[논문]Lactobacillus plantarum으로 발효한 뽕잎 추출물의 항당뇨 효과

최지수; 이설희; 박영서

doi:10.9721/kjfst.2020.52.2.191

Lactobacillus plantarum으로 발효한 뽕잎 추출물의 항당뇨 효과
Anti-diabetic effect of mulberry leaf extract fermented with Lactobacillus plantarum 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.52 no.2, 2020년, pp.191 - 199

최지수 (가천대학교 식품생물공학과) , 이설희 (가천대학교 식품생물공학과) , 박영서 (가천대학교 식품생물공학과)

초록
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본 연구에서는 발효식품으로부터 항당뇨 효능을 지닌 유산균을 분리하여 뽕잎 추출물을 발효하고, 제조된 유산균 발효 뽕잎 추출물의 항당뇨 효능을 평가하였다. 갓김치에서 분리된 Lactobacillus plantarum SG-053은 α-glucosidase 저해 활성이 96.8%로 가장 우수하고, 뽕잎을 발효하여 뽕잎에 존재하는 항당뇨 지표물질인 1-deoxynojirimycin (DNJ)의 함량을 2.2배 증가시키며 우수한 생육 활성을 나타내어 본 연구에서 뽕잎 추출액의 발효에 사용하였다. L. plantarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물은 L6 근관세포에 대한 세포독성은 없었고, IRS-1, PI3K p85α, GLUT-4 유전자 발현을 각각 1.4, 2.2, 1.4배로 증가시켰으며, 세포의 2-deoxyglucose 흡수를 1 μM의 인슐린보다 높은 수준인 40.7% 증가시켜 인슐린 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 세포의 인슐린 저항성을 개선하는 것으로 확인되었다. 경구 당 부하 검사를 통해 유산균 발효 뽕잎 추출물이 포도당 섭취에 의해 증가한 혈당을 빠르게 감소시키고, α-glucosidase의 저해를 통해 maltose의 분해에 의한 혈당 증가를 억제하였다. 유산균 발효 뽕잎 추출물은 SD rat의 허벅지 골격근 조직의 PI3K p85α와 GLUT-4 유전자 발현을 각각 6.4, 2.1배 증가시켜 L6 근관세포에서와 유사한 결과를 나타냈으며, in vivo 근육 조직에서도 인슐린 신호전달경로의 활성화에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 본 연구 결과로 L. plantarum SG-053이 뽕잎을 효과적으로 발효하여 DNJ의 함량을 증진시킨다는 것을 확인하였으며, L. plantarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물은 우수한 항당뇨 효능을 지니는 것을 세포 및 동물실험 수준에서 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to isolate novel lactic acid bacteria to ferment mulberry leaf extract (MLE) and to investigate its anti-diabetic effect. Lactobacillus plantarum SG-053 isolated from gatkimchi was selected to ferment MLE because it exhibited high α-glucosidase inhibitory activity (96.8%) and enhanced the content of 1-deoxynojirimycin (DNJ), an anti-diabetic substance, in fermented MLE up-to 2.2 times. MLE fermented with L. plantarum SG-053 (FMLE) showed growth promoting activity against L6 myotubes and increased the gene expressions of IRS-1, PI3K p85α, and GLUT-4 up-to 1.4, 2.2, and 1.4 times, respectively, and 2-deoxyglucose uptake up-to 40.7%. In rat skeletal muscle tissue, the expressions of PI3K p85α and GLUT-4 increased by 6.4 and 2.1 times, respectively. These results suggest that L. plantarum SG-053 could enhance the DNJ content of MLE by fermentation and that FMLE is effective in ameliorating insulin resistance via activation of the insulin signaling pathway.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. The sequence of primers for real-time PCR
그림 Fig. 1. Phylogenetic tree of L. plantarum SG-053 generated by neighbor-joining method based on the sequence of 16S rRNA gene.
표 Table 2. Growth rate of Lactobacillus plantarum SG-053 in mulberry leaf extract, α-glucosidase inhibitory activity of L. plantarum SG-053, and 1-Deoxynojirimycin content of mulberry leaf extract by fermentation using Lactobacillus plantarum SG-053
그림 Fig. 2. Effect of fermented mulberry leaf extract on the viability of L6 myotubes.
그림 Fig. 3. Effect of fermented mulberry leaf extract on the expressions of IRS-1 (A), PI3K p85α (B), and GLUT-4 (C) genes in L6 myotubes.
그림 Fig. 4. Effect of fermented mulberry leaf extract on the uptake of 2DG in L6 myotubes.
그림 Fig. 5. Relative postprandial blood glucose level of SD rats treated with or without fermented mulberry leaf extract and glucose (A) and maltose (B).
그림 Fig. 6. Effect of fermented mulberry leaf extract on the expressions of IRS-1, PI3K p85α, and GLUT-4 genes in SD rats.
그림 Fig. 7. Insulin receptor signaling pathway.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 발효식품으로부터 항당뇨 효능을 지닌 유산균을 분리하여 뽕잎 추출물을 발효하고, 제조된 유산균 발효 뽕잎추출물의 항당뇨 효능을 평가하였다. 갓김치에서 분리된 Lacto-bacillus plantarum SG-053은 α-glucosidase 저해 활성이 96.
본 연구에서는 항당뇨 효능이 있는 것으로 알려진 뽕잎을 발효하여 기능성을 향상시킬 수 있는 유산균주를 탐색하고, 항당뇨 효능이 강화된 유산균 발효 뽕잎 추출물을 제조하여 그 기능성을 평가하고자 하였다. 이를 위해 다양한 식품으로부터 분리한유산균주의 뽕잎 추출물에 대한 발효 적성을 평가하고, 유산균 뽕잎 추출물의 발효물을 근원세포와 동물실험을 통하여 항당뇨 효능을 확인하였다.

제안 방법

EZ-CYTOX (DoGenBio, Seoul, Korea)를 20 µL 첨가하여 37℃의 암소에서30분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 계산하였다.
뽕잎 추출물에 유산균 종배양액을 1% (v/v) 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 뒤 배양액 내 DNJ의 함량을 분석하였다. HPLC를 이용하여 유산균 발효 뽕잎 추출물의 DNJ 함량을 분석하기위해 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl, Sigma-Aldrich Co.)의 첨가반응을 다음과 같이 진행하였다. 5 mM의 농도가 되도록 acetonitrile에 용해시킨 FMOC-Cl 용액 20 μL에 10 μL의 유산균 발효 뽕잎 추출물과 10 μL의 0.
KRPH 완충용액 첨가 30분 후 인슐린을 최종 농도 1µM이 되도록 첨가하고, 시료를 일정 농도별로 처리하였다.
파쇄된 세포는 80℃에서 15분 열처리한 뒤 4℃, 15,000×g에서 20분간 원심분리하였다. Kit의 시료 희석용 완충용액으로 5배 희석한 상등액을 glucose uptake assay의 시료로 사용하여 제공된 실험 방법에 따라 세포 내 2DG 흡수를 측정하였으며, 시료의 단백질을 정량하여 표준화하였다.
L6 세포는 rat의 허벅지 근육으로부터 분리한 근원세포로 horse serum 등의 자극에 의해 근관세포로 분화하며, 인슐린에 반응하여 다양한 포도당 수송체(GLUT)를 발현하기 때문에 세포의 포도당 흡수 측정 시 널리 이용되고 있다(Kang 등, 2005). L. plan-tarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물의 L6 근관세포에 대한 세포 독성 평가를 수행하기 위하여, 분화된 L6 근관세포에 당뇨병치료제로 사용되고 있는 acarbose와 발효 전후의 뽕잎 추출물을 농도별로 첨가한 뒤 세포의 생존율을 측정하여 생존 세포 수가시료 미첨가군 대비 80% 이하일 경우 세포에 대한 독성이 있는것으로 판단하였다(Fig. 2). Acarbose는 5 mg/mL 이상에서 세포의생존율을 유의적으로 감소시켜 10 mg/mL를 처리하였을 때 생존율이 76.
L6 근원세포의 포도당 이용 능력은 2-deoxyglucose (2DG)의 흡수를 측정해 분석하였으며, 2-Deoxyglucose Uptake Measurement Kit (CosmoBio, Tokyo, Japan)를 이용하였다. 세포 수가 1×10⁶ cells/well이 되도록 6-well plate에 부착시킨 후 분화를 유도하였다.
각 배지에서 형태가 다른 집락을 선택하여 순수 분리된 균주는 MRS 배지(BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 배양한 후 40% (v/v)글리세롤을 동량 첨가하여 −80℃에 보관하여 사용하였다.
유산균의 분리를 위해 제주도에서 김치, 젓갈 등의 발효식품과해산물, 감귤류 등을 다수의 지역 시장에서 수집하였다. 각 시료1g을 멸균 생리식염수(0.88% (w/v) NaCl)에 현탁한 후 십진희석하여 0.005% bromocresol purple이 첨가된 PCA 배지(KisanBio, Seoul, Korea)에 도말한 뒤 37℃에서 16시간 배양하였다. 각 배지에서 형태가 다른 집락을 선택하여 순수 분리된 균주는 MRS 배지(BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA)에 배양한 후 40% (v/v)글리세롤을 동량 첨가하여 −80℃에 보관하여 사용하였다.
또한, 유산균 발효 뽕잎 추출물의 식후 혈당 강하 기전을 확인하기 위하여 경구 맥아당 부하 시험(oral maltose tolerance test, OMTT)을 수행하였다. 경구 투여된 맥아당은 소장과 췌장에서 분비되는 maltase에 의해 포도당으로 분해되어 흡수된다.
반응 종료를 위해 20℃에서 보관된 0.1 M glycine을 10 µL 첨가한 후 950 µL의 0.1%(v/v) acetic acid를 첨가하여 0.2 µm PVDF 여과지로 여과하였다.
OMTT는탄수화물의 소화 과정 중 이당류의 분해 능력을 확인할 수 있어 in vivo α-glucosidase 저해능을 평가할 수 있는 시험 방법으로, 가수분해 전분을 이용하는 것보다 오차가 적고, 포도당을 이용하는것보다 부작용이 적다(Harano 등, 1977; Jeon 등, 2018). 본 연구에서는 모든 시험군의 공복 혈당 농도를 100%로 설정한 뒤 맥아당 용액 투여 후 30분 간격으로 혈당을 측정하여 공복 혈당에대한 백분율로 표시하였다(Fig. 5(B)).
경구 포도당 부하시험(oral glucose tolerance teat, OGTT)은 공복 혈당과 포도당 용액 경구 투여 2시간 뒤의 혈당을 통해 당뇨병을 진단하는 방법으로, OGTT 수행시 혈중 포도당 농도는 호르몬이나 신경 반응, 장 운동 등의 영향을 받기 때문에 재현성의문제가 있지만, 피험자의 제2형 당뇨병을 쉽게 진단할 수 있어 수십 년간 당뇨병의 진단에 사용되어 왔다(Bartoli 등, 2011). 본 연구에서는 모든 시험군의 공복 혈당 농도를 100%로 설정한 뒤체중 kg 당 5mL의 40% 포도당 용액을 투여한 후 30분 간격으로 혈당을 측정하여 공복 혈당 농도에 대한 백분율로 표시하였다(Fig. 5(A)).
당 용액 투여 2시간 후 과량의 isoflurane으로 희생시켜 허벅지 근육 조직을 분리하였다. 분리된 조직 50 mg에 1 mL easy-BLUE를 첨가한 뒤 균질기를 이용해 조직을 파쇄하여 총 RNA를 추출하고 포도당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 정량하였다.
뽕잎 추출물에 유산균 종배양액을 1% (v/v) 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 뒤 배양액 내 DNJ의 함량을 분석하였다. HPLC를 이용하여 유산균 발효 뽕잎 추출물의 DNJ 함량을 분석하기위해 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl, Sigma-Aldrich Co.
선별된 유산균은 MRS 한천배지에서 배양시켜 집락을 형성시킨 후 한 개의 집락을 MRS 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양시킴으로써 종배양액을 제조하였다. 종배양액을 MRS 배지(BD Difco)에 1% (v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤13,000×g에서 1분간 원심분리한 후, 상등액의 α-glucosidase 저해활성을 평가하였다.
분양 받은 세포는 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific)과 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific)이 포함된 저농도-포도당 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포의 분화에는 1%penicillin-streptomycin과 2% horse serum (Thermo Fisher Scien-tific)이 포함된 저농도-포도당 DMEM 배지를 사용하였으며, 분화 유도 후 48시간마다 새로운 배지로 교체하여 5일 이후 사용하였다.
수컷 SD rat에 체중 kg 당 1.84 g (6 mg DNJ/kg body weight)의 유산균 발효 뽕잎 추출물을 경구 투여한 뒤 30분 후 40% 포도당 용액을 체중 kg 당 5mL 경구투여하였다. 당 용액 투여 2시간 후 과량의 isoflurane으로 희생시켜 허벅지 근육 조직을 분리하였다.
84 g의 시험물질(6 mg DNJ/kg 체중)을 경구 투여한 뒤, 꼬리 정맥에서 채혈해 혈당 농도를 측정하였다. 시료 투여 30분 후 40% 포도당 용액과 맥아당 용액을 체중 kg 당 5mL씩 경구 투여하고, 투여 직후와 30, 60, 90, 120분 뒤의 혈당 농도를 측정하였다.
실험동물의 내당능 측정을 위해 대조군(PBS 투여군, control),포도당 투여군(Glc), 포도당/시험물질 동시투여군(Glc/F), 맥아당투여군(Mal), 맥아당/시험물질 동시투여군(Mal/F)으로 시험군을 나누었다(n=6). 실험 전 절식하여 공복 상태를 유지하고, Glc/F와Mal/F 시험군에게 체중 kg 당 1.84 g의 시험물질(6 mg DNJ/kg 체중)을 경구 투여한 뒤, 꼬리 정맥에서 채혈해 혈당 농도를 측정하였다. 시료 투여 30분 후 40% 포도당 용액과 맥아당 용액을 체중 kg 당 5mL씩 경구 투여하고, 투여 직후와 30, 60, 90, 120분 뒤의 혈당 농도를 측정하였다.
실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기 횟수 시간당 10-20회, 조명시간 12시간(오전 8시-오후 8시) 및 조도 150-300 Lux의 조건에서 사육하였으며, 2주 이상의 적응 기간 이후 경구 당부하 검사와 실험동물의 허벅지 근육 조직에서 포도당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 정량하였다.
실험동물의 내당능 측정을 위해 대조군(PBS 투여군, control),포도당 투여군(Glc), 포도당/시험물질 동시투여군(Glc/F), 맥아당투여군(Mal), 맥아당/시험물질 동시투여군(Mal/F)으로 시험군을 나누었다(n=6). 실험 전 절식하여 공복 상태를 유지하고, Glc/F와Mal/F 시험군에게 체중 kg 당 1.
유산균 발효 뽕잎 추출물 처리에 따른 L6 근관세포의 포도당흡수도 변화는 2DG를 이용하여 평가하였다. 세포 내로 2DG가흡수되면 2-deoxyglucose 6-phosphate (2DG6P)로 인산화된 뒤 6-phospho-2-deoxyglucuronic acid로 산화되는데, 이 과정에서 발생하는 NADPH를 검출하여 세포의 2DG 흡수량을 정량할 수 있다(Saito 등, 2011).
유산균 발효 뽕잎 추출물의 혈당 강하 효과를 확인하기 위해,분화된 L6 근관세포에 유산균 발효 뽕잎 추출물을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mg/mL의 농도로 처리한 후 인슐린 신호전달경로에 관여하는IRS-1, PI3K p85α, GLUT-4의 발현량을 측정하였다.
컬럼 오븐의 온도는 30℃로 설정하고, 시료는 10 µL씩 주입하였다. 이동상은 0.1%(v/v) acetic acid와 acetonitrile을 각각 60, 40% (v/v)로 설정하여1.2 mL/min의 유속으로 30분간 분석하였고, 결과는 ChromeleonTM 7.2 Chromatography Data System을 사용하여 분석하였다.
이를 위해 다양한 식품으로부터 분리한유산균주의 뽕잎 추출물에 대한 발효 적성을 평가하고, 유산균 뽕잎 추출물의 발효물을 근원세포와 동물실험을 통하여 항당뇨 효능을 확인하였다.
종배양액을 MRS 배지(BD Difco)에 1% (v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 뒤13,000×g에서 1분간 원심분리한 후, 상등액의 α-glucosidase 저해활성을 평가하였다.
한편, 포도당과 유산균 발효 뽕잎 추출물을 투여한 SD rat의 허벅지 근육 조직으로부터 총 RNA를 추출하여 mRNA 수준에서PI3K p85α, IRS-1, GLUT-4의 유전자 발현을 측정하였다.
합성한 cDNA는 FastStart Essential DNA Green Master (Roche)를 이용하여LightCycler® 96 (R℃he)에서 측정하였다.

대상 데이터

여과한 시료는 HPLC로 분석하여 발효 전에 비해 DNJ 함량이100% 이상 증가한 유산균을 선별하였다. DNJ 분석에 이용된HPLC는 UltiMate^TM 3000 HPLC 시스템(Thermo Fisher Scien-tific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. 검출기는 UltiMate^TM 3000 Fluorescence Detector (Thermo Fisher Scientific)를 이용하였으며, 분석 파장은 여기파장 254 nm, 방출파장 322 nm로 설정하였다.
갓김치에서 분리된 Lacto-bacillus plantarum SG-053은 α-glucosidase 저해 활성이 96.8%로가장 우수하고, 뽕잎을 발효하여 뽕잎에 존재하는 항당뇨 지표물질인 1-deoxynojirimycin (DNJ)의 함량을 2.2배 증가시키며 우수한 생육 활성을 나타내어 본 연구에서 뽕잎 추출액의 발효에 사용하였다.
DNJ 분석에 이용된HPLC는 UltiMate^TM 3000 HPLC 시스템(Thermo Fisher Scien-tific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. 검출기는 UltiMate^TM 3000 Fluorescence Detector (Thermo Fisher Scientific)를 이용하였으며, 분석 파장은 여기파장 254 nm, 방출파장 322 nm로 설정하였다. 컬럼은 ZORBAX Eclipse Plus C18 (4.
대조군으로는 시판 α-glucosidase 저해제 계열의 경구용 혈당강하제인 acarbose (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.
배양된 세포의 RNA 추출에는 easy-BLUE™ Total RNA Extrac-tion Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하였다.
본 연구에 사용된 뽕잎은 제천약초(Jecheon, Korea)에서 건조된 것을 구입하여 4℃에서 보관하며 사용하였다. 건조된 뽕잎 무게의 20배에 해당하는 증류수를 넣고 100℃에서 2시간 동안 추출한 뒤 여과포로 여과하여 3^oBx로 농축한 것을 뽕잎 추출물로 사용하였다.
유산균 발효 뽕잎 추출물의 당뇨 억제 활성을 평가하기 위해 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 rat 유래의 L6 근원세포(KCLB 21458)를 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 세포는 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific)과 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific)이 포함된 저농도-포도당 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포의 분화에는 1%penicillin-streptomycin과 2% horse serum (Thermo Fisher Scien-tific)이 포함된 저농도-포도당 DMEM 배지를 사용하였으며, 분화 유도 후 48시간마다 새로운 배지로 교체하여 5일 이후 사용하였다.
세포 수가 1×10⁶ cells/well이 되도록 6-well plate에 부착시킨 후 분화를 유도하였다. 분화가 완료된 세포의 배지를 무혈청 저농도-포도당 DMEM으로 교체하여 배양하였다. 배양 6시간 후 3mL의 Krebs-Ringer Phosphate Hepes (KRPH) 완충용액(1.
상기 결과로부터 갓김치에서 분리된 SG-053 균주를 뽕잎 추출물의 발효를 위한 균주로 최종 선정하였다. 최종 선정된 유산균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 계통수 분석을 수행한 결과 SG-053 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색 결과 L.
유산균 발효 뽕잎 추출액의 당뇨 억제 활성은 서울대학교 융합과학기술대학원(Suwon, Korea)에 의뢰하여 평가하였으며, 우정바이오(Suwon, Korea)의 동물실험윤리위원회(IACUC)의 허가를 받아 진행되었다(승인번호 WJIACUC20190405-2-06). 실험동물은7주령의 Sprague-Dawley (SD) rat 수컷을 이용하여 수행하였고,㈜오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기 횟수 시간당 10-20회, 조명시간 12시간(오전 8시-오후 8시) 및 조도 150-300 Lux의 조건에서 사육하였으며, 2주 이상의 적응 기간 이후 경구 당부하 검사와 실험동물의 허벅지 근육 조직에서 포도당 대사에 관여하는 유전자의 발현을 정량하였다.
유산균 발효 뽕잎 추출물의 당뇨 억제 활성을 평가하기 위해 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 rat 유래의 L6 근원세포(KCLB 21458)를 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 세포는 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific)과 10% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific)이 포함된 저농도-포도당 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.
유산균의 분리를 위해 제주도에서 김치, 젓갈 등의 발효식품과해산물, 감귤류 등을 다수의 지역 시장에서 수집하였다. 각 시료1g을 멸균 생리식염수(0.

데이터처리

Data were analyzed by one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple range test for significance of individual comparisons (p<0.05).
실험 결과는 세 번의 반복 실험에 의해 얻어졌으며, 평균 값± 표준 편차로 표시하였다.
실험값은 SPSS 23 software (IBM, NY, USA)를 이용하여 Student’s t-test를 통해 p<0.05 수준에서 두 집단의 유의성을 검증하였으며, 다 그룹 간의 차이는 one-way ANOVA를 시행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 집단 간 유의성을 검증하였다.

이론/모형

Primer의 서열은 Table 1에 나타내었고(Cai 등, 2016), 유전자의 상대적 발현량은 2-ΔΔCt계산법을 사용하여 분석하였다(Livak와 Schmittgen, 2001).
선별된 균주의 동정은 Lee와 Park(2017)의 방법에 따라 균주의16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통수(phylogenetic tree) 작성 및 분석에 의해 수행하였다.

성능/효과

1차 선별된 유산균주를 대상으로 α-glucosidase 저해 활성을 측정한 결과 27개 균주중에서 16개 균주가 90% 이상의 저해 활성을 나타내었다.
2). Acarbose는 5 mg/mL 이상에서 세포의생존율을 유의적으로 감소시켜 10 mg/mL를 처리하였을 때 생존율이 76.8%까지 감소하여 세포독성이 있는 것으로 확인되었다.뽕잎 추출물은 5mg/mL 농도에서 세포의 생존율을 8.
4배 증가하였다. GLUT-4 발현도 또한 포도당 투여군에서 대조군의 1.4배 발현되었으나 유의적인 차이는 없었고, 포도당과 유산균 발효뽕잎 추출물 투여군에서 대조군의 2.1배 유의적으로 증가하였다.근육 조직에서 PI3K p85α와 GLUT-4의 발현이 증가하여 L6 근관세포와 유사한 결과가 나타났으나, IRS-1의 발현은 감소하였다.
3(B)). GLUT-4의 발현량은 저농도(0.01 mg/mL)의 유산균 발효 뽕잎 추출물 처리 시 1.4배 유의적으로 증가하였다(Fig. 3(C)).
L. plantarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물은 L6 근관세포에 대한 세포독성은 없었고, IRS-1, PI3K p85α, GLUT-4유전자 발현을 각각 1.4, 2.2, 1.4배로 증가시켰으며, 세포의 2-deoxyglucose 흡수를 1µM의 인슐린보다 높은 수준인 40.7% 증가시켜 인슐린 신호전달 경로를 활성화시킴으로써 세포의 인슐린 저항성을 개선하는 것으로 확인되었다.
7% 감소시켰다. L. plantarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물은 처리한 모든 농도에서 세포의 생육을 촉진하는 것으로 나타나 뽕잎 추출물이나 뽕잎 추출물의 유산균 발효액은 L6 근원세포에 대하여 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. Bae 등(2018)의 연구에서도 0.
Mal 시험군과 Mal/F 시험군의 최대 혈당 농도는 각각 공복 혈당 대비 144.4, 103.6%로 40.8%의 차이를 나타냈으며, Mal/F 시험군에서는 맥아당 투여 후2시간 동안 혈당이 거의 증가하지 않은 것으로 보아 Mal/F 시험군에서 소장의 α-glucosidase에 의한 맥아당의 분해가 저해되어체내로 흡수되지 않은 것으로 판단되었다.
Li 등(2013)의 연구에서 정상 쥐와 당뇨 쥐의 OGTT 실험에서 DNJ가 혈당의 상승을 억제했는데, 소장에서 포도당을 체내로 흡수하는 SGLT1과 GLUT2의 발현이 감소하여 DNJ에 의해 포도당이 체내로 흡수되지 않는 것으로 확인되었다. OGTT 시험을 통해 유산균 발효 뽕잎 추출물의 투여는 식후 혈당 농도를 완만하게 상승하도록 하며, 빠르게 정상 수준으로 회복시킨다는 것을 확인하였다. 이는 소장에서의 포도당 흡수를 지연시키거나, 체내 흡수된 포도당을세포에서 빠르게 이용하도록 하는 것과 관련이 있는 것으로 판단되었다.
PI3K p85α의 발현은 포도당에 의해 2.4배증가하였으나 유의적인 차이는 없었고, 유산균 발효 뽕잎 추출물에 의해 포도당 처리군보다는 2.7배 증가, 대조군보다는 6.4배 증가하였다.
경구 당 부하 검사를 통해 유산균 발효 뽕잎 추출물이 포도당 섭취에 의해 증가한 혈당을 빠르게 감소시키고, α-glucosidase의 저해를 통해 maltose의 분해에 의한 혈당 증가를 억제하였다.
한편, 포도당과 유산균 발효 뽕잎 추출물을 투여한 SD rat의 허벅지 근육 조직으로부터 총 RNA를 추출하여 mRNA 수준에서PI3K p85α, IRS-1, GLUT-4의 유전자 발현을 측정하였다. 그 결과 Fig. 6에 나타낸 바와 같이 포도당을 투여하였을 때 IRS-1의발현은 유의적인 변화는 없었으나 대조군의 0.5배로 감소하였고,유산균 발효 뽕잎 추출물을 투여한 뒤 포도당을 투여한 시험군의 IRS-1 발현은 포도당 투여군에 비해 1.7배 증가하였으나, 대조군과는 유사하였다. PI3K p85α의 발현은 포도당에 의해 2.
1%로 증가하여 60분부터는 대조군과 유의적인 차이를보였다. 맥아당 용액 투여 30분 전 유산균 발효 뽕잎 추출물을투여한 시험군(Mal/F)에서는 맥아당 용액 투여 후 120분 동안 혈당 농도에 큰 변화가 없었으며, 93.7-103.6% 사이에서 유지되어 Mal 시험군과 유의적인 차이를 보였다. Mal 시험군과 Mal/F 시험군의 최대 혈당 농도는 각각 공복 혈당 대비 144.
0% 범위에서 측정되었다. 맥아당 용액을 체중 kg 당 2 g이되도록 투여한 시험군(Mal)의 투여 직후 혈당은 공복혈당 대비23.3% 증가하였으며 30, 60, 90, 120분 후 각각 129.2, 134.5, 144.4, 125.1%로 증가하여 60분부터는 대조군과 유의적인 차이를보였다. 맥아당 용액 투여 30분 전 유산균 발효 뽕잎 추출물을투여한 시험군(Mal/F)에서는 맥아당 용액 투여 후 120분 동안 혈당 농도에 큰 변화가 없었으며, 93.
반면에, 유산균 발효 뽕잎 추출물을 함께 투여한 시험군(Glc/F)의혈당은 30, 60분 후 각각 111.4, 111.1%로 최대 혈당 농도를 나타내었으나 Glc 시험군에 비하여 낮은 수치였고, 90, 120분 후102.8, 100.8%로 감소하여 Glc 시험군에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
1배 증가시켜 L6 근관세포에서와 유사한결과를 나타냈으며, in vivo 근육 조직에서도 인슐린 신호전달경로의 활성화에 영향을 준다는 것을 확인하였다. 본 연구 결과로 L. plantarum SG-053이 뽕잎을 효과적으로 발효하여 DNJ의 함량을 증진시킨다는 것을 확인하였으며, L. plantarum SG-053으로 발효한 뽕잎 추출물은 우수한 항당뇨 효능을 지니는 것을 세포 및 동물실험 수준에서 확인하였다.
본 연구결과로 유산균 발효 뽕잎 추출물은 인슐린 신호전달경로의 중요한 단백질인 IRS-1, PI3K p85α, GLUT-4의 발현을 증가시킴으로써 인슐린 저항성을 개선하고, 혈중 포도당을 세포 내로 흡수시켜 혈당을 저하시키는 것으로 판단되었다.
뽕잎 추출물 내에서 생육 활성이 높고, α-glucosidase 저해 활성이 높은 16개 균주 중에서 뽕잎 추출물 발효에 의해 DNJ 함량을 증가시키는 균주를 탐색한 결과, 경기도 성남시 소재 재래시장에서 구입한 갓김치에서 분리된 SG-053 균주로 발효한 뽕잎추출물의 DNJ 함량이 발효 전 18.72 mg/mL에서 발효 후 40.83 mg/mL로 발효에 의해 2.2배 증가하여 다른 균주에 비해 높은DNJ 생성량을 나타내었다(Table 2).
뽕잎 추출물에 함유된 6 mg/kg의 DNJ는 소장에서 맥아당을 포도당으로 분해하는 α-glucosidase의 활성을 대부분 저해하여 체내로 흡수되는 포도당을 감소시켰고, 유산균 발효 뽕잎 추출물은 이당류 섭취 후 혈당이 급격하게 상승하는 것을 막아 식후에도 낮은 혈당을 유지할 수있도록 조절할 수 있다는 것이 확인되었다.
세포의 포도당 흡수는 1µM의 인슐린을 처리하였을 때 33.1% 증가하였으며, 유산균 발효 뽕잎 추출액을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 각각 21.8, 40.7, 29.6, 28.0% 증가하였다(Fig. 4).
실험에 사용된 총 975개의 균주 중에서 909개의 유산균이 뽕잎 추출물에서 생육이 가능한 것으로 나타났으며, 발효 전과 비교하여 600 nm에서의 흡광도가 0.5 이상 증가한 27개 균주를 생육 활성이 우수한 균주로 1차 선별하였다. 1차 선별된 유산균주를 대상으로 α-glucosidase 저해 활성을 측정한 결과 27개 균주중에서 16개 균주가 90% 이상의 저해 활성을 나타내었다.
2 µm PVDF 여과지로 여과하였다. 여과한 시료는 HPLC로 분석하여 발효 전에 비해 DNJ 함량이100% 이상 증가한 유산균을 선별하였다. DNJ 분석에 이용된HPLC는 UltiMate^TM 3000 HPLC 시스템(Thermo Fisher Scien-tific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다.
유산균 발효 뽕잎 추출물은 SD rat의 허벅지 골격근 조직의 PI3K p85α와 GLUT-4 유전자 발현을 각각 6.4, 2.1배 증가시켜 L6 근관세포에서와 유사한결과를 나타냈으며, in vivo 근육 조직에서도 인슐린 신호전달경로의 활성화에 영향을 준다는 것을 확인하였다.
유산균 발효 뽕잎 추출액에 의한포도당 흡수 효과를 1µM의 인슐린을 처리한 군과 비교했을 때, 0.05 mg/mL의 유산균 발효 뽕잎 추출액 처리군이 인슐린 처리군보다 유의적으로 우수한 효과를 나타냈다.
5 mg/mL의 농도로 처리한 후 인슐린 신호전달경로에 관여하는IRS-1, PI3K p85α, GLUT-4의 발현량을 측정하였다. 유산균 발효뽕잎 추출물의 농도가 0.1 mg/mL 이하에서는 IRS-1 유전자 발현에 유의적인 변화가 나타나지 않았지만, 0.5 mg/mL 농도에서는 1.4배 증가하여 유의적인 차이가 나타났다(Fig. 3(A)).
상기 결과로부터 갓김치에서 분리된 SG-053 균주를 뽕잎 추출물의 발효를 위한 균주로 최종 선정하였다. 최종 선정된 유산균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 계통수 분석을 수행한 결과 SG-053 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색 결과 L. plantarum JCM1149, L. plantarum FFNL190, L. plantarum X7022, L. plantarum HBUAS56083, L. plantarum SRCM101511, L. plan-tarum FSWK112 등의 16S rRNA 유전자 염기서열과 100% 상동성을 나타내었고, 계통수를 작성하여 분석한 결과 L. plantarum SG-053으로 동정 명명하였다(Fig. 1).
특히SG-053 균주는 96.8%의 저해 활성을 나타내 1g/mL 농도의acarbose의 α-glucosidase 저해 활성인 96.5%보다 높은 α-glucosi-dase 저해 활성이 관찰되었다(Table 2).
5(A)). 포도당 용액을 투여하지 않은 대조군(Control)의 혈당 농도는 공복 혈당 농도 대비 97.1-102.0% 범위로 유지되었다. 포도당 용액을 투여한 시험군(Glc)의 혈당은 포도당 용액 투여직후, 30, 60분 후 각각 104.
0% 범위로 유지되었다. 포도당 용액을 투여한 시험군(Glc)의 혈당은 포도당 용액 투여직후, 30, 60분 후 각각 104.4, 125.2, 119.2%로 증가하다가, 90분후 129.5%로 크게 증가하여 최대 혈당 농도를 나타냈다. 포도당용액 투여 120분 후 122.
포도당용액 투여 120분 후 122.4%로 여전히 높은 혈당 농도가 유지되어 90, 120분에서 대조군과 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).

후속연구

PI3K의 하류에 있는 aPKC가 PI3K의 상류에 있는 IRS-1의 활성화를 저해하는 음의 되먹임기작에 의해 인슐린의 작용이 신호에 특이적으로 조절될 수 있다(Lee 등, 2008; Huang 등, 2018). 본 연구결과에서도 유산균 발효 뽕잎 추출물에 의해 이러한 음의 되먹임작용에 의해 IRS-1의 발현이 저해되는 것으로 판단되었으며, 이를 통해 인슐린에 의한포도당의 흡수가 적절히 조절되는 것으로 예측된다(Fig. 7), 따라서 유산균 발효 뽕잎 추출물을 당뇨 예방 및 치료를 위한 건강기능성식품으로 개발할 경우 많은 당뇨 치료제들의 문제점인 저혈당증 문제를 극복할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	뽕잎에는 어떤 생리활성물질이 함유되어 있는가?	)는 전통적으로 누에의 먹이로 사용되어왔으나 최근 당뇨, 고혈압 등의 성인병에 효능이 있다고 보고되어 기능성 식품 소재로 사용되고 있다(Lee 등, 2003). 뽕잎에는 다양한 식이섬유와 비타민, 미네랄이 풍부하고, chlorogenic acid,플라보노이드, γ-aminobutyric acid (GABA), 1-deoxynojirimycin (DNJ) 등의 생리활성물질이 함유되어 항암, 항고혈압, 항당뇨 효과를 갖는 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2015). 이중에서 DNJ는 α-glucosidase 저해제로 작용하여 항당뇨 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Asano 등, 1994; Lee와 Choi, 2012).
	뽕잎에 있는 DNJ의 항당뇨활성은 어떻게 작용하는가?	DNJ는 화학적으로 합성되거나, 뽕잎 등의 식물이나 누에로부터의 추출, Bacillus 속 또는 Streptomyces 속 미생물의 발효에 의해 생산된다(Gao 등, 2016). DNJ의 항당뇨활성은 α-glucosidase 저해 활성에 의한 것으로, 간에서 글리코겐 탈분지효소인 α-1,6-glucosidase와장내 α-1,4-glucosidase의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있으나, 장내 sodium-의존성 glucose cotransporter 2, glucose transporter 2의 발현도 억제한다(Gao 등, 2016; Li 등, 2013).
	DNJ는 어떻게 얻어지는가?	DNJ는 포도당의 2번 탄소에 산소원자 대신 아민기가 결합되어 있는 형태의 포도당 유도체로, 소장 α-glucosidase의 활성 부위에 결합해 효소 활성을 저해한다(Kojima 등, 2010). DNJ는 화학적으로 합성되거나, 뽕잎 등의 식물이나 누에로부터의 추출, Bacillus 속 또는 Streptomyces 속 미생물의 발효에 의해 생산된다(Gao 등, 2016). DNJ의 항당뇨활성은 α-glucosidase 저해 활성에 의한 것으로, 간에서 글리코겐 탈분지효소인 α-1,6-glucosidase와장내 α-1,4-glucosidase의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있으나, 장내 sodium-의존성 glucose cotransporter 2, glucose transporter 2의 발현도 억제한다(Gao 등, 2016; Li 등, 2013).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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