[논문]그렐린이 혈관성 치매 쥐의 기억 손상에 미치는 효과

박종민; 김연정

doi:10.4040/jkan.2019.49.3.317

문제 정의

이외에 외상성 뇌 손상에서 백색질의 별아교세포(astorcyte)를 감소시켜 염증반응을 경감시켰다[22]. 따라서 선행연구들을 바탕으로 VaD에서 그렐린의 투여가 백색질 및 해마의 손상을 감소시키고 혈관신생을 통한 학습과 기억을 증진시키는 중재로서의 가능성을 검토하고자 한다. 그렐린으로 인해 해마에서 혈관신생이 유도된다면 충분한 혈액 공급으로 인하여 시냅스 가소성과 신경재생이 더욱 활발하게 일어나 기억 증진 효과가 있을 것이며, 또한 그렐린이백색질의 말이집탈락(demyelination)을 감소시킨다면 기억을 포함한뇌의 통합기능 향상에 효과가 있을 것이다.
본 연구는 BCCAO로 유발된 VaD 쥐에게 그렐린을 투여한 후 기억손상에 미치는 효과를 규명하기 위한 무작위 대조군 사후설계이다.
본 연구는 그렐린이 선행 연구에서 밝혀진 시냅스 가소성 및 신경재생의 효과 외에 만성 대뇌 저관류로 인한 기억 손상에 혈관내피 성장인자 신호 전달체계의 활성화로 미세혈관의 회복을 유도하여 기억증진의 효과를 입증함으로써 이론적 기초를 제공할 수 있다. 그리고 간호교육 측면에서 치매노인을 돌보는 간호사를 위한 교육과정이나 보수교육 프로그램에 VaD의 병태생리 및 최신 연구내용을 보완을 위한 교육 자료로 활용될 수 있으며, 간호연구 측면에서 그렐린으로 유도된 혈관신생이 손상된 미세혈관의 회복에 미치는 효과는 VaD 이외의 다른 뇌혈관 질환에 그렐린을 적용하는 추후 연구의 가능성을 제시할 수 있다.
본 연구는 무작위 대조군 순수 실험연구로 그렐린의 투여가 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 영향을 확인하고자 시행되었으며, 행동 실험 및 뇌 조직을 통한 해마와 백색질의 변화를 분자생물학적 기법으로 측정하였다. 본연구의 결과 그렐린 투여 후 백색질 및 해마의 미세혈관 손상이 감소되었고 혈관신생이 증진되었는데, 이는 행동실험의 결과인 공간 학습과 기억의 증진으로 관찰되었다.
본 연구의 목적은 VaD 쥐에게 그렐린을 4주간 복강 내 투여한 후 기억 손상에 미치는 효과를 행동학적, 분자생물학적으로 파악하기 위함이다.
본 연구는 K대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: KHUASP(SE)-16-046)을 받은 후 규정에 따라 실행하였다. 본 연구자는 실험동물 복지 및 윤리 교육과정을 이수하였으며, 동물 다루기, 마취제 투여, 통증 감소를 위한 교육을 받았다. 또한 실험동물의 3R원칙인 실험동물의 대체(replacement), 실험동물 수의 감소(reduction), 동물실험의 세련화(refinement)에 따라 동물 실험 방법을 준수하였다.
이에 본 연구는 그렐린이 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 효과를 행동학적, 분자생물학적 방법을 통해 확인하여 중재 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.
VaD는 AD와 달리 혈관성 위험인자를 조기에 조절하면 치매를 예방할 수 있고, 또한 발병 후에도 원활한 혈액공급이 이루어진다면 시냅스 가소성을 증가시켜서 기억 손상을 늦출 수 있다[26]. 이에 본 연구자들은 VaD에 적합한 간호 중재를 개발하기 위한 초석을 다지고자 기초실험 연구를 시행하였다. 그렐린은 내인성 호르몬으로 정확한 효과를 예측하기 위하여 본 연구에서는 복강 내 투여 방법을 사용하였지만, 추후 간호 중재 개발을 위하여 식이 제한(dietaryrestriction) 또는 간헐적 단식(intermittent fasting)과 같은 식이요법으로 연구를 확대할 예정이다.

가설 설정

1) 가설 1. 그렐린 투여군은 비투여군보다 공간 학습과 기억 능력이 향상될 것이다.
2) 가설 2. 그렐린 투여군은 비투여군보다 백색질의 말이집 손상이 더 적을 것이다.
② 부가설 2. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 VEGFR2 발현량이 더 많을 것이다.
③ 부가설 3. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 phospho-Akt발현량이 더 많을 것이다.
③ 부가설 3. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 미세혈관의길이가 더 길 것이다.
② 부가설 2. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 미세혈관의수가 더 적을 것이다.
3) 가설 3. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 신경세포와 미세혈관의 손상 정도가 더 적을 것이다.
① 부가설 1. 그렐린 투여군은 비투여군보다 해마의 신경세포의수가 더 많을 것이다.

제안 방법

면역형광법은 항체의 표식에 형광 색소를 이용하여, 형광 표식을 검출하는 것으로 특정 단백질의 존재를 밝히는 방법이다. 1차 항체로는 RECA-1과 VEGFR2 (1:500; Bioworld, Louis Park, MN,USA)를 동시에 4℃에서 24시간 동안 반응시키고, 다음 날 5분씩 3회 세척하였다. 2차 항체에는 형광 색소(fluorochrome)가 결합되어있어 어두운 곳에서 2차 항체인 Alexa Fluor 488 (1:1000; Abcam,Cambridge, MA, USA)을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS를 사용하여 5분씩 5회 충분히 세척하고, 조직을 슬라이드 글라스에 붙여 건조시킨 후 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA)로 커버 글라스를 덮었다.
그리고 1%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin [BSA]) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)에 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 1차 항체로는anti-NeuN (Neuronal marker; 1:1000; Millipore, Bedford, MA,USA), anti-MBP (myelin basic protein; 1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein;1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RECA-1 (rat endothelial cell antibody; 1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 차례로 4℃에서 24시간 동안 반응시키고, 다음 날 5분씩 3회 세척하였다. 그리고 2차 항체인 anti-mouse immunoglobin (Ig) G (1:200;Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), anti-rat IgG (1:200;Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), anti-goat IgG(1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.
나무로 구성된 Y자형 미로는 각각의 팔이 길이 25 cm, 높이 14 cm, 너비 5 cm으로 동일한 각도(120o)로 이루어져 있다. 검사는 각각의 팔을 A, B,C 영역으로 지정하고 쥐를 C 영역에서 시작하여 5분간 1회 자유롭게 움직이게 하여 쥐의 움직임을 기록하였다. 본 실험에 참여하지 않은 연구자에게 각 군의 정보를 제공하지 않은 상태에서 실시간으로 기록하며, 각 팔의 출입 기록은 쥐의 뒷다리가 미로의 절반이상을 통과하였을 때만 인정하였다.
1차 항체로는anti-NeuN (Neuronal marker; 1:1000; Millipore, Bedford, MA,USA), anti-MBP (myelin basic protein; 1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein;1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RECA-1 (rat endothelial cell antibody; 1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 차례로 4℃에서 24시간 동안 반응시키고, 다음 날 5분씩 3회 세척하였다. 그리고 2차 항체인 anti-mouse immunoglobin (Ig) G (1:200;Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), anti-rat IgG (1:200;Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), anti-goat IgG(1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.
이 후 단백질이 전이된 막을 BSA에 반응시킨 후 1차 항체로는 anti-VEGF(1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-VEGFR2, anti-pAKT (1:500; Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, 이어서 Horseradish Peroxidase (HRP)와 결합된 2차 항체 anti-mouse IgG-HRP (1:5000; Santa Cruz, SanAntonio, Texas, USA), goat anti-rabbit IgG-HRP (1:5000; SantaCruz, San Antonio, Texas, USA)를 2시간에 걸쳐 적용하였다. 그후, 향상된 화학 발광 웨스턴블롯 검출 시스템(Bio-Rad laboratories, Richmond, CA, USA)을 사용하여 막 완충액에서 10 분 동안 3 회 세척한 후 막의 단백질 발현의 양을 암실에서 필름(Agfa,Mortsel, Belgium)으로 옮겼다. 단백질의 양을 표준화하기 위해, 모든 막에 1차 항체로 β-actin (1:5000, Sigma Aldrich, St Louis,MO, USA)을 사용하여 함께 검사를 진행하여 총 단백질 양에 대한대조군으로 사용하였다.
냉동 절편기를 사용하여 뇌 조직을 40 μm 두께로 연속 관상 절편하여 부위별로 4℃ 냉장 보관된 조직을 세척 후, 내인성 과산화효소를 제거하기 위하여 30.0% H2O2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 1/10으로 희석하여 30분간 반응시켰다.
해당 부위의 조직을 균질화시킨 후 단백질 정량화를 시행하였다. 단백질을 10.0% 나트륨 도데실 황산염 폴리아클리아미드겔 전기 이동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 통하여 80 V로 20분, 그리고 100 V로 1시간 20분간 크기별로 분해하여 폴리비닐리덴(Polyvinylidene difluoride; MerckMillipore, Darmstadt, Germany)막 위로 전기영동시켰다. 이 후 단백질이 전이된 막을 BSA에 반응시킨 후 1차 항체로는 anti-VEGF(1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-VEGFR2, anti-pAKT (1:500; Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, 이어서 Horseradish Peroxidase (HRP)와 결합된 2차 항체 anti-mouse IgG-HRP (1:5000; Santa Cruz, SanAntonio, Texas, USA), goat anti-rabbit IgG-HRP (1:5000; SantaCruz, San Antonio, Texas, USA)를 2시간에 걸쳐 적용하였다.
단백질의 양을 표준화하기 위해, 모든 막에 1차 항체로 β-actin (1:5000, Sigma Aldrich, St Louis,MO, USA)을 사용하여 함께 검사를 진행하여 총 단백질 양에 대한대조군으로 사용하였다.
본 연구자는 실험동물 복지 및 윤리 교육과정을 이수하였으며, 동물 다루기, 마취제 투여, 통증 감소를 위한 교육을 받았다. 또한 실험동물의 3R원칙인 실험동물의 대체(replacement), 실험동물 수의 감소(reduction), 동물실험의 세련화(refinement)에 따라 동물 실험 방법을 준수하였다. 약물 투여가 중재로 사용되는 실험이기 때문에 쥐를 대상으로한 실험 방법이 필요하였고, 동물 수를 감소시키기 위하여 자원 방정식 방법을 사용하여 실험에 참여하는 동물의 수를 최소화 하였다.
양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여 군에게 BCCAO 수술 10주 후부터 아실화 된 그렐린 80 μg/kg (Peptides International, Incorporation, Louisville, KY, USA)을 1 ml의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS; Gibco Laboratories, Grand Islands, NY, USA)에 녹여 4주 간 매일 같은 시간에 복강 내 투여(intraperitoneal injection)하였다. 모의 대조군 및 양측 온목동맥 폐색군은 복강 내 주사로 인한 통증 또는 스트레스 등이 미치는 영향을 고려하여 1 ml의 PBS를 동일한 방법으로 4주 간 주입하였다.
공간 기억 능력이 좋을수록 도피대를 제거한 위치로 방문한 횟수가 증가한다. 방문 횟수는 추적 장치의 쥐의 동선을 통하여 분석하였다.
3 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) 프로그램을 사용하였다.백색질 부위는 최소 5개 영역 이상을 선택하여 분석을 시행하였으나 해마(cornu ammonis [CA]) 1 부위는 얇은 층으로 구성되어 있기 때문에 전 영역 분석(total analysis)을 시행하였다.
주위의 벽에는 다양한 색과 모양의 시각적 단서가 표시되어 있어 쥐가 공간을 기억하는데 도움이 되도록 하였고, 비디오 레코더가 천정에 달려 있어서 추적 장치(SMART video trackingsystem, Pan-Lab, Barcelona, Spain) 프로그램을 이용하여 쥐의 움직임을 추적하여 저장하고 사후 분석에 이용하였다. 본 검사는 6일동안의 훈련기 후에 7일째에 1회의 프로브 검사(probe test)를 통하여 학습과 공간 기억능력을 평가하였다. 훈련기의 1회 시행 때 입수했던 지점과 다른 지점에서 출발시키고, 제거된 도피대의 위치로 쥐가 방문한 횟수를 60초 동안 측정하였다.
05M PBS에 5분씩 3회 세척 후 발색 전에 ABC (avidin-biotin complex, Vector Laboratories, Burlingame,CA, USA)용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 발색을 위하여diaminobenzidine (DAB)을 함유하고 있는 DAB kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 각 군 간에 동일한 시간을 반응시켰다. 슬라이드의 조직을 탈수(dehydration) 시킨 후 커버 슬라이드를 덮었다.
실험기간 동안 평균온도 23±2℃, 습도 50±2%로 유지하며, 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark, light turn on 6 am)가 조절되는 환경에 수용하면서 실험기간동안 물과 고형 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여 군에게 BCCAO 수술 10주 후부터 아실화 된 그렐린 80 μg/kg (Peptides International, Incorporation, Louisville, KY, USA)을 1 ml의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS; Gibco Laboratories, Grand Islands, NY, USA)에 녹여 4주 간 매일 같은 시간에 복강 내 투여(intraperitoneal injection)하였다.
0% 나트륨 도데실 황산염 폴리아클리아미드겔 전기 이동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 통하여 80 V로 20분, 그리고 100 V로 1시간 20분간 크기별로 분해하여 폴리비닐리덴(Polyvinylidene difluoride; MerckMillipore, Darmstadt, Germany)막 위로 전기영동시켰다. 이 후 단백질이 전이된 막을 BSA에 반응시킨 후 1차 항체로는 anti-VEGF(1:500; Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-VEGFR2, anti-pAKT (1:500; Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, 이어서 Horseradish Peroxidase (HRP)와 결합된 2차 항체 anti-mouse IgG-HRP (1:5000; Santa Cruz, SanAntonio, Texas, USA), goat anti-rabbit IgG-HRP (1:5000; SantaCruz, San Antonio, Texas, USA)를 2시간에 걸쳐 적용하였다. 그후, 향상된 화학 발광 웨스턴블롯 검출 시스템(Bio-Rad laboratories, Richmond, CA, USA)을 사용하여 막 완충액에서 10 분 동안 3 회 세척한 후 막의 단백질 발현의 양을 암실에서 필름(Agfa,Mortsel, Belgium)으로 옮겼다.
양측 온목동맥 폐색 수술은 VaD 대상자의 신경병리학적, 행동학적 주요 임상적 특성과 유사한 변화를 동물에게 유발시키는 방법이다. 정중선 절개를 통하여 피부 및 근육 안쪽의 온목동맥을 노출시키고, 목혈관 신경집과 미주 신경을 조심스럽게 분리한 뒤 양측의 온목동맥을 3-0 봉합사(Black Silk, Ailee Company Limited, Busan,Republic of Korea)를 이용하여 영구적으로 두 번 결찰하였다. 모의대조군은 수술로 인한 영향을 통제하기 위하여 같은 절차를 수행하였으나 온목동맥 결찰을 시행하지 않았다.
슬라이드의 조직을 탈수(dehydration) 시킨 후 커버 슬라이드를 덮었다. 조직 사진은 광학현미경(BX51, Olympus,Tokyo, Japan)으로 촬영하고 세포 수 측정, 뇌량의 두께 측정, 미세혈관의 길이 정량 분석을 위하여 Image-Pro Plus version 6.3 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) 프로그램을 사용하였다.백색질 부위는 최소 5개 영역 이상을 선택하여 분석을 시행하였으나 해마(cornu ammonis [CA]) 1 부위는 얇은 층으로 구성되어 있기 때문에 전 영역 분석(total analysis)을 시행하였다.
5 cm 깊이에 숨어있는 도피대를 만든다. 주위의 벽에는 다양한 색과 모양의 시각적 단서가 표시되어 있어 쥐가 공간을 기억하는데 도움이 되도록 하였고, 비디오 레코더가 천정에 달려 있어서 추적 장치(SMART video trackingsystem, Pan-Lab, Barcelona, Spain) 프로그램을 이용하여 쥐의 움직임을 추적하여 저장하고 사후 분석에 이용하였다. 본 검사는 6일동안의 훈련기 후에 7일째에 1회의 프로브 검사(probe test)를 통하여 학습과 공간 기억능력을 평가하였다.
모의대조군은 수술로 인한 영향을 통제하기 위하여 같은 절차를 수행하였으나 온목동맥 결찰을 시행하지 않았다. 피부 봉합 후 회복기간동안 쥐에게 따뜻하고 청결한 환경을 제공하여 통증 및 감염을 최소화하려고 노력하였다.
웨스턴블롯은 단백질을 젤에서 크기 별로 분리하여, 막으로 옮겨서 항원-항체 반응을 통하여 특정 단백질의 양을 측정할 수 있는방법이다. 해당 부위의 조직을 균질화시킨 후 단백질 정량화를 시행하였다. 단백질을 10.
해마 부위에서 그렐린 투여가 만성 대뇌 저관류로 인한 혈관신생을 증진시켰는지 분자수준에서 관찰하기 위하여 혈관신생을 유도하는 VEGF 신호 전달 체계와 PI3K/AKT 신호 전달 체계를 확인하였다. VEGF와 그의 수용체인 VEGFR2는 그렐린 투여군이 다른 군에비하여 증가하였으나 VEGF만이 유의한 차이가 있었다.
본 검사는 6일동안의 훈련기 후에 7일째에 1회의 프로브 검사(probe test)를 통하여 학습과 공간 기억능력을 평가하였다. 훈련기의 1회 시행 때 입수했던 지점과 다른 지점에서 출발시키고, 제거된 도피대의 위치로 쥐가 방문한 횟수를 60초 동안 측정하였다. 공간 기억 능력이 좋을수록 도피대를 제거한 위치로 방문한 횟수가 증가한다.

대상 데이터

오차 자유도 값이 18로 적정하게 측정되기 위하여 각 그룹 당 7마리씩의 쥐가 필요하다. 따라서 양측 온목동맥 폐색으로 인한 사망률이 20% 내외로 알려진 것을 고려하여 각 군 당 9마리씩 총 27마리를 연구에 사용하였으나, 수술후 모의 대조군에서 2마리, 양측 온목동맥 폐색군에서 3마리, 양측온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군에서 2마리가 사망하여 총 7마리를 제외한 20마리로 실험을 진행하였다(Figure 1). 실험기간 동안 평균온도 23±2℃, 습도 50±2%로 유지하며, 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark, light turn on 6 am)가 조절되는 환경에 수용하면서 실험기간동안 물과 고형 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
2차 항체에는 형광 색소(fluorochrome)가 결합되어있어 어두운 곳에서 2차 항체인 Alexa Fluor 488 (1:1000; Abcam,Cambridge, MA, USA)을 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS를 사용하여 5분씩 5회 충분히 세척하고, 조직을 슬라이드 글라스에 붙여 건조시킨 후 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA)로 커버 글라스를 덮었다. 사진은 형광 현미경(E400, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 조직을촬영하였다.
실험동물은 11주령의 수컷 Wistar 쥐를 공급받아 무작위화 프로그램(an online random number generator, www.randomizer.or)을 이용하여 모의 대조군(sham, n=7), 양측 온목동맥 폐색군(VaD,n=6), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(VaD+ghrelin, n=7)으로 무작위 배정하였다. 본 연구의 표본 수는 사전 연구 또는 선행 연구가 거의 없으므로 효과크기를 산정하기 어렵고, 검정력 분석 방법(power analysis)으로 산정하기 어려우므로 표준편차 및 효과 크기에 대한 정보가 없을 때 총 분산을 이용한 오차 추정 방법을 이용한 표본 수 산정 방법인 자원 방정식(resource equation) 방법을 이용하여 계산하였다[23].

데이터처리

모든 자료는 평균±표준오차로 나타내었으며,측정 변수의 정규성검정(Shapiro-Wilk) 결과, 모두 정규분포를 따르는 것으로 확인되어 일원 분산분석(one-way analysis of variance)방법을 사용하였다.
모든 자료는 평균±표준오차로 나타내었으며,측정 변수의 정규성검정(Shapiro-Wilk) 결과, 모두 정규분포를 따르는 것으로 확인되어 일원 분산분석(one-way analysis of variance)방법을 사용하였다. 유의수준은 .05로 분석하며, Levene 통계량을사용하여 분산의 동질성 검사를 시행하였으며, 등분산을 가정하는지 확인 후 사후 분석에서 Scheffe의 검정 방식을 채택하였다.

이론/모형

or)을 이용하여 모의 대조군(sham, n=7), 양측 온목동맥 폐색군(VaD,n=6), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(VaD+ghrelin, n=7)으로 무작위 배정하였다. 본 연구의 표본 수는 사전 연구 또는 선행 연구가 거의 없으므로 효과크기를 산정하기 어렵고, 검정력 분석 방법(power analysis)으로 산정하기 어려우므로 표준편차 및 효과 크기에 대한 정보가 없을 때 총 분산을 이용한 오차 추정 방법을 이용한 표본 수 산정 방법인 자원 방정식(resource equation) 방법을 이용하여 계산하였다[23]. 오차 자유도(error degrees of freedom)가 10이하일 경우에는 결과 값에 영향을 줄 수 있고, 20 이상일 경우 쥐의 숫자가 증가해도 결과 값에 크게 영향을 미치지 않으므로 동물보호를 위하여 오차 자유도 10~20사이로 유지하는 것이 적절하다.

성능/효과

Phospho-Akt의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(0.72), 양측 온목동맥 폐색군(1.49), 양측 온목동맥폐색 및 그렐린 투여군(2.78)간에 유의한 차이가 있었는데(p<.001), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.012) 가설 4의 부가설 3은 지지되었다(Figure 3A, D).
VEGFR2의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(1.01), 양측 온목동맥 폐색군(1.74), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(2.40)간에 유의한 차이가 있었으나(p=.006), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높지 않아(p=.122) 가설 4의 부가설 2는 기각되었다(Figure 3A, C).
해마 부위에서 그렐린 투여가 만성 대뇌 저관류로 인한 혈관신생을 증진시켰는지 분자수준에서 관찰하기 위하여 혈관신생을 유도하는 VEGF 신호 전달 체계와 PI3K/AKT 신호 전달 체계를 확인하였다. VEGF와 그의 수용체인 VEGFR2는 그렐린 투여군이 다른 군에비하여 증가하였으나 VEGF만이 유의한 차이가 있었다. VEGFR2의결과가 유의하지 않았던 것은 웨스턴블롯을 해마의 혈관만을 추출한 후 분석하지 않고 해마의 전체 조직으로 시행하였기 때문이라고 생각되어 선행연구와 같이 미세혈관과 VEGFR2의 공존을 면역형광법을 통해 확인함으로써 이 문제를 해결하였다[41].
뇌량에서 신경의 수초화에 중요한 역할을 하는 단백질인 MBP를이용하여 염색된 말이집의 상대적인 광학밀도 비율(relative opticaldensity ratio)은 모의 대조군(0.18), 양측 온목동맥 폐색군(0.12), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(0.17)간에 차이가 있었는데(p=.016), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.034) 가설 2의 부가설 2는 지지되었다(Figure 2D).
그러나 뇌의 혈관신생은 뇌혈관 질환의 치료 및 회복에긍정적인 효과를 나타내고 있다[39]. 뇌혈관 질환 모델에서 VEGF의증가로 유도된 혈관신생은 신경재생 및 신경보호효과를 나타내었고,AD 모델 쥐에 VEGF를 복강 내 투여한 결과 혈관 신생의 증가, 베타아밀로이드(amyloid beta)의 감소 및 기억 증진이 확인되었다[21,40]. 따라서 본 연구에서 그렐린 투여로 인한 해마에서 미세혈관 수의 감소와 길이의 증가는 만성 대뇌 저관류로 인한 보상작용으로 나타나는 혈관신생을 더욱 증가시킨 것으로 생각된다.
뇌혈관 질환 모델에서 VEGF의증가로 유도된 혈관신생은 신경재생 및 신경보호효과를 나타내었고,AD 모델 쥐에 VEGF를 복강 내 투여한 결과 혈관 신생의 증가, 베타아밀로이드(amyloid beta)의 감소 및 기억 증진이 확인되었다[21,40]. 따라서 본 연구에서 그렐린 투여로 인한 해마에서 미세혈관 수의 감소와 길이의 증가는 만성 대뇌 저관류로 인한 보상작용으로 나타나는 혈관신생을 더욱 증가시킨 것으로 생각된다. 미세혈관수의 증가는 작은 조각이 더 많아져 미세혈관의 통합성이 감소되었던 결과로 해석할 수 있다[37].
신경세포는 차이가없었으나 산소와 영양분을 공급하고, 항상성 유지를 도우며, 대사산물을 제거하는 등의 신경세포의 성장 및 기능 유지에 중요한 역할을 하는 해마의 미세혈관 손상을 관찰할 수 있었다. 미세혈관의 손상을확인한 결과, 해마에 작은 조각, 고리모양 또는 울퉁불퉁한 모양 등의 병리적 형태의 미세혈관이 많이 관찰되었다. 이는 amyloid-βpeptide (Aβ)를 주입하여 만든 알츠하이머 동물 모델과 알츠하이머환자의 사후 조직에서 관찰된 혈관의 변화와 일치하는 것으로[37],이러한 병리적 형태의 혈관이 기억에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.
백색질의 대표적인 부위인 뇌량(corpus callosum) A, B, C 영역을측정한 두께의 평균은 모의 대조군(94.60 μm), 양측 온목동맥 폐색군(86.80 μm), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(94.45 μm)간에 차이가 있었는데(p=.009), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.017) 가설 2의 부가설 1은 지지되었다(Figure 2C).
본 연구에서 Y-미로 검사와 수중 미로 검사를 시행한 결과 그렐린이 공간 학습과 기억 능력을 증진시키는 것을 확인하였다. 선행연구에서 그렐린 유전자를 knockout한 쥐에 식염수를 투여한 군보다 그렐린을 투여한 군에서 Y-미로 검사의 교대율이 유의하게 증가하여 본 연구의 결과와 일치하였다[21].
본 연구는 무작위 대조군 순수 실험연구로 그렐린의 투여가 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 영향을 확인하고자 시행되었으며, 행동 실험 및 뇌 조직을 통한 해마와 백색질의 변화를 분자생물학적 기법으로 측정하였다. 본연구의 결과 그렐린 투여 후 백색질 및 해마의 미세혈관 손상이 감소되었고 혈관신생이 증진되었는데, 이는 행동실험의 결과인 공간 학습과 기억의 증진으로 관찰되었다.
이는 양측 온목동맥 결찰로 인한 뇌 혈류량의 감소가 일주일 후 대뇌겉질은 35%, 해마는 26%가 회복되기 때문에 신경세포의 소실이 드물게 일어난다는 선행연구[36]와 일치하였다. 신경세포는 차이가없었으나 산소와 영양분을 공급하고, 항상성 유지를 도우며, 대사산물을 제거하는 등의 신경세포의 성장 및 기능 유지에 중요한 역할을 하는 해마의 미세혈관 손상을 관찰할 수 있었다. 미세혈관의 손상을확인한 결과, 해마에 작은 조각, 고리모양 또는 울퉁불퉁한 모양 등의 병리적 형태의 미세혈관이 많이 관찰되었다.
또한 실험동물의 3R원칙인 실험동물의 대체(replacement), 실험동물 수의 감소(reduction), 동물실험의 세련화(refinement)에 따라 동물 실험 방법을 준수하였다. 약물 투여가 중재로 사용되는 실험이기 때문에 쥐를 대상으로한 실험 방법이 필요하였고, 동물 수를 감소시키기 위하여 자원 방정식 방법을 사용하여 실험에 참여하는 동물의 수를 최소화 하였다. 또한 수술 후 회복 기간을 포함한 실험 기간 동안 동물을 청결하고 따뜻한 환경에서 사육할 수 있도록 노력하였다.
해마에서 미세혈관의 표지가 되는 RECA-1에 의해 염색된 미세혈관 수는 모의 대조군(12.00개), 양측 온목동맥 폐색군(20.00개), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(13.25개)간에 유의한 차이가 있었는데(p=.007), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색군 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 적어(p=.022) 가설 3의 부가설 2는 지지되었다(Figure 2B).
해마에서의 RECA-1에 의해 염색된 미세혈관 길이는 모의 대조군(2632.02 μm), 양측 온목동맥 폐색군(1979.75 μm), 양측 온목동맥폐색 및 그렐린 투여군(2438.07 μm)간에 유의한 차이가 있었는데(p=.001), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색군 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 미세혈관이 길어서(p=.012) 가설 3의 부가설 3은 지지되었다(Figure 2B).
해마의 혈관 신생에 중요한 역할을 하는 VEGF 단백질 발현의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(0.39), 양측 온목동맥 폐색군(0.52), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린투여군(1.44)간에 유의한 차이가 있었는데(p=.008), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 광학 밀도가 유의하게 높아(p=.022) 가설 4의 부가설 1은 지지되었다(Figure 3A, B).

후속연구

따라서 선행연구들을 바탕으로 VaD에서 그렐린의 투여가 백색질 및 해마의 손상을 감소시키고 혈관신생을 통한 학습과 기억을 증진시키는 중재로서의 가능성을 검토하고자 한다. 그렐린으로 인해 해마에서 혈관신생이 유도된다면 충분한 혈액 공급으로 인하여 시냅스 가소성과 신경재생이 더욱 활발하게 일어나 기억 증진 효과가 있을 것이며, 또한 그렐린이백색질의 말이집탈락(demyelination)을 감소시킨다면 기억을 포함한뇌의 통합기능 향상에 효과가 있을 것이다.
이에 본 연구자들은 VaD에 적합한 간호 중재를 개발하기 위한 초석을 다지고자 기초실험 연구를 시행하였다. 그렐린은 내인성 호르몬으로 정확한 효과를 예측하기 위하여 본 연구에서는 복강 내 투여 방법을 사용하였지만, 추후 간호 중재 개발을 위하여 식이 제한(dietaryrestriction) 또는 간헐적 단식(intermittent fasting)과 같은 식이요법으로 연구를 확대할 예정이다. 쥐에게 3개월간 격일로 사료를 제공하는 식이 제한요법을 시행한 선행연구에서 대조군보다 위와 해마의 그렐린 발현이 증가하고, 신경재생 또한 증진되었다고 보고되었다[27].
본 연구는 그렐린이 선행 연구에서 밝혀진 시냅스 가소성 및 신경재생의 효과 외에 만성 대뇌 저관류로 인한 기억 손상에 혈관내피 성장인자 신호 전달체계의 활성화로 미세혈관의 회복을 유도하여 기억증진의 효과를 입증함으로써 이론적 기초를 제공할 수 있다. 그리고 간호교육 측면에서 치매노인을 돌보는 간호사를 위한 교육과정이나 보수교육 프로그램에 VaD의 병태생리 및 최신 연구내용을 보완을 위한 교육 자료로 활용될 수 있으며, 간호연구 측면에서 그렐린으로 유도된 혈관신생이 손상된 미세혈관의 회복에 미치는 효과는 VaD 이외의 다른 뇌혈관 질환에 그렐린을 적용하는 추후 연구의 가능성을 제시할 수 있다. 또한 간호실무 측면에서 혈관성치매 환자의 손상된 인지기능을 증진시키기 위하여 그렐린을 이용한 간호 중재의 개발을 촉진할 수 있는 과학적 토대를 제공할 수 있다.
렙틴은 지방조직에서 분비되는 호르몬으로 해마 시냅스에서 글루타메이트 수용체 트래피킹(glutamate receptor trafficking) 및 흥분성 시냅스 강도의 급격한 변화를 촉진시켜서 시냅스 가소성을 나타낸다[29,30]. 따라서 본 연구를 통하여확인된 그렐린의 효과와 후속연구를 통해 렙틴과의 상호작용에 대한 결과들이 진행된다면 VaD 대상자들에게 약물 치료뿐 아니라 간호 중재의 개발에 대한 근거를 제시할 수 있을 것으로 생각한다.
그리고 간호교육 측면에서 치매노인을 돌보는 간호사를 위한 교육과정이나 보수교육 프로그램에 VaD의 병태생리 및 최신 연구내용을 보완을 위한 교육 자료로 활용될 수 있으며, 간호연구 측면에서 그렐린으로 유도된 혈관신생이 손상된 미세혈관의 회복에 미치는 효과는 VaD 이외의 다른 뇌혈관 질환에 그렐린을 적용하는 추후 연구의 가능성을 제시할 수 있다. 또한 간호실무 측면에서 혈관성치매 환자의 손상된 인지기능을 증진시키기 위하여 그렐린을 이용한 간호 중재의 개발을 촉진할 수 있는 과학적 토대를 제공할 수 있다.
추후 타액 또는 혈중 그렐린의 농도를 측정하여 임상의 적용 가능성을 높이는 임상단계의 연구가 필요하다고 생각한다. 또한 혈관성 치매의 분류는 다양하지만 본 연구에서는 만성 대뇌 저관류로 인한 기억 손상을 확인하기 위하여 BCCAO 모델만을 사용하여 결과를 도출하였다는 것과 본 연구의 결과만으로 그렐린이 만성 대뇌 저관류로 인한 뇌혈관 손상의 복구에 직접 작용하였는지 또는 중간매개요인이 작용하였는지에 대한 결론을 내리기 어렵다는 제한점이 있다. 따라서 세부 기전에 대한 추가적인 연구를 통한 확인이 필요하다.
따라서 세부 기전에 대한 추가적인 연구를 통한 확인이 필요하다. 이상과 같이 몇 가지 제한점을 가지고 있으나 후속 연구들이 진행된다면 연구 결과가 축적되어 임상적으로 적용가능한 결론을 내릴 수 있을 것이라 기대한다.
또한 행동학적 실험뿐 아니라 조직을 이용하여특정 현상의 기전을 분자생물학적 기법을 사용하여 알아볼 수 있다는 장점도 가지고 있다. 추후 타액 또는 혈중 그렐린의 농도를 측정하여 임상의 적용 가능성을 높이는 임상단계의 연구가 필요하다고 생각한다. 또한 혈관성 치매의 분류는 다양하지만 본 연구에서는 만성 대뇌 저관류로 인한 기억 손상을 확인하기 위하여 BCCAO 모델만을 사용하여 결과를 도출하였다는 것과 본 연구의 결과만으로 그렐린이 만성 대뇌 저관류로 인한 뇌혈관 손상의 복구에 직접 작용하였는지 또는 중간매개요인이 작용하였는지에 대한 결론을 내리기 어렵다는 제한점이 있다.

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	저산소증으로 유발된 산화 스트레스는 어떤 현상을 유발하는 가?	VaD를 일으키는 병리적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, AD와는 달리 만성 대뇌 저관류로 유도된 저산소증으로 인하여 산화 스트레스, 염증, 혈관 및 혈액-뇌 장벽의 손상이 동반된다고 알려져 있다[2]. 현재까지의 연구 결과를 살펴보면 저산소증으로 유발된 산화 스트레스는 미토콘드리아의 기능 이상을 유발하며, 체내의 활성산소를 증가시켜서 혈관과 신경세포에 손상을 일으킨다[3]. 혈류 감소로 인한 저산소증은 또한 미세혈관의 형태 및 기능 이상을 일으켜 내피세포의 기능 장애, 혈액-뇌 장벽의 붕괴 및 염증을 유발한다[4].
	그렐린의 투여가 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 영향은?	본 연구는 무작위 대조군 순수 실험연구로 그렐린의 투여가 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 영향을 확인하고자 시행되었으며, 행동 실험 및 뇌 조직을 통한 해마와 백색질의 변화를 분자생물학적 기법으로 측정하였다. 본연구의 결과 그렐린 투여 후 백색질 및 해마의 미세혈관 손상이 감소되었고 혈관신생이 증진되었는데, 이는 행동실험의 결과인 공간 학습과 기억의 증진으로 관찰되었다.
	혈관성 치매(vascular dementia [VaD])는 어떤 질환인가?	혈관성 치매(vascular dementia [VaD])는 혈관의 폐색이나 혈관질환으로 발생한 만성 대뇌 저관류(chronic cerebral hypoperfusion)로 인하여 뇌의 혈류량이 감소하면서 점진적으로 기억력의 저하, 문제해결능력의 감퇴 및 사고 장애 등의 증상이 나타나는 질환으로 전체 치매 중 알츠하이머성 치매(Alzheimer’s disease [AD]) 다음으로 가장 큰 비율을 차지하고 있다[1]. VaD를 일으키는 병리적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, AD와는 달리 만성 대뇌 저관류로 유도된 저산소증으로 인하여 산화 스트레스, 염증, 혈관 및 혈액-뇌 장벽의 손상이 동반된다고 알려져 있다[2].

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