[논문]추출 용매에 따른 Lactobacillus plantarum 발효 우슬의 항염증 효과 증진

조은솔; 우영민; 김옥주; 조민영; 안미영; 이재화; 하종명; 김안드레

doi:10.14478/ace.2018.1102

추출 용매에 따른 Lactobacillus plantarum 발효 우슬의 항염증 효과 증진
Enhancement of Anti-inflammatory Activity of Lactobacillus plantarum Fermented by Achyranthes japonica on Extraction Solvents 원문보기

공업화학 = Applied chemistry for engineering, v.30 no.2, 2019년, pp.145 - 150

조은솔 (신라대학교 자연과학연구소) , 우영민 (신라대학교 자연과학연구소) , 김옥주 (신라대학교 자연과학연구소) , 조민영 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 안미영 (신라대학교 제약공학과) , 이재화 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 하종명 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과) , 김안드레 (신라대학교 일반대학원 바이오과학과)

초록
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본 연구에서는 우슬(Achyranthes japonica, AJ)과 Lactobacillus plantarum으로 발효한 우슬(AJ-LP)을 5가지 용매(물, 에탄올, 헥산, 아세트산에틸, 부탄올)로 추출하여 RAW264.7 세포에서 항염증 활성에 미치는 영향을 확인하였다. lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 RAW264.7 세포에서 nitric oxide (NO) 및 cytokine 생성을 측정하였으며 western blot으로 cyclooxygenase-2(COX-2)와 nitric oxide synthase (iNOS)의 발현 정도를 관찰하였다. 세포 독성은 CCK assay를 통해 확인하였으며 독성을 가지지 않는 농도인 $100{\mu}g/mL$로 실험을 진행하였다. NO 생성 저해 활성 결과 AJ-LP를 에탄올(E)로 추출한 시료가 LPS만 처리한 control군에 비해 약 74%로 저해율이 가장 높았으며 염증관련 cytokine인 Interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), and Interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$)의 결과에서도 약 57, 70, 74%의 저해율로 우수한 효능을 보였다. COX-2와 iNOS 발현결과 AJ군에서 대조군(20-hydroxyecdysone)의 저해율이 가장 높은 것으로 나타났다. AJ-LP군에서 COX-2 발현량은 헥산(H)으로 추출한 시료가 대조군에 비해 약 16%로 감소하였고 iNOS 발현량은 부탄올(B)으로 추출한 시료가 약 7%로 감소하였다. 이상의 결과들에서 우슬보다 L. plantarum으로 발효한 우슬이 천연물 소재로서의 활용 가능성이 높음을 시사하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we used extracts obtained from five different solvents (water, ethanol, hexane, ethyl acetate, butanol) of Achyranthes japonica (AJ) and also AJ fermented with Lactobacillus plantarum (LP) to confirm effects on the anti-inflammatory activity in RAW264.7 cells. Experiments of measuring nitric oxide (NO) and cytokine production were performed in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 cells, and the expression of both cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) was observed by a western blot method. The cytotoxicity of RAW264.7 was confirmed by the cell counting kit (CCK) assay at a concentration of $100{\mu}g/mL$, which has no toxicity. As a result of the inhibition of NO production, the inhibition rate of AJ-LP extracted with ethanol samples was about 74% higher than that of using the control group. Interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), and Interleukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$), which are inflammatory cytokines, also showed an excellent efficacy with inhibition rates of about 57, 70, and 74%, respectively. Comparing to the results of COX-2 and iNOS expression in the AJ group, the inhibition rate of 20-hydroxyecdysone was the highest than others. On the other hand, the COX-2 expression level of AJ-LP group decreased about 16% compared to that of the control group, and the iNOS expression level was also decreased about 7%. These results suggest that the extract of AJ fermented from L. plantarum can be used as an anti-inflammatory natural material.

주제어

표/그림 (5)

그림 Figure 1. Effect of various extracts from Achyranthes japonica on RAW264.7 cells viability. RAW264.7 cells were treated with various concentrations of extract solutions (a) and L. plantarum fermentated extract solutions (b) for 24 h and cell viability was determined using the CCK assay. Data were expressed as percentage of control (20-H; 20-hydroxyecdysone, AJ; Achyranthes japonica, LP; Lactobacillus plantarum, w; water, E; ethanol, H; hexane, EA; ethyl acetate, B; butanol)(*p < 0.05, **p < 0.01).
그림 Figure 2. Effect of various extracts from Achyranthes japonica on LPS-induced nitrite production in RAW264.7 cells. The cells were pretreated with 100 μg/mL of extract solutions (a) and L. plantarum fermentated extract solutions (b) and LPS (1 μg/mL) for 24 h. The amount of nitrite in supernatant was measured using Griess reagent (20-H; 20-hydroxyecdysone, AJ; Achyranthes japonica, LP; Lactobacillus plantarum, w; water, E; ethanol, H; hexane, EA; ethyl acetate, B; butanol)(p < 0.05).
그림 Figure 3. Effect of various extracts from Achyranthes japonica on production of pro-inflammatory cytokine in LPS-induced RAW264.7 cells. IL-6 (a), TNF-α (b), IL-1β (c) was detected at 450 nm by ELISA method (20-H; 20-hydroxyecdysone, AJ; Achyranthes japonica, LP; Lactobacillus plantarum, w; water, E; ethanol, H; hexane, EA; ethyl acetate, B; butanol)(p < 0.05).
그림 Figure 4. Effect of various extracts from Achyranthes japonica on COX-2 and iNOS protein expressions in LPS-induced RAW264.7 cells. The level of COX-2 and iNOS were determined extract solutions by a western blot analysis and β-actin was used as house keeping gene (a). (b) shows the expression of COX-2 to β-actin and (c) of iNOS to β-actin (20-H; 20-hydroxyecdysone, AJ; Achyranthes japonica, w; water, E; ethanol, H; hexane, EA; ethyl acetate, B; butanol).
그림 Figure 5. Effect of various extracts from Achyranthes japonica on COX-2 and iNOS protein expressions in LPS-induced RAW264.7 cells. The level of COX-2 and iNOS were determined L. plantarum fermentated extract solutions by a western blot analysis and β-actin was used as house keeping gene (a). (b) shows the expression of COX-2 to β-actin and (c) of iNOS to β-actin (20-H; 20-hydroxyecdysone, AJ; Achyranthes japonica, LP; Lactobacillus plantarum, w; water, E; ethanol, H; hexane, EA; ethyl acetate, B; butanol).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 유산균의 일종인 L. plantarum으로 발효시킨 우슬과, 발효 과정을 거치지 않은 우슬을 물(W), 에탄올(E), 헥산(H), 아세트산에틸(EA), 부탄올(B)의 5가지 용매로 추출한 후 LPS로 염증을 유도한 RAW264.7 대식세포에서 염증 주요 매개물질인 NO 생성 억제 효과 및 COX-2와 iNOS의 발현에 미치는 영향을 연구하여 항염증 활성을 알아보고자 한다.

제안 방법

염증반응이 활성화되면 L-arginine에서 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 NO가 합성되며 과도한 NO 생성은 염증의 심화와 그로 인한 조직의 손상을 초래한다[23]. 따라서 AJ와 AJ-LP의 추출용매별 NO생성 저해능을 알아보기 위해 RAW264.7 세포를 LPS로 자극시킨 후, 시료 및 대조군을 100 µg/mL 농도로 첨가하여 NO 억제 활성을 분석하였다(Figure 2). LPS만 처리한 control군이 normal군에 비해 NO 생성량이 많은 것으로 보아 염증이 유도된 것을 확인하였다.
plantarum을 첨가한 후 37 ℃ shaking incubator에서 3일 동안 배양하였다. 이후 AJ와 AJ-LP에 우슬 무게의 5배에 해당하는 물(W), 에탄올(E), 헥산(H), 아세트산에틸(EA), 부탄올(B) 용매를 각각 따로 추가하여 37 ℃ shaking incubator에서 1일 동안 추출하였다. 추출액을 3,000 rpm으로 10 min 동안 원심분리하여 Whatman No.

대상 데이터

본 실험에 사용된 우슬(Achyranthes japonica, AJ)은 (주)제이앤디에서 파우더 형태로 구입하였다. 우슬(AJ)은 우슬 무게의 5배에 해당하는 멸균수를 첨가하고, L.

데이터처리

실험 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며 유의성 차이를 검증하기 위해 SPSS 20 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)프로그램을 사용하여 one-way ANOVA 분석 후 P < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple test를 실시하였다.

이론/모형

AJ와 AJ-LP를 용매별로 추출한 시료의 NO 생성량을 측정하기 위해 NO assay를 시행하였다. RAW264.
시료 농도에 따른 세포독성을 확인하기 위해 RAW264.7 세포의 CCK assay를 실시하였다. RAW264.
시료가 LPS로 유도된 RAW264.7 세포에서 생성되는 pro-inflammatory cytokine (IL-6, TNF-α, IL-1β)의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 ELISA 방법으로 측정했다(Figure 3). IL-6의 결과에서 control군이 527.

성능/효과

또한, TNF-α는 IL-6의 결과와 비슷한 경향을 나타냈으며 두 결과 모두 AJ군보다 AJ-LP군에서 저해 효능이 뛰어났다. Cytokine의 pro-inflammatory agent에 의해 과발현되어 염증과 관련되는 COX-2와 iNOS의 발현량을 살펴본 결과 AJ군의 여러 용매 추출 시료가 대조군보다 높은 저해 활성을 나타내지는 않았지만, AJ-LP군에서는 W, E, H, EA가 COX-2 발현 결과에서 대조군보다 높은 저해 활성을 가졌으며 EA, B는 iNOS 발현 결과에서 대조군보다 높은 저해 활성을 나타냈다. Yang[22] 등의 결과에서는 TNF-α가 iNOS 발현을 자극하여 NO 분비를 촉진하는 것으로 보고되어 있다.
4%의 저해율을 나타냈다. AJ를 E와 H로 추출한 시료와 AJ-LP를 W, E, H, EA로 추출한 시료가 대조군보다 높은 NO 저해율을 나타냈다. 염증 생성전사 인자인 cytokine의 생성을 알아보기 위해 대표되는 IL-6, TNF-α 및 IL-1β를 측정하였다.
이는 iNOS 단백질 발현 억제 효능이 NO 및 TNF-α 생성에도 영향을 주는 것으로 판단된다. 위 결과들을 종합적으로 판단해보면 발효하지 않은 우슬보다는 유산균으로 발효한 우슬 시료가 항염증 효과가 뛰어났으며, 그중에서도 에탄올로 추출한 시료가 산화적 스트레스에 기인한 활성산소를 감소시킴으로써 LPS 자극에 의한 cytokine 및 COX-2와 iNOS 발현을 억제시켜 항염증 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다. Lee[23] 등에서 유산균 발효로 인해 나타나는 생리효과에는 정장 효과, 항종양 효과, 면역부활 효과 등이 있으며 특히 L.

후속연구

Kim[24] 등에서는 발효로 인해 기능성 물질의 양이 증가하거나 흡수율이 높은 형태로 전환되는 효과를 가진다는 연구결과가 보고되어 있고, Choi[25] 등은 발효 및 에탄올 또는 열수 추출의 병행은 미생물 대사활동에 의해 천연물의 유효성분과 생리활성물질의 양을 증가시키거나 새로운 물질의 생성을 기대할 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 L. plantarum 발효로 인하여 우슬의 유효 생리활성물질이 효과적으로 추출됨으로써 항염증 효과가 증대됨을 확인하였고 이는 항염증 기능을 가지는 천연물 소재가 될 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	NO 억제 활성의 분석을 통해 염증 개선 효과를 유추할 수 있는 근거는 무엇인가?	염증반응이 활성화되면 L-arginine에서 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 NO가 합성되며 과도한 NO 생성은 염증의 심화와 그로 인한 조직의 손상을 초래한다[23]. 따라서 AJ와 AJ-LP의 추출용매별 NO 생성 저해능을 알아보기 위해 RAW264.
	과도한 염증반응은 신체에 어떤 영향을 주는가?	염증반응은 내독소, 세균 감염 등의 외부자극에 대해 생체 조직을 복구 및 재생시키려는 방어반응 기작이다[1]. 그러나 염증반응이 과도하게 일어나면 생체 내 활성산소가 증가하게 되고 산화적 스트레스에 노출이 되어 세포 손상이 일어남으로써 만성 염증성 질환, 신경계 질환, 당뇨, 심혈관계 질환, DNA 손상 및 암을 유발할 뿐만 아니라 퇴행성 질환을 유발하는 특정 세포의 유전자 발현이 증가된다[2,3]. 면역조절작용에서 대식세포는 1차적으로 바이러스, 세균, 노화세포, 암세포 등을 제거하는 탐식작용을 하고 생리활성물질과 cytokine을 분비하여 2차적으로 면역반응을 활성화시킨다[4].
	우슬(Achyranthes japonica)은 무엇인가?	우슬(Achyranthes japonica)은 한방에서 쇠무릎의 뿌리를 지칭하는 비름과 다년초 식물이며 한국, 중국, 일본 등의 아시아 지역에 광범위하게 분포되어 있다[11]. 우슬의 생리활성 성분으로는 oleanolic acid계 saponin, steroid계 β-sitosterol, stigmasterol, rubrosterone과 그 밖의 in-okosterone, ecdysone, 20-hydroxyecdysone 등이 보고되어 있다[12].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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