리(13,000 g, 30분)하여 불용성 물질들을 침전시킨 후 제거하였다.

성능/효과

4). 검출 가능한 시료로부터 측정된 떡잎 한 장 당 카니틴의 함량은 발아 3일째에 최고조에 달하는 14.5 nM 정도로 나타났다. 이 시기는 또한 오이의 발아 초기 글라이옥실산 회로의 핵심 효소인 말산 합성효소(malate synthase, MS)와 이소시트르산 분해효소(isocitrate lyase, ICL)의 활성과 이들을 암호화하는 유전자의 활성이 최대에 이르는 3~4일째와 일치한다[12, 20].
카니틴의 존재를 확인하기 위한 첫 번째 예비 연구의 발아 초기 떡잎에서도 카니틴의 함량은 유사한 경향성을 나타냈으나 7일째의 떡잎과 노쇠화 단계에서의 검출 결과는 다소 상이함을 나타냈다[2]. 그러나 보다 구체화한 실험설계를 통한 반복된 측정 실험과 떡잎의 생체 질량의 변화 및 포화지방산의 변화량 등을 통합적으로 조사한 본 연구에서 기술적 미흡함과 결과 처리의 오류를 해소하고 명확한 결론에 도달할 수 있었다.
파종 직전 12시간 동안 물에 불린 종자나 파종 후1일째 및 2일째의 떡잎에서는 많은 저장 지방의 간섭 등 기술적 한계로 인하여 카니틴 검출을 위한 시료 추출물을 얻기 힘들었다. 따라서 본 연구에서는 발아가 본격적으로 진행되는 3일 이후의 떡잎으로부터 검출이 가능하였다(Fig. 4). 검출 가능한 시료로부터 측정된 떡잎 한 장 당 카니틴의 함량은 발아 3일째에 최고조에 달하는 14.
본 연구의 결과는 오이의 발아 초기와 떡잎의 발달 및 노쇠화 과정에서 저장 지방의 유동과 지방의 대사 과정에 직간접으로 관여하는 주요 대사물질의 하나일 것으로 알려진 carnitine을 발달중인 오이의 떡잎에서 변화를 처음으로 확인한 것으로써, 전통적으로 알려진 글라이옥실산 회로 중심의 지방의 유동 및 대사에 대한 부가적인 기능을 부여한 것으로 사료된다. 나아가 카니틴이 식물의 발달과정에서 여러 대사과정에관여할 것이라는 추정은 후속 연구를 통하여 보다 명확히 규정되어야 할 것으로 판단된다.
3). 즉, 본격적인 저장 지방의 유동과 대사는 파종 후 3일 째부터 급격하게 일어남을 확인할 수 있다(Fig. 3). 전통적으로 파종 후 3일째 떡잎에서는 글라이옥실산 회로의 가동이 최고조에 달하는 시기로써 이것이 저장 지방의 유통을 대부분 담당하며, 이는 이전의 연구 결과들과 다르지 않다[1, 8, 12, 20, 27].
지방의 검출 결과(Fig. 3)에서 보는 바와 같이 마른 씨앗이 12시간 동안 물에 침윤된 후(Day 0) 수분의 흡수로 인하여 생체질량이 2배 가까이 증가하였지만(Fig. 2), 파종 후 2일째까지 불포화 지방산의 함량은 발아에 따른 대사활동의 시작과 함께 약간의 증가가 관찰될 뿐 큰 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 3). 즉, 본격적인 저장 지방의 유동과 대사는 파종 후 3일 째부터 급격하게 일어남을 확인할 수 있다(Fig.

후속연구

그러나 탐침 실험의 형태로 수행된 노쇠화 2단계(50% 노쇠화)떡잎에서도 발아 4일째 수준의 카니틴이(≤6.8 nM) 검출되어(Fig. 4) 노쇠화 과정에서 카니틴의 역할과 대사과정에서의 기능 등 보다 정확한 판단을 위한 후속 연구가 필요하다.
본 연구의 결과는 오이의 발아 초기와 떡잎의 발달 및 노쇠화 과정에서 저장 지방의 유동과 지방의 대사 과정에 직간접으로 관여하는 주요 대사물질의 하나일 것으로 알려진 carnitine을 발달중인 오이의 떡잎에서 변화를 처음으로 확인한 것으로써, 전통적으로 알려진 글라이옥실산 회로 중심의 지방의 유동 및 대사에 대한 부가적인 기능을 부여한 것으로 사료된다. 나아가 카니틴이 식물의 발달과정에서 여러 대사과정에관여할 것이라는 추정은 후속 연구를 통하여 보다 명확히 규정되어야 할 것으로 판단된다.
또한 발달중인 오이 종자의 전체 지방 중 약 90%를 차지하는 불포화지방산[6, 21]의 변화를 측정하는 연구를 통하여 저장 지방의 양적인 변화를 함께 조사하였고, 동일한 떡잎의 발달과정에서 카니틴 변화와의 연관성을 알아보고자 하였다. 이로부터 확인된 오이 떡잎에서 카니틴 탐색 결과는 박과 식물의 발아과정에서 진행되는 탄소원의 유동 과정에 대한 또 다른 경로의 존재 가능성을 뒷받침할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	저장 지방은 발아 과정에서 필수적인 에너지와 탄소원을 어떻게 제공하는가?	종자에 다량의 저장 지방을 포함하는 식물들의 발아는 저장 지방의 대사로부터 새로운 생명활동의 시작이며 여러 대사과정이 관련되어 있다[4, 8, 12]. 저장 지방은 주로 중성 지방(triacylglycerol, TAG)의 형태로 건조한 종자가 파종을 위한 침윤과정을 거치는 단계에서부터 발아가 시작됨과 동시에 사용이 가능한 단당류 형태의 탄수화물로 전환되어 발아 과정에 필수적인 에너지와 유기물 합성에 필요한 탄소원을 제공한다[9, 10, 16, 22]. 발아 후에 떡잎이 지상으로 솟아오르는 상배축성(epigeous) 식물인 박과 식물(Cucurbitaceous)들은 발아의 성립 후 떡잎은 첫 번째 잎의 출현에 앞서 광합성을 시작하고 제한적이나마 일정 기간 동안 발달과 생장을 유지한다[12, 17, 18].
	저장 지방의 대사 시 포도당 유동에 관여하는 세포 소기관은 무엇인가?	특히 말산은 대사경로를 따라 다시 세포질로 나와 당 신생 과정(gluconeogenesis)을 거쳐 포도당을 생성하며 지방의 탄수화물로의 유동이 이루어진다[1, 10]. 이와 같은 저장 지방의 포도당으로의 유동에는 지방체, 퍼옥시좀, 미토콘드리아 및 세포질 등 세포 내 여러 소기관들이 참여한다. 각각의 세포 내 소기관에서는 베타 산화, 글라이옥실산 회로 및 시트르산 회로와 당 신생 과정이 참여하며 각 단계마다 일어나는 생화학 반응을 촉매 하는 효소의 참여와 그에 대응하는 유전자 19가지 이상이 관련되어 있다[1].
	글라이옥실산 회로를 통해 생성되는 대사물질로 무엇이 있는가?	이 아세틸 코엔자임 에이는 저장 지방 대사의 핵심 회로로 알려진 글라이옥실산 회로(glyoxylate cycle)를 통해 대사되며 다양한 대사물질을 생성한다[1, 3, 20, 27]. 글라이옥실산 회로를 통해 생성된 대사물질들은 말산(malate), 이소시트르산(isocitrate) 및 시트르산(citrate) 등이다. 이들은 직접 경로나 간접 운송 경로를 통해 미토콘드리아로 운반되어 단축된 시트르산 회로(citric acid cycle)를 통해 세포호흡의 에너지원 생성의 과정을 따른다[1, 24].

참고문헌 (27)

Cha, H. J. and Kim, D. J. 2014. Metabolic genes expression for lipid metabolism in cucumber cotyledon development and possibility of secondary route of acetyl units. J. Life Sci. 24, 1055-1062.

원문보기 상세보기
Cha, H. J. and Kim, D. J. 2017. Assay of L-carnitine in developing cucumber cotyledon. Bull. Sci. Ed. 33, 43-50.
Chen, Z. H., Walker, R. P., Acheson, R. M., Tecsi, L. I., Wingler, A., Lea, P. J. and Leegood, R. C. 2000. Are isocitrate lyase and phosphoenolpyruvate carboxykinase involved in gluconeogenesis during senescence of barley leaves and cucumber cotyledons? Plant Cell Physiol. 41, 960-967.

상세보기
Eastmond, P. J. and Graham, I. A. 2001. Re-examining the role of the glyoxylate cycle in oilseeds. Trends Plant Sci. 6, 72-78.

상세보기
Eisenhut, M., Planchais, S., Cabassa, C., Guivarc'h, A., Justin, A. M., Taconnat, L., Renou, J. P., Linka, M., Gagneul, D., Timm, S., Bauwe, H., Carol, P. and Weber, A. P. 2013. Arabidopsis A BOUT DE SOUFFLE is a putative mitochondrial transporter involved in photorespiratory metabolism and is required for meristem growth at ambient $CO_2$ levels. Plant J. 73, 836-849.

상세보기
Fiume, M. M. 2012. Tentative safety assessment; Cucumis sativus (Cucumber) -Derived ingredients as used in cosmetics. Cosmetic Ingredient Review, NW, USA.
Folch, J., Lees, M. and Slone Stanley, G. H. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509.
Footitt, S., Slocombe, S. P., Larner, V., Kurup, S., Wu, Y., Larson, T., Graham, I., Baker, A. and Holdsworth, M. 2002. Control of germination and lipid mobilization by COMATOSE, the Arabidopsis homologue of human ALDP. EMBO J. 21, 2912-2922.

상세보기
Graham, I. A., Smith, L. M., Leaver, C. J. and Smith, S. M. 1990. Developmental regulation of expression of the malate synthase gene in transgenic plants. Plant Mol. Biol. 15, 539-549.

상세보기
Graham, I. A., Leaver, C. J. and Smith, S. M. 1992. Induction of malate synthase gene expression in senescent and detached organs of cucumber. Plant Cell 4, 349-357.

상세보기
Hoppel, C. 2003. The role of carnitine in normal and altered fatty acid metabolism. Am. J. Kidney Dis. 41(4 Suppl 4), S4-12.
Kim, D. J. and Smith, S. M. 1994. Molecular cloning of cucumber phosphoenolpyruvate carboxykinase and developmental regulation of gene expression. Plant Mol. Biol. 26, 423-434.

상세보기
Lawand, S., Dorne, A. J., Long, D., Coupland, G., Mache, R. and Carol, P. 2002. Arabidopsis A BOUT DE SOUFFLE, which is homologous with mammalian carnitine acyl carrier, is required for postembryonic growth in the light. Plant Cell 14, 2161-2173.

상세보기
Munshi, S. K., Sandhu, S. and Sharma, S. 2007. Lipid composition in fast and slow germination sunflower (Helianthus annuus L.) seeds. Gen. Appl. Plant Physiol. 33, 235-246.
Nguyen, P. J., Rippa S., Rossez, Y. and Perrin, Y. 2016. Acylcarnitines participate in developmental processes associated to lipid metabolism in plants. Planta 243, 1011-1022.

상세보기
Penfield, S., Penfield-Wells, H. M. and Graham, I. A. 2006. Storage reserve mobilization and seedling establishment in Arabidopsis. Arabidopsis Book 4, 1-17.
Pinfield-Wells, H., Rylott, E. L., Gilday, A. D., Graham, S., Job, K., Larson, T. R. and Graham, I. A. 2005. Sucrose rescues seedling establishment but not germination of Arabidopsis mutants disrupted in peroxisomal fatty acid catabolism. Plant J. 43, 861-872.

상세보기
Pracharoenwattana, I., Cornah, J. E. and Smith, S. M. 2005. Arabidopsis peroxisomal citrate synthase is required for fatty acid respiration and seed germination. Plant Cell 17, 2037-2048.

상세보기
Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R. and Spickett, C. M. 2013. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J. Lipid Res. 54, 1812-1824.

상세보기
Reynolds, S. J. and Smith, S. M. 1995. The isocitrate lyase gene of cucumber: Isolation, characterization and expression in cotyledons following seed germination. Plant Mol. Biol. 27, 487-497

상세보기
Robinson, R. W. and Deckers-Waters, D. S. 1997. Cucurbits, pp 34-38, 1st ed, CAB International: Oxford, UK.
Rylott, E. L., Hooks, M. A. and Graham, I. A. 2001. Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem. Soc. Trans. 29, 283-287.

상세보기
Schwadbedissen-Gerbling, H. and Gerhardt, B. 1995. Purification and characterization of carnitine acyltransferase from higher plant mitochondria. Phytochemistry 39, 39-44.

상세보기
Smith, S. M. 2002. Does the glyoxylate cycle have an anaplerotic function in plants? Trends Plant Sci. 7, 12-13.

상세보기
Strijbis, K. and Distel, B. 2010. Intracellular acetyl unit transport in fungal darbon metabolism. Eukaryot. Cell 9, 1809-1815.

상세보기
Watanabe, M., Balazadeh, S., Tohge, T., Erban, A., Giavalisco, P., Kopka, J., Mueller-Roeber, B., Fernie, A. R. and Hoefgen, R. 2013. Comprehensive dissection of spatiotemporal metabolic shifts in primary, secondary, and lipid metabolism during developmental senescence in Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 1290-1310.

상세보기
Weir, E. M., Riezman, H., Grienenberger, J. M., Becker, W. M. and Leaver, C. J. 1980. Regulation of glyoxysomal enzymes during germination of cucumber. Temporal changes in translatable mRNAs for isocitrate lyase and malate synthase. Eur. J. Biochem. 112, 469-477.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증