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문제 정의
- 골다공증은 파골세포의 활성도와 매우 밀접한 관련성을 갖고 있는데, 파골세포는 다핵 세포로 TRAP이라는 효소를 생산한다29). 본 실험에서는 wFF군의 파골세포 억제효능을 TRAP 염색과 활성도 측정을 통하여 확인하였다. 실험 결과, wFF는 파골세포 내 TRAP의 발현과 활성을 억제했다.
- 난소적출을 통해 유사폐경기 모델이 완성되면, 자궁은 수축하여 무게가 감소하고, 몸무게가 증가하게 된다. 본 실험에서는 몸무게 및 자궁의 무게 측정을 통한 폐경기 유사 모델의 유발 여부를 판단하였다28). 난소적출 후 매주 같은 시각 몸무게를 측정한 결과, OVX이후 2주부터 OVX군은 sham군보다 몸무게가 유의하게(p＜0.
- 본 연구는 항염의 효능을 갖는 連翹가 골다공증 관련 기전에 미치는 영향을 알아보기 위해서 RAW 264.7 cell을 이용하여 파골세포 형성 및 활성 억제를 관찰하고, pit 형성억제를 실험하였다. 파골세포 관련 유전자인 NFATc1, c-Fos의 발현을 살펴보았다.
- 본 연구는 連翹 물 추출물(wFF)의 파골세포 분화 및 골다공증 동물모델에 미치는 영향을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포와 난소적출 흰쥐 모델을 사용한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 골다공증의 원인에 대해서는 명확히 알려진 것은 없으나 최근에는 만성면역성 질환이나 염증성 질환에서 그 원인을 찾고 있다. 본 연구는 連翹물 추출물(wFF)이 파골세포 분화와 골다공증 동물모델에서의 실험과 연구를 한 것이다. 세포실험 방법으로는 먼저 RAW 264.
- 조직학적 염색(H&E)를 통하여 wFF가 폐경기를 통한 rat의 대퇴골 골 소주 면적 감소에 미치는 영향에 관하여 연구하였다.
- 또한,連翹의 골다공증 유발 동물모델에서의 영향을 탐색하기 위하여 흰쥐의 난소를 적출하여, 에스트로겐 결핍으로 인한 골다공증을 유발했다. 連翹를 투여한 후 체중의 변화 및 장기 무게의 변화를 관찰하고, 조직학적 검사를 통하여 흰쥐의 대퇴골 골 소주 면적의 변화를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Nanodrop (Thermo scientific,Pittsburgh, USA)을 사용하여 RNA의 농도를 2 μg으로 정량한 뒤, reverse transcription kit를 사용하여 cDNA로 합성하였다.
- RAW 264.7 세포를 파골세포로 유도하기 위하여, 10% FBS와 1% P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 사용하여, 5×103 cells/well의 밀도로 96-well plate에 분주하고, 24시간 안정화하였다.
- RAW 264.7 세포를 파골세포로 유도하기 위하여, 10% FBS와 1% P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 사용하여, 5×103 cells/well의 밀도로 osteo assay surface multiple well plate (Corning incorporated, New York, USA)에 분주하고, 24시간 안정화하였다.
- 약물 및 양성대조군은 전부 증류수에 용해하였으며 매일 같은 시간에 1 ml씩 경구 투여하였다. Sham군과 OVX군은 증류수를 경구 투여하였다. 실험 동안 매주 2번 일정한 시간에 몸무게를 측정하였다.
- . wFF 내 acteoside의 동정은 표준품과 비교하여 18분대 peak로 확인하였으며, 각 peak의 PDA 스캔을 통해 표준품의 스펙트럼과 비교하여 최종적으로 acteoside 임을 확인하였다(Fig. 1A, 2B).
- wFF가 RAW 264.7 세포에 RANKL로 유도한 파골세포의 분화 및 기능에 필요한 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 파골세포 분화에 필요한 RANK의 발현은 대조군이 정상군보다 증가하였지만 유의하지는 않았으며, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.
- wFF가 RAW 264.7 세포에 RANKL로 유도한 파골세포의 필수지표인 NFATc1 그리고 c-Fos의 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 파골세포 분화에 있어 핵심전사인자인 NFATc1의 유전자 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.
- wFF의 파골세포 관련 유전자 발현을 측정하기 위해, 10% FBS와 1% P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 사용하여, 2×105 cells/well의 밀도로 6-well plate에 분주하고, 24시간 안정화하였다.
- wFF의 파골세포 분화 필수 단백질 발현을 측정하기 위해, 10% FBS와 1% P/S가 포함된 alpha-MEM 배지를 사용하여, 5×105 cells/well의 밀도로 60 π dish에 분주하고, 24시간 안정화하였다.
- wFF의 파골세포 억제효능을 TRAP 염색과 활성도 측정을 통하여 확인하였다. RANKL을 통하여 파골세포를 유도하면서 wFF를 처리한 결과, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 TRAP-양성 다핵 세포 수가(44.
- 모든 조직은 광학현미경(Olympus BX51, Japan)을 이용하여 100배의 비율에서 촬영하였다. 골 소주의 면적은 대퇴골의 몸 쪽에서 성장판 아래 가로면의 길이가 성장판 길이의 2/3가 되는 부위를 capture 하여 이미지 분석 프로그램(Image J, Ver. 1.46, National Institutes of Health)을 사용하여 측정하였다.
- 그 후 RANKL (100 ng/ml) 및 wFF (50, 100, 200 μg/ml)이 포함된 배지로 교환하여 24시간 배양하였다.
- 그 후 RANKL (100 ng/ml) 및 wFF (50, 100, 200 μg/ml)이 포함된 배지로 교환하여 4일간 배양하였다.
- 그 후 RANKL (100 ng/ml) 및 wFF (50, 100, 200 μg/ml)이 포함된 배지로 교환하여 5일간 배양하였다.
- 이후 blocking buffer에 1:10000로 희석한 peroxidaseconjugatedanti-IgG 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, Tris-buffered saline with Tween 20 (TBST)로 10분씩 6번 세척했다. 그 후 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액(Santa Cruz, USA)을 사용하여, 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
- 그 후, RANKL (100 ng/ml) 및 wFF (50, 100, 200 μg/ml)이 포함된 배지로 교환하여 5일간 배양하였다.
- 90분 동안 감압을 진행하여 대퇴골 내부의 공기를 제거했다. 내부 공기가 완벽하게 제거된 대퇴골을 꺼내서 거즈를 사용하여 닦아내고, 무게를 측정한 뒤 새로운 증류수가 담겨있는 병에 넣은 뒤 물속에서의 무게를 측정했다. 이후 측정된 두 개의 무게를 아르키메데스 원리26) (g/cm3 bonevolume)를 통해 계산하였다.
- 동물실에서 1주일 적응 기간을 가진 SD-rat을, 아이소포란(2∼2.5%)과 7:3비율의 NO2/O2의 흡입 마취 아래 난소 절제 수술을 진행하였고, 대조군에는 난소 절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 sham-operation을 진행하였다.
- . 따라서 wFF의 골다공증에 대한 억제 효과를 관찰하기 위해, 난소를 적출한 흰쥐를 골다공증 유발 동물모델로 선정하고, wFF를 투여한 후 그 효과를 관찰하였다. BMD는 뼈의 단단함과 질을 나타내는 지표로써, 골다공증이 유발되면 감소하게 된다.
- 실험 개시일로부터 8주가 지나 투여가 끝나고, 높은 농도의 pentobarbital sodium (80 mg/kg, 복강 투여)을 통해 희생시킨 뒤, 자궁을 적출하여 무게를 측정하였다. 또한, 양측 대퇴골을 채취하여 골밀도와 무게도 측정하였고, 경골은 채취하여, 주위 근육을 제거한 후 완전히 건조했다. 이후 800℃의 화로에서 가열하여 완전히 연소시킨 뒤, 경골의 회분 함량을 측정하였다.
- 이후 조직학적 검사를 위해, 탈파라핀, 탈수를 진행한 뒤 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 진행하여 투여 후의 조직학적인 차이를 확인하였다. 모든 조직은 광학현미경(Olympus BX51, Japan)을 이용하여 100배의 비율에서 촬영하였다. 골 소주의 면적은 대퇴골의 몸 쪽에서 성장판 아래 가로면의 길이가 성장판 길이의 2/3가 되는 부위를 capture 하여 이미지 분석 프로그램(Image J, Ver.
- 본 연구에 사용된 primer는 Table 1에 기재하였다. 반응을 끝마친 결과물은 SYBR green (Invitrogen, Carlsbad, USA)으로 염색한 1.2% agarose gel에서 전기영동 후 발현 정도를 확인하였다.
- 그 후 RANKL (100 ng/ml) 및 wFF (50, 100, 200 μg/ml)이 포함된 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 반응이 종료된 세포에, RIPA buffer (50 mM Tris․Cl, 150 mM NaCl, 1% NP-40,0.5% Na․deoxycholate, 0.1% SDS, protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail)를 사용하여 단백질을 추출하였다. 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo scientific, Pittsburgh, USA)를 통해 정량하였다.
- 배지는 2일마다 같은 배지로 교환해 주었다. 분화 종료 후, 4% NaClO로 세포를 분해한 뒤 파골세포가 생성한 pit을 도립현미경을 촬영하고, 그 면적을 정량 분석하였다.
- 본 연구는 連翹물 추출물(wFF)이 파골세포 분화와 골다공증 동물모델에서의 실험과 연구를 한 것이다. 세포실험 방법으로는 먼저 RAW 264.7 cell을 이용하여 세포 생존율을 측정하였는데 모든 농도에서 세포 생존율에 영향이 없었다. 골다공증은 파골세포의 활성도와 매우 밀접한 관련성을 갖고 있는데, 파골세포는 다핵 세포로 TRAP이라는 효소를 생산한다29).
- 5%)과 7:3비율의 NO2/O2의 흡입 마취 아래 난소 절제 수술을 진행하였고, 대조군에는 난소 절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 sham-operation을 진행하였다. 수술 후 감염 방지를 위해 3일 동안 gentamicine을 10 mg/kg 농도로 복강 주사하였으며, 수술 후 바로 다음 날부터 약물투여를 진행하였다. 투여군은 총 5가지로 모의 수술 군(Sham군, sham-operation), OVX군(OVX군, Ovariectomy), 양성대조군(E2군, 17β-estradiol 100 μg/kg), wFF 저농도 투여군(wFF-L, 31 mg/kg), wFF 고농도 투여군(wFF-H, 310 mg/kg)이며, 군당 실험동물은 8마리로 하였다.
- 실험 동안 매주 2번 일정한 시간에 몸무게를 측정하였다. 실험 개시일로부터 8주가 지나 투여가 끝나고, 높은 농도의 pentobarbital sodium (80 mg/kg, 복강 투여)을 통해 희생시킨 뒤, 자궁을 적출하여 무게를 측정하였다. 또한, 양측 대퇴골을 채취하여 골밀도와 무게도 측정하였고, 경골은 채취하여, 주위 근육을 제거한 후 완전히 건조했다.
- Sham군과 OVX군은 증류수를 경구 투여하였다. 실험 동안 매주 2번 일정한 시간에 몸무게를 측정하였다. 실험 개시일로부터 8주가 지나 투여가 끝나고, 높은 농도의 pentobarbital sodium (80 mg/kg, 복강 투여)을 통해 희생시킨 뒤, 자궁을 적출하여 무게를 측정하였다.
- 투여군은 총 5가지로 모의 수술 군(Sham군, sham-operation), OVX군(OVX군, Ovariectomy), 양성대조군(E2군, 17β-estradiol 100 μg/kg), wFF 저농도 투여군(wFF-L, 31 mg/kg), wFF 고농도 투여군(wFF-H, 310 mg/kg)이며, 군당 실험동물은 8마리로 하였다. 약물 및 양성대조군은 전부 증류수에 용해하였으며 매일 같은 시간에 1 ml씩 경구 투여하였다. Sham군과 OVX군은 증류수를 경구 투여하였다.
- 이후,TRAP staining kit (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA)를 이용하여 TRAP 염색을 시행하였다. 염색 후 도립현미경(Olmpus, CLX41SF,Japan)을 통하여 붉은색의 TRAP 양성 반응을 보이는 세포와 핵이 3개 이상인 세포를 파골세포로 인정하여, 그 수를 세어 정량 분석하였다. 세포를 배양한 배지를 원심분리(2,000 rpm, 5 min)하여 상층 액을 취했다.
- 이후 조직학적 검사를 위해, 탈파라핀, 탈수를 진행한 뒤 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 진행하여 투여 후의 조직학적인 차이를 확인하였다.
- 이후 측정된 두 개의 무게를 아르키메데스 원리26) (g/cm3 bonevolume)를 통해 계산하였다.
- 5 L를 첨가하여 끓여 2시간 동안 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman no.3, Maidstone, UK)로 여과한 다음 동결건조(81.7 g)하여 連翹 물 추출물(water extract of Forsythiae Fructus, 이하 wFF)을 얻었다. 추출률은 23.
- 탈회가 끝난 후에는 파라핀 포매를 진행하였고, 포매된 조직은 microtome을 이용하여 5 μm의 두께로 절편 했다.
- 투여 종료 후, 좌측 대퇴골을 아르키메데스 원리를 이용해 BMD(Bone Mineral Density)를 측정하였다. OVX군은 sham군보다 BMD가 유의하게 감소하였다(p＜0.
- 투여가 끝난 후 왼쪽 대퇴골을 10% neutral buffered formalin(NBF)에 2일 동안 고정하였고, 10% ethylene diamine tetraacetate (EDTA)를 사용하여 3주 동안 탈회를 진행하였다. 탈회가 끝난 후에는 파라핀 포매를 진행하였고, 포매된 조직은 microtome을 이용하여 5 μm의 두께로 절편 했다.
- 투여군은 총 5가지로 모의 수술 군(Sham군, sham-operation), OVX군(OVX군, Ovariectomy), 양성대조군(E2군, 17β-estradiol 100 μg/kg), wFF 저농도 투여군(wFF-L, 31 mg/kg), wFF 고농도 투여군(wFF-H, 310 mg/kg)이며, 군당 실험동물은 8마리로 하였다.
- 7 cell을 이용하여 파골세포 형성 및 활성 억제를 관찰하고, pit 형성억제를 실험하였다. 파골세포 관련 유전자인 NFATc1, c-Fos의 발현을 살펴보았다. 또한,連翹의 골다공증 유발 동물모델에서의 영향을 탐색하기 위하여 흰쥐의 난소를 적출하여, 에스트로겐 결핍으로 인한 골다공증을 유발했다.
- 2D). 파골세포의 주요 능력인 뼈흡수능 억제를 측정하기 위하여 pit formation assay를 진행하였다. wFF를 처리한 결과, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 pit 형성이(14.
대상 데이터
- Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)는 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다. Aqueous nonradioactive cell proliferation assay (MTS)은 Promega (Madison,USA)에서 구매하였다. Reverse transcription kit는 Invitrogen(Carlsbad, USA)에서 구매하였다.
- Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)는 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다.
- Taq polymerase는 Kapa Biosystems (Woburn, USA)에서 구매하였다. PCR primers는 Genotech (Daejeon, Korea)에서 구매하였다. c-Fos, β-Actin은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA)에서 구매하였다.
- 또 다른 세포 배지인 Minimum Essential Medium alpha (alpha-MEM) 그리고 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다. Penicillin/Streptomycin은 Invitrogen (Carlsbad,USA)에서 구매하였다. Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS)는 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다.
- 또한, NFATc1는BD Pharmingen (San Diego, USA)에서 구매하였다. Peroxidase IgG는 Jackson ImmunoResearch (West Grove, USA)에서 구매하였다. Protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail, 그리고 17β-Estradiol은 Sigma Aldrich (Saint Louis, USA)에서 구매하였다.
- Protease inhibitor cocktail, phosphatase inhibitor cocktail, 그리고 17β-Estradiol은 Sigma Aldrich (Saint Louis, USA)에서 구매하였다.
- RANKL은 Peprotech (London, UK)에서 구매하였다. 세포 배지인 DMEM은 Welgene (Daejeon, Korea)에서 구매하였다.
- RAW 264.7 세포는 1% P/S (penicillin/streptomycin) 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM을 사용하였다. 세포는 37℃, 95% 습도와 5% CO2가 유지되는 세포 incubator (Sanyo Electric Biochemical Co.
- Aqueous nonradioactive cell proliferation assay (MTS)은 Promega (Madison,USA)에서 구매하였다. Reverse transcription kit는 Invitrogen(Carlsbad, USA)에서 구매하였다. Taq polymerase는 Kapa Biosystems (Woburn, USA)에서 구매하였다.
- SD-rat 12주령(240∼250 g)은 나라바이오텍(Seoul, Korea)에서 구매하였으며, 규칙적인 광원 설비 및 일정한 온도와 습도가(12시간 light/dark cycle, 22∼24℃, 55∼60%)가 유지되는 동물실에서 사육하였다.
- Reverse transcription kit는 Invitrogen(Carlsbad, USA)에서 구매하였다. Taq polymerase는 Kapa Biosystems (Woburn, USA)에서 구매하였다. PCR primers는 Genotech (Daejeon, Korea)에서 구매하였다.
- c-Fos, β-Actin은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA)에서 구매하였다.
- wFF의 acteoside (sigma, ≥99%, HPLC-grade) HPLC 분석을 위해 HPLC (High performance liquid chromatography; Waters Alliance 2695)-PDA (Photodiode Array; Waters 2996) detector system을 사용하였다.
- 세포 배지인 DMEM은 Welgene (Daejeon, Korea)에서 구매하였다. 또 다른 세포 배지인 Minimum Essential Medium alpha (alpha-MEM) 그리고 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다. Penicillin/Streptomycin은 Invitrogen (Carlsbad,USA)에서 구매하였다.
- c-Fos, β-Actin은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, USA)에서 구매하였다. 또한, NFATc1는BD Pharmingen (San Diego, USA)에서 구매하였다. Peroxidase IgG는 Jackson ImmunoResearch (West Grove, USA)에서 구매하였다.
- 본 연구에 사용된 連翹(Omniherb, Seoul, Korea)의 기원 식물은 연교(連翹) Forsythia suspensa Vahl (물푸레나무과 Oleaceae)의 열매이며, 경희대학교 본초학 교실의 자문을 통해 확인하였다. 連翹 350 g에 증류수 3.
- 분석을 위한 칼럼은 XBridge™ C18 (4.6 mm×250 mm; Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였고, 유속은 1 ml/min로 흘려주었으며 시료 주입량은 10 μl였다.
- RANKL은 Peprotech (London, UK)에서 구매하였다. 세포 배지인 DMEM은 Welgene (Daejeon, Korea)에서 구매하였다. 또 다른 세포 배지인 Minimum Essential Medium alpha (alpha-MEM) 그리고 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco (Gaithersburg, USA)에서 구매하였다.
- 7 세포는 1% P/S (penicillin/streptomycin) 및 10% FBS (fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM을 사용하였다. 세포는 37℃, 95% 습도와 5% CO2가 유지되는 세포 incubator (Sanyo Electric Biochemical Co., Sanyo, Oragun, Japan)에서 배양하였다.
- 6 mm×250 mm; Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였고, 유속은 1 ml/min로 흘려주었으며 시료 주입량은 10 μl였다. 이동상은 acetonitrile (ACN) 과 1% acetic acid가 포함된 물(H2O)를 사용하였으며, 검출 파장은 335 nm로 하였다.
데이터처리
- 본 연구의 자료는 3번 이상 반복 수행하였고, 그 평균값과 표준편차를 계산하였다. Graph Pad PRISM Software (Version 5.01,Graphpad Software Inc, San Diego, USA)를 이용하여 그래프를 나타내었고, 각 군 간의 평균치와 표준오차 사이에 대한 유의성은 One-way ANOVA로 분석하고 Dunnett`s multiple comparison test를 이용하여 각 군의 평균 간의 유의성을 검정하였다. p＜0.
- 본 연구의 자료는 3번 이상 반복 수행하였고, 그 평균값과 표준편차를 계산하였다. Graph Pad PRISM Software (Version 5.
이론/모형
- wFF의 세포 독성 측정은 MTS assay로 실시하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1. wFF는 RANKL로 유도된 TRAP-positive cell의 형성 및 TRAP activity를 유의하게 감소시켰고 이는 wFF가 파골세포 분화를 억제함을 의미한다.
- 2. wFF는 RANKL로 유도된 파골세포에 의해 생성된 Pit area를 유의하게 감소시켰고 이는 wFF가 파골세포의 골 흡수 능을 억제함을 의미한다.
- 3. wFF는 RANKL로 유도된 파골세포 분화 관련 TRAP, CA II, CTK, MMP-9 유전자의 발현을 억제함은 물론, 파골세포 분화 필수 전사인자인 NFATc1과 c-Fos의 유전자 및 단백질 발현을 감소시켰다. 이는 wFF의 파골세포 분화 및 골 흡수능 억제가 파골세포 필수 인자인 NFATc1의 발현 억제에 매게 된다는 것을 의미한다.
- 4. wFF는 난소적출로 유도된 흰쥐 모델에서 BMD의 감소와 대퇴골 무게의 감소, 경골 회분의 감소를 유의하게 억제하였다. 또한, 골 소주 면적의 감소를 유의하게 억제하였다.
- MTS assay를 통하여 세포 생존율을 측정한 결과, wFF 500 μg/ml 농도에서 독성을 보이는 것이 확인되었으며(83.4%), 파골세포 억제실험은 독성을 보이지 않는 농도인 250 μg/ml 이내로 진행되었다(Fig. 1C).
- NFATc1 발현 조절 상위 인자인 c-Fos의 유전자 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 200μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.01) 억제되었다(Fig.4B).
- RANKL을 통하여 파골세포를 유도하면서 wFF를 처리한 결과, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 TRAP-양성 다핵 세포 수가(44.4%) 감소하였고(Fig. 2A, 2C), TRAP 활성도를 측정한 결과 wFF 100, 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 TRAP 활성도가(44.8%) 감소하였다(Fig. 2D).
- 05) 억제되었다. wFF 저농도 군에서는 OVX군에 비해 몸무게 증가가 억제되었지만 유의하지 않았고, wFF 고농도 군에서는 6주부터 OVX 보다 몸무게의 증가가(p＜0.05) 억제되었다(Fig. 5A). 또한, 자궁의 무게는 rat 희생 후 OVX군은 sham군보다 유의하게 자궁의 무게가 감소하였으며(p＜0.
- wFF를 처리한 결과, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 pit 형성이(14.7%) 억제되었다(Fig. 2B, 2E).
- 5D). 그리고 추출된 경골의 회분 함량을 측정하였을 때, OVX군은 sham군보다 경골의 회분 함량이 유의하게 감소하였다(p＜0.01). E2군은 OVX군에 비해 경골의 회분 함량의 감소가 유의하게(p＜0.
- 그리고 파골세포의 골 흡수에 필요한 CTK의 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.05) 증가하였으며, wFF 100,200 μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.05) 억제되었다.
- 본 실험에서는 몸무게 및 자궁의 무게 측정을 통한 폐경기 유사 모델의 유발 여부를 판단하였다28). 난소적출 후 매주 같은 시각 몸무게를 측정한 결과, OVX이후 2주부터 OVX군은 sham군보다 몸무게가 유의하게(p＜0.01) 증가하였다. 양성대조군(E2)은 3주부터 OVX군에 비하여 몸무게의 증가가 유의하게(p＜0.
- 조직학적 염색(H&E)를 통하여 wFF가 폐경기를 통한 rat의 대퇴골 골 소주 면적 감소에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. 대퇴골의 면적은 폐경으로 인한 에스트로겐 결핍으로 OVX군은 sham군 보다 유의하게(p＜0.01) 감소되었고, E2군은 OVX군보다 골 소주면적의 감소를 유의하게(p＜0.01) 억제되었다. wFF 저농도군에서는 OVX군보다 골 소주 면적의 감소를 유의하게(p＜0.
- 01) 억제되었다. 또한, wFF 저농도 군에서는 OVX군보다 양측 대퇴골의 무게 감소가 유의하게(p＜0.01) 억제되었고, wFF 고농도 군에서는 OVX군보다 양측 대퇴골의 무게 감소가 유의하게(p＜0.05) 억제되었다(Fig. 5D). 그리고 추출된 경골의 회분 함량을 측정하였을 때, OVX군은 sham군보다 경골의 회분 함량이 유의하게 감소하였다(p＜0.
- 01) 억제되었다. 또한, wFF 투약 군은 OVX군보다 경골의 회분 함량의 감소가 유의하게(p＜0.05) 억제되었다(Fig. 5E).
- wFF는 난소적출로 유도된 흰쥐 모델에서 BMD의 감소와 대퇴골 무게의 감소, 경골 회분의 감소를 유의하게 억제하였다. 또한, 골 소주 면적의 감소를 유의하게 억제하였다. 이는 wFF가 폐경기 골다공증 동물모델의 주요 병증을 억제함을 의미한다.
- 또한, 단백질 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 100, 200 μg/ml 농도에서는 대조군보다 유의하게(p＜0.05, p＜0.01) 억제되었다(Fig. 4C).
- 또한, 단백질 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 100, 200 μg/ml 농도에서는 대조군보다 유의하게(p＜0.05, p＜0.01) 억제되었다(Fig. 4D).
- 또한, 양측 대퇴골의 무게 및 회분 함량의 감소를 유의하게 억제했다. 또한, 대퇴골 조직 내 골소주 면적을 측정한 결과, OVX군이 sham군과 비교하면 유의하게 감소하였고, E2군과 wFF 저농도 군은 OVX군에 비해 골 소주 면적의 감소를 유의하게 억제하였고, wFF 고농도 군에서는 OVX군에 비해 골 소주 면적의 감소를 억제하는 경향을 나타내었다. 이는, wFF는 난소적출을 통한 골다공증의 골밀도 감소를 유의하게 억제한다는 것을 의미한다.
- wFF의 투여는 OVX를 통한 골밀도 감소를 유의하게 억제했다. 또한, 양측 대퇴골의 무게 및 회분 함량의 감소를 유의하게 억제했다. 또한, 대퇴골 조직 내 골소주 면적을 측정한 결과, OVX군이 sham군과 비교하면 유의하게 감소하였고, E2군과 wFF 저농도 군은 OVX군에 비해 골 소주 면적의 감소를 유의하게 억제하였고, wFF 고농도 군에서는 OVX군에 비해 골 소주 면적의 감소를 억제하는 경향을 나타내었다.
- 5C). 또한, 양측 대퇴골의 무게를 측정하였을 때, OVX군은 sham군보다 양측 대퇴골의 무게가 유의하게 감소하였다(p＜0.01). E2군은 OVX군보다 양측 대퇴골의 무게 감소가 유의하게(p＜0.
- 5A). 또한, 자궁의 무게는 rat 희생 후 OVX군은 sham군보다 유의하게 자궁의 무게가 감소하였으며(p＜0.01), E2군은 OVX군에 비해 자궁 무게 감소가 유의하게(p＜0.01) 억제되었다. 하지만 wFF 투약 군은 OVX군에 비하여 자궁 무게 감소에 큰 차이를 보이지 않았다(Fig.
- 또한, 파골세포 골 흡수 능에 필요한 CA II의 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며,wFF 100, 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.01) 억제되었다.
- 또한, 파골세포 골 흡수 능에 필요한 MMP-9의 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 200 μg/ml 농도에서는 대조군보다 유의하게(p＜0.05) 억제되었다(Fig. 3).
- 즉, pit area의 증가는 파골세포의 활성화를 뜻한다. 본 실험 결과 wFF는 농도에서 대조군보다 pit 형성이 억제되었다. 이는 wFF가 파골세포의 분화 및 뼈 흡수 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
- BMD는 뼈의 단단함과 질을 나타내는 지표로써, 골다공증이 유발되면 감소하게 된다. 본 실험에서, 난소적출을 통한 골다공증을 유도한 결과, 대퇴골 내 BMD는 OVX군이 sham군과 비교하여 유의하게 감소했다. wFF의 투여는 OVX를 통한 골밀도 감소를 유의하게 억제했다.
- c-Fos는 파골세포 분화 초기에 발현되는 전사인자로, c-Fos의 발현이 결핍되면 파골세포의 분화가 억제된다. 실험 결과, wFF는 NFATc1와 c-Fos의 유전자 및 단백질 발현을 유의하게 억제했다. 이는, wFF가 NFATc1과c-Fos의 발현 억제를 통해 파골세포의 활동을 억제하는 것으로 나타낸다.
- 본 실험에서는 wFF군의 파골세포 억제효능을 TRAP 염색과 활성도 측정을 통하여 확인하였다. 실험 결과, wFF는 파골세포 내 TRAP의 발현과 활성을 억제했다. Pit area는 파골세포의 생성과 골 흡수 활성도와 관련이 있어 파골 세포 뼈 흡수능력을 측정하기 위해서 관찰하는 실험이다30).
- MMP-9를 화학적으로 억제하면 파골세포의 분화가 저하되어 골의 재흡수가 줄어든다34,35). 실험 결과, 골 흡수와 관련한 지표인 CAII, CTK 그리고 MMP-9은 대조군이 정상군보다 유의하게 증가하였으며, wFF가 발현을 억제했다. 이는 wFF가 파골세포 분화 및 골 흡수 기능을 유의하게 억제한다는 것을 나타낸다.
- RANK 수용체에 RANKL이 결합하면 파골세포를 형성하고 골의 재흡수 과정을 촉진한다32). 실험 결과, 대조군이 정상군보다 증가하였지만 유의하지는 않았고, wFF 처리는 대조군과 비교하여 유의한 감소를 나타내었다. 이는 wFF가 파골세포의 성숙을 억제하는 것을 나타낸다.
- 이상의 결과로, wFF는 파골세포 분화 및 골 흡수 관련 유전자의 발현을 억제하였고, 난소적출 흰쥐의 대퇴골 무게 감소 및 골 소주면적 감소를 억제하였다. 이는 서론에서 언급한 항염증 효과를 가지는 한약이 골다공증 치료에 효과를 보일 수 있다는 가설을 입증한 것으로, wFF는 임상에서 골다공증의 치료 및 예방에 응용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 파골세포 분화에 있어 핵심전사인자인 NFATc1의 유전자 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 100, 200 μg/ml 농도에서는 대조군보다 유의하게(p＜0.01) 억제하였다(Fig. 4A).
- 파골세포 분화에 필요한 RANK의 발현은 대조군이 정상군보다 증가하였지만 유의하지는 않았으며, wFF 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.05) 억제되었다.
- 파골세포의 특이지표인 TRAP의 발현은 대조군이 정상군보다 유의하게(p＜0.01) 증가하였으며, wFF 100, 200 μg/ml 농도에서 대조군보다 유의하게(p＜0.05,p＜0.01) 억제되었다.
후속연구
- 이상의 결과로, wFF는 파골세포 분화 및 골 흡수 관련 유전자의 발현을 억제하였고, 난소적출 흰쥐의 대퇴골 무게 감소 및 골 소주면적 감소를 억제하였다. 이는 서론에서 언급한 항염증 효과를 가지는 한약이 골다공증 치료에 효과를 보일 수 있다는 가설을 입증한 것으로, wFF는 임상에서 골다공증의 치료 및 예방에 응용될 수 있을 것으로 생각된다. 향후, wFF의 항염효과와 골다공증 유발 억제 효과 간의 연관성에 관한 심화 연구 및 염증성 골다공증 모델에서 wFF의 항 골다공증 효과 검증은 연구적 가치가 있을 것으로 생각된다.
- 이는 서론에서 언급한 항염증 효과를 가지는 한약이 골다공증 치료에 효과를 보일 수 있다는 가설을 입증한 것으로, wFF는 임상에서 골다공증의 치료 및 예방에 응용될 수 있을 것으로 생각된다. 향후, wFF의 항염효과와 골다공증 유발 억제 효과 간의 연관성에 관한 심화 연구 및 염증성 골다공증 모델에서 wFF의 항 골다공증 효과 검증은 연구적 가치가 있을 것으로 생각된다.
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