Mycobacterium은 느리게 성장한다. 따라서 고체배지는 8주, 액체배지는 6주 동안 사용하여야 한다. 이 연구의 목적은 Mycobacterium을 빠르게 성장시킬 수 있는 성장 인자를 찾고, 신속한 동정을 위한 고체배지를 개발하는 데 도움을 주는 것이다. $Difco^{TM}$ Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company)에 activated charcoal, defibrinated sheep blood, L-ascorbic acid를 첨가하여 10종의 Mycobacteria 가지고 Mycobacterium 성장 인자 3가지를 평가하였다. 집락의 검출 시간 및 판독 용이성을 현재의 방법과 비교하였다. 빠르게 성장하는 Mycobacterium 있어 새로운 배지와 기존의 배지에서 검출 시간의 차이는 새로운 배지가 더 빠르다는 것을 확인시켜 주었다. M. kansasii와 M. intracelluare는 7H11 배지보다 7H11 C 배지에서 더 빠르게 자라는 것으로 확인되었다. MTB는 7H11 C 배지에서 다른 배지보다 빠르게 성장하였다. 이 연구는 2 두 가지 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacteria과 느리게 성장하는 Mycobacteria에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 7H11 C 배지는 색상 대비로 인하여 10종의 모든 Mycobacterium에서 기존배지보다 더 뛰어난 판독 용이성을 보여 주었다. 특히, MTB가 성장했을 경우 집락의 크기가 다른 배지에서 보다 커서 시각화가 용이하였다.
Mycobacterium은 느리게 성장한다. 따라서 고체배지는 8주, 액체배지는 6주 동안 사용하여야 한다. 이 연구의 목적은 Mycobacterium을 빠르게 성장시킬 수 있는 성장 인자를 찾고, 신속한 동정을 위한 고체배지를 개발하는 데 도움을 주는 것이다. $Difco^{TM}$ Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company)에 activated charcoal, defibrinated sheep blood, L-ascorbic acid를 첨가하여 10종의 Mycobacteria 가지고 Mycobacterium 성장 인자 3가지를 평가하였다. 집락의 검출 시간 및 판독 용이성을 현재의 방법과 비교하였다. 빠르게 성장하는 Mycobacterium 있어 새로운 배지와 기존의 배지에서 검출 시간의 차이는 새로운 배지가 더 빠르다는 것을 확인시켜 주었다. M. kansasii와 M. intracelluare는 7H11 배지보다 7H11 C 배지에서 더 빠르게 자라는 것으로 확인되었다. MTB는 7H11 C 배지에서 다른 배지보다 빠르게 성장하였다. 이 연구는 2 두 가지 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacteria과 느리게 성장하는 Mycobacteria에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 7H11 C 배지는 색상 대비로 인하여 10종의 모든 Mycobacterium에서 기존배지보다 더 뛰어난 판독 용이성을 보여 주었다. 특히, MTB가 성장했을 경우 집락의 크기가 다른 배지에서 보다 커서 시각화가 용이하였다.
Mycobacteria grow slowly. Therefore, a solid medium should be used for eight weeks and a liquid medium for six weeks. The purpose of this study was to find the growth factors that can grow Mycobacterium rapidly and to help develop a solid medium for rapid identification. Three types of Mycobacterium...
Mycobacteria grow slowly. Therefore, a solid medium should be used for eight weeks and a liquid medium for six weeks. The purpose of this study was to find the growth factors that can grow Mycobacterium rapidly and to help develop a solid medium for rapid identification. Three types of Mycobacterium growth factors were evaluated with 10 Mycobacteria by adding activated charcoal, defibrinated sheep blood, and L-ascorbic acid to $Difco^{TM}$ Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). The time to detection and the distinguishability of a colony were compared with that of the current method. In the rapidly growing Mycobacterium, the difference in detection time between the new media and conventional media confirmed that the new media was faster. M. kansasii and M. intracelluare grew faster in 7H11 C than in 7H11 medium. MTB grew faster than the other media in 7H11 C. This study confirmed that the two growth factors affect fast-growing Mycobacteria and slow-growing Mycobacteria. 7H11 C showed better distinguishability than the conventional media in all 10 Mycobacterium due to the color contrast. In particular, when the MTB was grown, the size of the colonies was larger than with other media, so visualization was easy.
Mycobacteria grow slowly. Therefore, a solid medium should be used for eight weeks and a liquid medium for six weeks. The purpose of this study was to find the growth factors that can grow Mycobacterium rapidly and to help develop a solid medium for rapid identification. Three types of Mycobacterium growth factors were evaluated with 10 Mycobacteria by adding activated charcoal, defibrinated sheep blood, and L-ascorbic acid to $Difco^{TM}$ Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). The time to detection and the distinguishability of a colony were compared with that of the current method. In the rapidly growing Mycobacterium, the difference in detection time between the new media and conventional media confirmed that the new media was faster. M. kansasii and M. intracelluare grew faster in 7H11 C than in 7H11 medium. MTB grew faster than the other media in 7H11 C. This study confirmed that the two growth factors affect fast-growing Mycobacteria and slow-growing Mycobacteria. 7H11 C showed better distinguishability than the conventional media in all 10 Mycobacterium due to the color contrast. In particular, when the MTB was grown, the size of the colonies was larger than with other media, so visualization was easy.
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문제 정의
본 연구의 목적은 보고된 성장 인자(DSB, AA, AC)를 다양한 조합으로 배지를 제조하여 Mycobacterium의 성장과 연관성을 규명하고, 결핵균 및 비결핵성항산균에서 빠른 성장 인자를 찾아 신속한 동정에 활용하여 고체배지의 개발에 기초정보를 제공하고자 한다.
이 연구의 목적은 Mycobacterium을 빠르게 성장시킬 수 있는 성장 인자를 찾고, 신속한 동정을 위한 고체배지를 개발하는데 도움을 주는 것이다.
가설 설정
(b) 7H11 medium C in 3 days (M. peregrinum was inoculated with 1.5×102 CFU/mL) confirming the medium containing activated charcoal in 7H11 is much better than the 7H11 medium in visual recognition.
제안 방법
1차적인 선별 배지의 조합은 7H11 agar를 기본으로 하여 AA (100 mg/L) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; M.W 176.12) 첨가한 배지(7H11 A), defibrinated sheep-blood (DSB) (South Pacific Sera Limited, TIMARU, New Zealand)의 농도를 5% 첨가된 배지(7H11 5SB), AA (100 mg/L)와 5% DSB를 첨가한 배지(7H11 A5SB)로 구분하여 배지를 제조하였다. 2차적인 조합은 7H11 agar에 AC (Sigma-Aldrich, St.
2차 선별 연구에서는 접종 농도가 높아 빠르게 성장하는 비결핵성항산균의 성장 차이를 관찰하기 어려워 농도를 낮추어 100 μL의 검체를 접종하였다.
12) 첨가한 배지(7H11 A), defibrinated sheep-blood (DSB) (South Pacific Sera Limited, TIMARU, New Zealand)의 농도를 5% 첨가된 배지(7H11 5SB), AA (100 mg/L)와 5% DSB를 첨가한 배지(7H11 A5SB)로 구분하여 배지를 제조하였다. 2차적인 조합은 7H11 agar에 AC (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; M.W 12.01) 농도를 0.2%가 되게 첨가한 배지(7H11 C), 7H11 C 배지에 DSB를 농도별로 제조한 배지로 5% 첨가한 배지(7H11 C5SB), 7% 첨가한 배지(7H11 C7SB)로 구분하여 배지를 제조 하였다(Table 1). 최종 연구는 0.
이 연구의 목적은 Mycobacterium을 빠르게 성장시킬 수 있는 성장 인자를 찾고, 신속한 동정을 위한 고체배지를 개발하는데 도움을 주는 것이다. DifcoTM Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company)에 activated charcoal, defibrinated sheep blood, L-ascorbic acid를 첨가하여 10종의 Mycobacteria 가지고 Mycobacterium 성장 인자 3가지를 평가하였다. 집락의 검출 시간 및 판독 용이성을 현재의 방법과 비교하였다.
평가를 위해 매일 1회 관찰하여 고체배지에서 집락이 있는 경우와 MGIT액체배지에서 양성 감지 신호가 확인된 경우에는 모두 항산균 염색(Ziehl-Neelsen법)을 통하여 확인 검사를 시행하였다. 선별 연구의 평가 지표는 집락을 형성하는데 걸린 시간(time to detection, TTD)을 설정하여 전체 농도의 평균값으로 산출하였고, 최종적으로는 집락의 육안 판독에 대한 용이성을 추가하여 최종 평가하였다.
DifcoTM Mycobacteria 7H11 agar (Becton, Dickinson and Company)에 activated charcoal, defibrinated sheep blood, L-ascorbic acid를 첨가하여 10종의 Mycobacteria 가지고 Mycobacterium 성장 인자 3가지를 평가하였다. 집락의 검출 시간 및 판독 용이성을 현재의 방법과 비교하였다. 빠르게 성장하는 Mycobacterium 있어 새로운 배지와 기존의 배지에서 검출 시간의 차이는 새로운 배지가 더 빠르다는 것을 확인시켜 주었다.
2%가 되게 첨가한 배지(7H11 C), 7H11 C 배지에 DSB를 농도별로 제조한 배지로 5% 첨가한 배지(7H11 C5SB), 7% 첨가한 배지(7H11 C7SB)로 구분하여 배지를 제조 하였다(Table 1). 최종 연구는 0.2% AC, 5% DSB를 첨가하고 monopotassium phosphate를 이용해 각각 pH (6.70, 6.74, 6.60)별로 제조하였다(Table 2).
최종 연구에서 검체 접종은 선별 검사에서 성장 인자를 찾는 데 초점을 맞추기보다는 적절하게 조합된 배지에 균종에 따른 성장 속도를 확인하기 위해 단계 희석한 균 부유액 100 μL을 접종하였다(Table 3).
, 35∼ 37℃에서 액체배지 6주, 고체배지 8주간 배양하였다[13]. 평가를 위해 매일 1회 관찰하여 고체배지에서 집락이 있는 경우와 MGIT액체배지에서 양성 감지 신호가 확인된 경우에는 모두 항산균 염색(Ziehl-Neelsen법)을 통하여 확인 검사를 시행하였다. 선별 연구의 평가 지표는 집락을 형성하는데 걸린 시간(time to detection, TTD)을 설정하여 전체 농도의 평균값으로 산출하였고, 최종적으로는 집락의 육안 판독에 대한 용이성을 추가하여 최종 평가하였다.
대상 데이터
1차 선별 연구에서 느리게 성장하는 H37Ra는 DSB를 첨가하였을 경우 평가에 이용한 다른 배지보다 가장 빠르게 성장하였고, L-AA를 단독으로 첨가한 배지와 7H11 배지의 성장 속도에서는 유의한 차이를 관찰할 수 없었으며, L-AA와 DSB를 모두 첨가한 배지와 DSB만을 첨가한 배지에서 유의한 성장 차이를 보이지 않아 DSB를 성장 인자로 선택하였다(Table 2).
L-AA를 배지에 첨가하면 미호기성 환경과 동일한 환경을 조성하여 결핵균 배양 및 rifampicin 감수성 검사 시간을 단축한다[11]. 검증을 위해 빠르게 성장하는 M. fortuitum을 이용하여 배양한 결과 배지에서 이틀째 배양되었다. L-AA＋AC를 포함된 배지보다 AC만 포함된 배지에서 집락의 크기는 비슷하나, 집락의 수가 더 많은 것을 확인하였고, 배양 조건의 비교는 7H11 C 배지를 미호기성 조건과 5% CO2 환경에서 배양한 결과 5% CO2 환경에서 집락의 수와 크기가 더 큰 것을 확인하였다.
연구에 사용한 표준균주(American Type Culture Collection, ATCC)는 빠르게 성장하는 균 M. fortuitum (ATCC 6841), 느리게 성장하는 균 H37Ra (ATCC 35835), M. intracellulare (ATCC 13950)의 3종 사용하였다. 최종 연구에서는 추가로 빠르게 성장하는 균 4종 M.
intracellulare (ATCC 13950)의 3종 사용하였다. 최종 연구에서는 추가로 빠르게 성장하는 균 4종 M. chelonae (ATCC 35749), M. massiliense (ATCC 307), M. abssessus (ATCC 308), M. peregrinum (ATCC 700686)를 사용하였고, 느리게 성장하는 M. avium (ATCC 35719), M. kansasii (ATCC 12478), M. tuberculosis (ATCC 27293)의 3종을 포함하여 총 10 균주를 사용하였다. 균 부유액은 15 mL tube에 멸균증류수를 10 mL 채우고 loop을 이용하여 적당량의 표준균주를 부유시킨 후, 멸균된 직경 3 mm bead를 이용해서 진탕하여 균액을 균질화한 후, 3 mL의 멸균증류수가 담긴 시험관에 균 부유액을 첨가하여 Mcfarland 0.
성능/효과
1차 선별 연구에서 DSB와 L-AA을 함께 첨가한 배지가 DSB 만 첨가한 배지보다 3종의 Mycobacterium이 모두 빠르게 성장할 것으로 예상 되었지만, DSB만 첨가한 배지에서 M. intracelluare의 평균 성장 기간이 1.2일 정도 빠르게 배양 되었다. DSB가 첨가 되었을 경우 배지 산도에 의해 용혈이 발생하여 적혈구 내에 존재하는 철 성분이 세포 밖으로 유출되어 비타민과 철 성분의 Fenton reaction으로 Mycobacterium에 대한 살균 작용을 하여 성장이 억제되었는지 의심이 가는 사항이며 [15], 혈액을 사용한 배지의 경우 오랜 기간 배양에 불리하였고, 배양 중 오염률이 높은 것을 확인할 수 있었다[16].
이 연구는 2 두 가지 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacteria과 느리게 성장하는 Mycobacteria에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 7H11 C 배지는 색상 대비로 인하여 10종의 모든 Mycobacterium에서 기존배지보다 더 뛰어난 판독 용이성을 보여 주었다. 특히, MTB가 성장했을 경우 집락의 크기가 다른 배지에서 보다 커서 시각화가 용이하였다.
L-AA를 제외한 2종류의 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacterium과 느리게 성장하는 Mycobacterium 모두의 성장에 도움이 되는 것이 본 연구를 통하여 확인하였다. 7H11 배지에서 Mycobacterium이 성장할 경우 집락 관찰이 어려움이 있는 반면 AC이 포함된 배지에서는 진한 회색 바탕에 흰색 및 크림색 집락을 보이는 Mycobacterium의 판독이 용이하였고, 균 성장 속도, 육안 판독 능력이 우수하여 환자 검체를 이용한 방법에서도 동일한 결과가 도출된다면, 현재 사용하는 Ogawa, 7H11 medium을 대체하여 Mycobacterium을 빠르게 진단하기 위한 선택 배지로 사용하여도 좋을 것으로 생각한다.
L-AA를 제외한 2종류의 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacterium과 느리게 성장하는 Mycobacterium 모두의 성장에 도움이 되는 것이 본 연구를 통하여 확인하였다. 7H11 배지에서 Mycobacterium이 성장할 경우 집락 관찰이 어려움이 있는 반면 AC이 포함된 배지에서는 진한 회색 바탕에 흰색 및 크림색 집락을 보이는 Mycobacterium의 판독이 용이하였고, 균 성장 속도, 육안 판독 능력이 우수하여 환자 검체를 이용한 방법에서도 동일한 결과가 도출된다면, 현재 사용하는 Ogawa, 7H11 medium을 대체하여 Mycobacterium을 빠르게 진단하기 위한 선택 배지로 사용하여도 좋을 것으로 생각한다.
fortuitum을 이용하여 배양한 결과 배지에서 이틀째 배양되었다. L-AA＋AC를 포함된 배지보다 AC만 포함된 배지에서 집락의 크기는 비슷하나, 집락의 수가 더 많은 것을 확인하였고, 배양 조건의 비교는 7H11 C 배지를 미호기성 조건과 5% CO2 환경에서 배양한 결과 5% CO2 환경에서 집락의 수와 크기가 더 큰 것을 확인하였다. 7H11 CP5SB 배지 산도가 pH 6.
빠르게 성장하는 Mycobacterium 있어 새로운 배지와 기존의 배지에서 검출 시간의 차이는 새로운 배지가 더 빠르다는 것을 확인시켜 주었다. M. kansasii와 M. intracelluare는 7H11 배지보다 7H11 C 배지에서 더 빠르게 자라는 것으로 확인되었다. MTB 는 7H11 C 배지에서 다른 배지보다 빠르게 성장하였다.
여러 논문이나 제조사에서 언급하듯이 액체배지가 고체배지보다 Mycobacterium 성장에 있어 빠르다고 언급하고 있다. 그러나 본 연구에서는 상반된 결과로 H37Ra를 제외한 9개 균주 모두에서 3% Ogawa를 제외한 고체배지에서 액체배지인 MGIT보다 양성 검출 시간이 빨랐다. 이러한 결과가 도출된 이유에 대하여 추론한 결과 검체의 접종량을 비교해 보면 고체배지는 100 μL검체를 접종하는 반면에 액체배지는 500 μL검체를 접종하라고 제조사에서 권장하고 있다.
느리게 성장하는 Mycobacterium 균종에서 H37Ra를 제외한 나머지 균종은 7H11 C에서 평균 성장 시간이 가장 빠른 것을 확인하였고, Mycobacterium 동정에 있어 가장 중요한 MTB도 7H11 C 배지에서 다른 배지보다 평균 2일 이상 빠르게 성장하였다. AC 단독 첨가한 배지와 AC와 DSB를 함께 첨가한 배지의 평균 성장 속도를 보게 되면, M.
또한 1.5×104 CFU/mL로 접종하고 15일 배양된 Mycobacterium tuberculosis 집락의 크기는 7H11 C 배지가 7H11 CP5SB 배지보다 커서 육안 판독 용이성이 우수하게 나타났다(Figure 2).
집락의 검출 시간 및 판독 용이성을 현재의 방법과 비교하였다. 빠르게 성장하는 Mycobacterium 있어 새로운 배지와 기존의 배지에서 검출 시간의 차이는 새로운 배지가 더 빠르다는 것을 확인시켜 주었다. M.
7H11 배지에서 집락 형성 초기에 소수의 집락이 관찰될 때 육안 판독이 용이하지 않아 양성 결과가 1∼2일 정도 늦게 판독된다. 연구에 사용한 Mycobacterium 10종에서 모두 7H11 배지보다 0.2% AC 포함된 배지에서 육안 판독이 우수한 것을 확인하였다(Figure 1). 또한 1.
MTB 는 7H11 C 배지에서 다른 배지보다 빠르게 성장하였다. 이 연구는 2 두 가지 성장 인자가 빠르게 성장하는 Mycobacteria과 느리게 성장하는 Mycobacteria에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 7H11 C 배지는 색상 대비로 인하여 10종의 모든 Mycobacterium에서 기존배지보다 더 뛰어난 판독 용이성을 보여 주었다.
이번 연구에서 성장 인자 중 AC에 대한 연구 결과가 가장 좋은 것으로 확인되었다. 어떠한 역할에 의해서 대부분의 Mycobacterium이 빠르게 성장했는지 의문이 가는 사항이다.
최종 연구에서 빠르게 성장하는 Mycobacterium 균종의 집락을 형성하는데 걸린 시간을 보면 0.2% AC 단독 포함된 7H11 C 배지에서 가장 빠른 것이 확인되었고, 7H11 CP5SB에서도 빠르게 성장하는 Mycobacterium은 현재 사용 중인 Ogawa medium, MGIT 액체배지보다 빠른 성장을 확인하였다. 하지만 AC 단독으로 첨가한 7H11 C보다 느리게 성장하였다(Table 5).
후속연구
7H11 agar에서 Mycobacterium이 성장할 때 암모니아를 발생하여 알칼리 환경을 조성한다[13]. AC은 이러한 대사산물을 제거하며, Mycobacterium가 잘 자랄 수 있게 배지 환경을 조성하여 성장을 촉진시켰는지를 추론해 보며, 추가 연구로 잡균이 섞여 있는 환자 검체를 이용하여 확인을 해 보아야 할 것이다.
그러나 100 μL 검체 접종량이 성장 시간과의 상관관계를 확인하기 어려워 MGIT에서 검체의 양에 따른 양성 시간을 확인을 해 보아야 할 것이며, 고체배지와 액체배지에 500 μL를 접종하여 비교할 때에는 고체배지 접종을 할 때는 원침 후 400 μL의 상층액을 버리고 농축된 100 μL을 접종하여 비교해야 정확할 것으로 생각된다.
20 보다 조금 높았으나 AC 만 첨가한 배지보다 산도가 결핵균 최적 산도에 가까웠다. 다음 연구에서는 AC와 DSB를 성장 인자로 monopotassium phosphate의 용량을 조절하여 산도에 따른 결핵균의 성장 속도와 AC와 L-AA 조합한 배지로 추가적인 연구를 진행해 보았으면 한다.
이번 연구를 통해서 성장 인자를 영양분으로 하여 배지에 첨가하는 방식으로도 배지를 개발할 수 있다. 하지만, 결핵균의 전사 촉진인자 또는 새로운 연구를 통해 다른 인자를 찾아 함께 이용한다면 진단에 있어 신속하고, 획기적인 고체배지의 개발에 한 걸음 더 다가갈 수 있을 것으로 생각된다.
이번 연구를 통해서 성장 인자를 영양분으로 하여 배지에 첨가하는 방식으로도 배지를 개발할 수 있다. 하지만, 결핵균의 전사 촉진인자 또는 새로운 연구를 통해 다른 인자를 찾아 함께 이용한다면 진단에 있어 신속하고, 획기적인 고체배지의 개발에 한 걸음 더 다가갈 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
본 연구에서 3% Ogawa를 제외한 고체배지에서 액체배지인 MGIT보다 양성 검출 시간이 빨랐던 이유는?
그러나 본 연구에서는 상반된 결과로 H37Ra를 제외한 9개 균주 모두에서 3% Ogawa를 제외한 고체배지에서 액체배지인 MGIT보다 양성 검출 시간이 빨랐다. 이러한 결과가 도출된 이유에 대하여 추론한 결과 검체의 접종량을 비교해 보면 고체배지는 100 μL검체를 접종하는 반면에 액체배지는 500 μL검체를 접종하라고 제조사에서 권장하고 있다. 그래서 접종량에 따른 성장 속도를 확인을 위해 고체배지와 액체배지에 500 μL씩 동일하게 접종한 연구 결과를 확인해 보면 BD BACTECTM MGITTM 960 Mycobacteria culture system (Becton, Dickinson and Company)는 결핵균의 평균 성장 시간이 11.
결핵은 어떤 질병인가요?
「감염병 예방 및 관리에 관한 법률」에 의하여 제3군 법정 감염병으로 지정되어 관리하는 공기매개 감염질환인 결핵은 Mycobacterium tuberculosis (MTB) 복합체의 구성원에 의한 세균감염 질병이다. 전염성 결핵 환자와 접촉하게 되면 30%가 감염되고, 감염된 사람 중 90%는 잠복 결핵 상태로 유지되며, 약 10%에서 환자로 진행된다.
NTM 감염환자를 치료하는 방법은?
그중 폐 질환은 NTM 감염의 90% 이상을 차지하며 액체배지 사용으로 임상 검체에서 분리 빈도가 높아지고 있다[2, 3]. NTM 감염은 임상 증상이 결핵과 유사하여 감별하기 힘들고, 기존 항결핵제에 높은 내성을 나타내어 치료 효율이 높지 않아 장기간 약제 병용요법으로 치료를 실시한다. 감염 경로는 토양, 자연수 등에 존재하는 균이 공기를 통해 감염되는 것으로 알려져 있다[2, 4].
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