[논문]엉겅퀴의 엽록체 TrnL-F와 Matk 영역 염기서열의 HRM 분석을 통한 특이적 SNP 분자마커의 개발

이신우; 이수진; 김윤희

doi:10.5352/jls.2019.29.5.524

초록
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엉겅퀴는 대표적인 다년생의 약용식물이다. 최근 국제적 추세에 따라 자국의 유전자원의 발굴, 보존 등이 강화 됨에 따라 인접국가와 국내 자생 엉겅퀴 계통을 판별 할 수 있는 기준 설정에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있지만, 분자생물학적 판별 기술의 개발은 아직 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 국내 토종과 해외 유래 엉겅퀴종의 기원을 판별하기 위해 엽록체에 존재하는 trnL-trnF와 MatK 유전자단편에서 SNP를 이용한 판별 프라이머를 확보하였으며 이를 보완하여 보다 신속하게 판별하기 위하여 HRM 분석 기술을 이용한 판별 마커와 그 조건을 확립하였다. 그러므로, 본 연구에서 개발된 SNP 마커는 다양한 지역 또는 국가에서 서식하는 엉겅퀴 종들의 신속한 확인을 위해 매우 유용하게 이용될 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Medicinal plants resources are becoming important assets since their usages have been expanded to the development of functional foods for human health, cosmetics and pharmaceutical industries. However, their phylogenetic origins and names are different from each country and quite often they are mixe...

Medicinal plants resources are becoming important assets since their usages have been expanded to the development of functional foods for human health, cosmetics and pharmaceutical industries. However, their phylogenetic origins and names are different from each country and quite often they are mixed each other resulting in the confusion for consumers. Particularly when they are very similar based on their morphological characteristics and distributed, it is extremely difficult to differentiate their origins even by specialists. Therefore, identification of each plant species is important for standardizing herbal medicine. Thistle is a medicinal and perennial plant. Obtaining information about the genetic diversity of plant populations is highly important for conservation and germplasm utilization. Although thistle is an important medicinal plant species registered in South Korea, no molecular markers are currently available to distinguish from other similar species from different countries. In this study, we developed single nucleotide polymorphism (SNP) markers derived from chloroplast genomic sequences to identify distinct Korean-specific thistle species via high resolution melting (HRM) curve analyses. We performed molecular authentication of four different kinds of thistle species from different regions using DNA sequences in the trnL-F and matK chloroplast intergenic region. The SNP markers developed in this study are useful for rapidly identifying specific thistle species from different country.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. List of plant materials used in this study
표 Table 2. Primer sequences for amplification of the MatK and TrnL-F fragments
그림 Fig. 1. Sequence alignment of the MatK and TrnL-F chloroplast intergenic region in 4 kinds of thistle species. Korean species (C. japonicum and C. nipponicum), Canadian species (C. arvense) and European species S. marianum).
표 Table 3. Primer sequences for HRM analysis of the MatK and TrnL-F fragments
그림 Fig. 3. Primer sets and HRM curve analysis using the plastid intragenic regions of MatK and TrnL-F in the 4 kinds of thistle species. (A) MatK melting curves of sample from each thistle species. (B) TrnL-F and melting curves of sample from each thistle species.
그림 Fig. 2. Phylogenetic tree showing the genetic diversity of 8 plants of 4 kinds of thistle species. (A) MatK plastid intergenic regions, (B) TrnL-F plastid intergenic regions. The tree was produced using the neighbor-joining method based on intergenic sequences of the plastid intragenic regions of MatK and TrnL-F.

AI 본문요약
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문제 정의

또한, 국내 종 특이적 프라이머들을 이용한 정량적 PCR 분석방법을 이용해 두 가지 종의 genomic DNA의 혼합 여부를 판별하는 연구를 진행한 바 있다. 그러므로, 본 연구에서는 한국산 국내 토종 및 해외 계통의 엉겅퀴의 기원을 판별하기 위한 보다 다양한 판별마커 개발방법으로서, 엽록체에 존재하는 TrnL-F 와 MatK 유전자 단편에서 SNP를 이용한 판별 프라이머를 확보하였으며, 이를 보완하여 보다 신속하게 판별하기 위하여 HRM 분석기술을 이용한 판별마커와 그 조건을 확립하였다.

제안 방법

또한 확인된 밴드들을 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 TrnL-F와 MatK 유전자와 100% 일치하는 것을 확인한 후 HRM curve 패턴 분석을 실시하였다. 각 엉겅퀴 시료에서 분리한 DNA를 각각 10 ng씩 넣고, 프라이머를 각각 5 pmol 넣고 10 μl의 SsoFast™ EvaGreen　Supermix BIO-RAD, 172-5200 premixture를 넣고 전체 반응액을 20 μl로 맞춘 후 Mx3005P QPCR Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을사용하여 HRM curve 분석을 수행하였다.
Table 2에서 제시된 프라이머를 이용하여 증폭된 각 유전자 단편의 염기서열정보를 alignment하여 SNP를 확인하여 상호 간에 판별이 가능한 SNP가 가장 많이 분포하는 지역을 중심으로 하여 약 200 bp 크기의 단편이 증폭 될 수 있도록 하여 HRM (High Resolution Melting) curve 패턴을 분석하기 위한 프라이머를 제작하여 Table 3에 제시하였다. 먼저 제작한 프라이머가 목표 유전자단편을 정확하게 증폭 하는지의 여부를 조사하기 위하여 각각의 프라이머 조합을 이용하여 각 엉겅퀴 시료들에서 분리한 DNA를 주형으로 PCR로 증폭시켜 전기영동을 통해 확인하였다. 또한 확인된 밴드들을 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 TrnL-F와 MatK 유전자와 100% 일치하는 것을 확인한 후 HRM curve 패턴 분석을 실시하였다.
정확한 판별마커들의 확인을 위해, 각 계통들의 TrnL-F와 MatK 유전자 영역의 염기서열을 비교하여 SNP 패턴을 근거로 하여 HRM (High Resolution Melting) curve 분석용 프라이머를 제작 하였다(Table 2). 각 엉겅퀴 계통들의 HRM curve 패턴을 분석한 결과, MatK의 경우, 유전자 단편이 4가지 종 모두에 대해 서로 다른 HRM curve 패턴을 보여 종의 판별이 가능한 것으로 확인 되었다(Fig.
0% agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 그 결과를 확인하였다. 증폭 되어진 각 유전자 단편의 클로닝 과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 ExpinTM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea) Kit를 사용하여 순수 정제한 후 직접 염기 서열분석을 의뢰하였다. 또한 최종적으로 확인된 SNP는 최소 5반복 이상 수행하여 검정하였다.

대상 데이터

nipponicum (KC 590049), C. arvense (KC 969583), S marianum (AY 914869)를 각각 사용하였다. 유전자의 증폭은 iNtRON 회사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기 될 수 있는 돌연변이를 최소화 하였다.
실험에서 사용한 엉겅퀴 계통은 국내 자생하는 엉겅퀴(Cirsium japonicum), 국내 자생 물엉겅퀴(C. nipponicum), 유럽 엉겅퀴(Silybum marianum) 및 캐나다엉겅퀴(C. arvense)를 대상으로 조사하였다(Table 1).

데이터처리

확인된 TrnL-F와 MatK 유전자의 유연관계 분석은 Mega 6.0 프로그램을 이용해 진행하였다. 비교군들 간의 유전적 거리의 계산은 Tamura-Nei distance 방법을 이용하였으며, neighbor-joining 방법을 이용해 유연관계를 분석하였다[9].

이론/모형

0 프로그램을 이용해 진행하였다. 비교군들 간의 유전적 거리의 계산은 Tamura-Nei distance 방법을 이용하였으며, neighbor-joining 방법을 이용해 유연관계를 분석하였다[9].
수집된 계통별로 일정량의 뿌리, 종자, 잎 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll 사의 ExgeneTM Plant SV 키트를 이용하여 회사에서 제공한 실험방법에 따라 염색체 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리과정에 서의 분해정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234 nm, 260 nm, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A260/A280 값이 1.

성능/효과

3B). 그러므로, 엽록체 유전자 단편을 이용한 각 엉겅퀴 시료의 판별을 위해서는 MatK 유전자 단편을 판별마커로 활용하는 것이 효율적인 방법인 것으로 생각된다.
먼저 제작한 프라이머가 목표 유전자단편을 정확하게 증폭 하는지의 여부를 조사하기 위하여 각각의 프라이머 조합을 이용하여 각 엉겅퀴 시료들에서 분리한 DNA를 주형으로 PCR로 증폭시켜 전기영동을 통해 확인하였다. 또한 확인된 밴드들을 순수 정제하여 염기서열분석을 한 결과 각각의 종에서 확인된 TrnL-F와 MatK 유전자와 100% 일치하는 것을 확인한 후 HRM curve 패턴 분석을 실시하였다. 각 엉겅퀴 시료에서 분리한 DNA를 각각 10 ng씩 넣고, 프라이머를 각각 5 pmol 넣고 10 μl의 SsoFast™ EvaGreen　Supermix BIO-RAD, 172-5200 premixture를 넣고 전체 반응액을 20 μl로 맞춘 후 Mx3005P QPCR Systems (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을사용하여 HRM curve 분석을 수행하였다.
유연관계가 높은 국내 엉겅퀴와 유럽 엉겅퀴는 HRM curve 패턴이 매우 유사한 특성을 보였다. 반면에 TrnL-F는 4가지 종 모두 매우 유사한 HRM curve 패턴을 보였으며, 특히 국내 토종 엉겅퀴들은 판별이 되지 않고 같은 HRM curve 패턴을 보였다(Fig. 3B).

후속연구

본 연구의 결과들을 종합하여 보면, 국내 및 해외에서 그 기원을 달리하는 다양한 엉겅귀 및 엉겅퀴 유사 종들의 정확한 기원 판별을 위하여서는 생육 조건이나, 형태적 변이 등에 따라 크게 영향을 받지 않는 DNA단편을 이용한 분자생물학적 판별 마커의 개발이 매우 필요한 실정이다. 그러나 현재까지 국내를 중심으로 한 엽록체 유전자인 TrnL-F와 MatK 영역 등에 대한 특정 유전자 단편 내에 존재하는 SNP의 확인 등에 관한 연구에 한정되어 있어, 실제적인 실용화를 위해서는 많은 연구들이 추가로 필요한 것으로 생각된다.
본 연구의 결과들을 종합하여 보면, 국내 및 해외에서 그 기원을 달리하는 다양한 엉겅귀 및 엉겅퀴 유사 종들의 정확한 기원 판별을 위하여서는 생육 조건이나, 형태적 변이 등에 따라 크게 영향을 받지 않는 DNA단편을 이용한 분자생물학적 판별 마커의 개발이 매우 필요한 실정이다. 그러나 현재까지 국내를 중심으로 한 엽록체 유전자인 TrnL-F와 MatK 영역 등에 대한 특정 유전자 단편 내에 존재하는 SNP의 확인 등에 관한 연구에 한정되어 있어, 실제적인 실용화를 위해서는 많은 연구들이 추가로 필요한 것으로 생각된다.
본 연구의 결과에서처럼, 최근 SNP의 차이를 보이는 염기 서열 부분들을 이용한 DNA barcodes의 개발 및 이를 이용한 약용작물의 기원 분석에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 선행 연구의 ITS 유전자 영역 및 본 연구의 엽록체 유전자 영역의 결과들를 통해 향후 다양한 국내자생 엉겅퀴 종들 및 해외에서 수집된 엉겅퀴 및 엉겅퀴 유사 종들에 대한 핵 및 엽록체 단편의 유전자 서열의 계통간 차이가 나는 SNP를 근거로 하여 염기서열분석을 통한 분자마커를 이용하여 국가별 및 기원을 달리하는 국내 자생 엉겅퀴종들을 정확하게 판별할 수 있을 것으로 기대되는 바이다.

참고문헌 (11)

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Moon, B. C., Lee, Y. M., Ji, Y., Choi, G., Chun, J. M. and Kim, H. K. 2013. Molecular authentication and phylogenetic analysis of plant species for Breeae and Cirsii herba based on DNA barcodes. Kor. J. Herbol. 28, 75-84.
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Slotta, T. A. B., Rothhouse, J. M., Horvath, D. P. and Foley, M. E. 2006. Genetic diversity of Canada thistle (Cirsium arvense) in North Dakota. Weed Sci. 54, 1080-1085.

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Song, M. J. and Kim, H. 2007. Taxonomic study on Cirsium Miller (Asteraceae) in Korea based on external morphology. Kor. J. Plant Taxon. 37, 17-40.

원문보기 상세보기
Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. and Kumar, S. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725-2729.

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Thao, N. T. P., Cuong, T. D., Hung, T. M., Lee, J. H., Na, M. K., Son, J. K., Jung, H. J., Fang, Z., Woo, M. H., Choi, J. S. and Min, B. S. 2011. Simultaneous determination of bioactive flavonoids in some selected Korean thistles by high-performance liquid chromatography. Arch. Pharm. Res. 34, 455-461.

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Yoo, S. K. and Bae, Y. M. 2012. Phylogenetic and chemical analyses of Cirsium pendulum and Cirsium setidens inhabiting. J. Life Sci. 22, 1120-1125.

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