[논문]White spot syndrome virus (WSSV)의 VP28에 대한 단클론 항체 생산

방지형; 김위식; 김춘섭; 김종오; 오명주

doi:10.7847/jfp.2019.32.1.045

White spot syndrome virus (WSSV)의 VP28에 대한 단클론 항체 생산
Production of monoclonal antibodies against VP28 of white spot syndrome virus (WSSV) 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.32 no.1, 2019년, pp.45 - 48

방지형 (전남대학교 수산생명의학과) , 김위식 (전남대학교 수산생명의학과) , 김춘섭 ((주)엔바이로젠) , 김종오 (부경대학교 수산과학연구소) , 오명주 (전남대학교 수산생명의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

We developed and subsequently characterized mouse monoclonal antibodies (MAbs) against recombinant VP28 structural protein (rVP28) of white spot syndrome virus (WSSV). We established six hybridoma clones secreting MAbs against rVP28: 15A11, 20G6, 31H2, 34H6, 38D1 and 43A1. All six MAbs recognized the 25 kDa of protein in gill homogenates of WSSV-infected shrimp by western blot analysis, while no reactivity was observed in gill homogenates of normal shrimp. Moreover, high enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) optical density (OD) values (0.8-2.68) were observed in the hemolymphs from WSSV-infected shrimp, while low OD values (less than 0.24) were recorded in the hemolymphs from normal shrimp, by using these six MAbs produced in this study. These results suggest that these six MAbs are useful for the detection of WSSV.

주제어

표/그림 (2)

그림 Fig. 1. Western blot analysis using gill homogenates of WSSV-infected shrimp (a) and normal shrimp (b). M: molecular marker, 1: MAb 15A11, 2: MAb 20G6, 3: MAb 31H2, 4: MAb 34H6, 5: MAb 38D1, 6: MAb 43A1, 7: anti-WSSV VP28 MAb (positive control).
그림 Fig. 2. ELISA analysis using hemolymphs from WSSVinfected shrimp and normal shrimp and seven MAbs (15A11, 20G6, 31H2, 34H6, 38D1, 43A1, PC (positive control): anti-WSSV VP28 MAb).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 WSSV를 특이적으로 인식하는 MAb를 생산하고자 하였다. 무세포 단백질 합성시스템으로 제작한 WSSV의 VP28 재조합 단백질을 Ni-affinity column chromatography로 정제하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 약 27 kDa에서 단일 밴드가 관찰되었다 (data not shown).
그러나 면역학적인 방법은 WSSV에 대한 특이 항체가 보급되어 있지 않아 사용되지 않고 있다. 본 연구에서는 양식 현장에서 신속한진단에 용이하게 적용될 수 있는 면역학적 검사법의 개선과 보급을 위한 목적으로 WSSV에 대한단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 제작 한 후 항체의 특성을 평가하였다. WSSV의 VP28은 다양한 면역학적 검사법에 유용하게 사용될 수 있음이 보고되어 있어 (Sithigorngul et al.

제안 방법

전기영동 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치 (ATTO, Japan)를 이용하여 144 mA에서 1시간 동안 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA)에 blotting하였다. 2% skim milk로 1시간 동안 blocking한 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어있는 goat antimouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체, 1,000배 희석액사용)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색하였다. 양성 대조구로는 WSSV의 VP28을 인식하는 MAb (Aquatic diagnostics Ltd, Scotland)를 사용하였다.
2015년 인천에 위치한 새우양식장에서 WSSV에 감염된 흰다리새우 (Litopenaeus vannamei)로부터 DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출한 후, NdeI과 XhoI의 제한효소서열을 추가하여 제작한 WSSV VP28 증폭용 프라이머 (Forward: 5'-AAACATATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC-3', reverse: 5'-GCTCTCGAGTTCCTCGGTCTCAGTGCC-3')를 이용하여 VP28 유전자를 증폭하였다 (denaturation 95℃ 1분, annealing 58℃ 1분, extension 72℃ 1분, 35 cycle).
ELISA는 WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 혈림프를 사용하여 실시하였다. 증류수로 50배 희석한 혈림프를 96 well ELISA microplates (Greinerbioone, Germany)에 각각 50 ㎕/well 분주한 후 37℃에서 overnight하여 항원을 코팅하였다.
rVP28로 면역시킨 후 마우스의 림프절과 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 rVP28 (항원)을 사용한 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다 (15A11, 20G6, 31H2, 34H6, 38D1, 43A1). 6개의 MAb와 rVP28를 사용하여 western blot을 실시한 결과, 6개 항체 모두 약 27 kDa의 단백질을 강하게 인식하였다 (data not shown).
2015년 인천에 위치한 새우양식장에서 WSSV에 감염된 흰다리새우 (Litopenaeus vannamei)로부터 DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출한 후, NdeI과 XhoI의 제한효소서열을 추가하여 제작한 WSSV VP28 증폭용 프라이머 (Forward: 5'-AAACATATGGATCTTTCTTTCACTCTTTC-3', reverse: 5'-GCTCTCGAGTTCCTCGGTCTCAGTGCC-3')를 이용하여 VP28 유전자를 증폭하였다 (denaturation 95℃ 1분, annealing 58℃ 1분, extension 72℃ 1분, 35 cycle). PCR 산물을 Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 T-blunt PCR cloning kit (Solgent,Korea)를 사용하여 클로닝하였다. 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 VP28 부위를 잘라낸 후, pET23a(+) 발현 벡터 (Novagen, Germany)에 서브 클로닝하였다.
T-PBS로 3회 세정하고 1차 항체로는 본 연구에서 생산한 MAb를 시료 당 2개의 well에 50 ㎕씩 분주하여 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 3회 세정한 후 HRP가 표식되어 있는 goat anti-mouse IgG (Youngin, Korea)를 5% skim milk로 1,000배 희석하여 well 당 50 ㎕씩 분주하였으며, 25℃에서 1시간 반응하였다. T-PBS로 5회 세정한 후 tetramethylbenzidine base (TMBC,Surmodics, USA)를 50 ㎕/well 분주하여 5분간 발색하였다.
WSSV의 VP28에 대한 재조합 단백질 (rVP28)을 제작한 후 마우스의 면역 항원으로 사용하여 MAb를 생산하였다.
rVP28 (100 ug)과 incompletefreund’s adjuvant를 동량으로 섞어 BALB/c 마우스의 발바닥에 1차 접종하였고, 2주 후에 rVP28로 2차 접종하였다.
rVP28로 면역시킨 후 마우스의 림프절과 myeloma 세포를 융합시켜 hybridoma를 제작하였다. Hybridoma로부터 생성되는 항체를 rVP28 (항원)을 사용한 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다 (15A11, 20G6, 31H2, 34H6, 38D1, 43A1).
제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 VP28 부위를 잘라낸 후, pET23a(+) 발현 벡터 (Novagen, Germany)에 서브 클로닝하였다. 재조합 VP28 단백질은 ExiProgen 단백질 합성 시스템 (Bioneer, Korea)을 이용하여 제조사의 매뉴얼을 따라 무세포단백질 발현 방법으로 생산하였다. 발현된 VP28 단백질은 Ni-affinity column chromatography (GE healthcare, USA)를 사용하여 정제한 후 storage buffer (50 mM Tris-Cl(pH 7.
Western blot는 rVP28과 WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 아가미 조직 마쇄액을 사용하여 12% polyacryla- mide gel에 loading한 후 30 mA에서 전기영동 하였다. 전기영동 후, gel에 있는 단백질을 transblot 장치 (ATTO, Japan)를 이용하여 144 mA에서 1시간 동안 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA)에 blotting하였다. 2% skim milk로 1시간 동안 blocking한 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어있는 goat antimouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체, 1,000배 희석액사용)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색하였다.
제작된 MAb의 특이성을 조사하기 위해, west- ern blot과 ELISA를 실시하였다 (Laemmli, 1970;Towbin et al., 1979; Kim et al., 2018). Western blot는 rVP28과 WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 아가미 조직 마쇄액을 사용하여 12% polyacryla- mide gel에 loading한 후 30 mA에서 전기영동 하였다.
PCR 산물을 Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 T-blunt PCR cloning kit (Solgent,Korea)를 사용하여 클로닝하였다. 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 VP28 부위를 잘라낸 후, pET23a(+) 발현 벡터 (Novagen, Germany)에 서브 클로닝하였다. 재조합 VP28 단백질은 ExiProgen 단백질 합성 시스템 (Bioneer, Korea)을 이용하여 제조사의 매뉴얼을 따라 무세포단백질 발현 방법으로 생산하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 양식 현장에서 신속한진단에 용이하게 적용될 수 있는 면역학적 검사법의 개선과 보급을 위한 목적으로 WSSV에 대한단클론 항체(monoclonal antibody, MAb)를 제작 한 후 항체의 특성을 평가하였다. WSSV의 VP28은 다양한 면역학적 검사법에 유용하게 사용될 수 있음이 보고되어 있어 (Sithigorngul et al., 2006;Makesh et al., 2006), 본 연구에서는 MAb 제작을 위한 타겟 단백질로서 VP28을 선정하였다.
본 연구에서는 무세포 단백질 발현 방법으로 제작된 WSSV의 rVP28을 사용하여 총 6개의 MAb를 생산하였다. 6개의 MAb는 western blot과 ELISA 상에서 WSSV에 감염된 새우와 정상새우를 뚜렷이 구분할 수 있어 본 연구에서 제작된 항체는 WSSV를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
각 well에 2N H₂SO₄를 50 ㎕씩 넣어 발색 반응을 중지시킨 후, microplate photometer (Multiskan, USA)로 450 nm에서 흡광도 (opical density,OD)를 측정하였다. 양성 대조구로는 VP28을 인식하는 MAb (Aquatic diagnostics Ltd, Scotland)를 사용하였다. OD값은 ELISA를 2회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
2% skim milk로 1시간 동안 blocking한 후, 본 연구에서 제작한 MAb (1차 항체)와 alkaline phosphatase (AP)가 붙어있는 goat antimouse IgG (Sigma, USA, 2차 항체, 1,000배 희석액사용)로 반응시키고 AP가 붙어 있는 substrate kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 발색하였다. 양성 대조구로는 WSSV의 VP28을 인식하는 MAb (Aquatic diagnostics Ltd, Scotland)를 사용하였다.

이론/모형

rVP28에 대한 MAb는 Jeong et al. (2017)의 방법에 따라 제작하였다. rVP28 (100 ug)과 incompletefreund’s adjuvant를 동량으로 섞어 BALB/c 마우스의 발바닥에 1차 접종하였고, 2주 후에 rVP28로 2차 접종하였다.
3일 후 마우스의 림프절을 분리한 후 polyethylene glycol (Roche, Germany)를 사용하여 myeloma 세포 (SP2/0-Ag14)와 융합시킨 후 fetal bovine serum이 10% 첨가된 hypoxanthine-ami- nopterin-thymidine (HAT) 배지 (Gibco, USA)로 현탁시킨 후 96 well plate에 분주하여 37℃로 설정된 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 양성 hybridoma는 rVP28를 항원으로 사용하여 ELISA로 선별하였고, 제한 희석법으로 3회 클로닝 하였다 (Liddelland Cryer, 1991). 선별된 MAb의 isotyping은 Pierce rapid ELISA mouse mAb isotyping kit (Thermo,USA)를 사용하여 결정하였다.

성능/효과

Hybridoma로부터 생성되는 항체를 rVP28 (항원)을 사용한 ELISA법으로 선별한 후, 제한 희석법으로 클로닝하여 최종적으로 6개의 MAb를 선별하였다 (15A11, 20G6, 31H2, 34H6, 38D1, 43A1). 6개의 MAb와 rVP28를 사용하여 western blot을 실시한 결과, 6개 항체 모두 약 27 kDa의 단백질을 강하게 인식하였다 (data not shown). WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 아가미 조직 마쇄액을 사용하여 western blot을 실시한 결과에서는 6개 항체 모두 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직 마쇄액에서만 약 25 kDa에서 밴드가 관찰되었다(Fig.
6개의 MAb와 rVP28를 사용하여 western blot을 실시한 결과, 6개 항체 모두 약 27 kDa의 단백질을 강하게 인식하였다 (data not shown). WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 아가미 조직 마쇄액을 사용하여 western blot을 실시한 결과에서는 6개 항체 모두 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직 마쇄액에서만 약 25 kDa에서 밴드가 관찰되었다(Fig. 1). 34H6과 43A1 항체에서는 15A11, 20G6,31H2, 38D1 보다 강한 반응을 보였다.
WSSV에 감염된 새우와 정상새우의 혈림프를 사용하여 ELISA를 실시한 결과, 6개의 MAb 모두 WSSV에 감염된 새우의 혈림프에 높은 OD값을(0.8-2.68) 보였고, 정상 새우의 혈림프에는 0.24 이하의 OD값을 보였다 (Fig. 2). 특히, 15A11, 20G6,34H6 및 43A1 항체는 31H2과 38D1 보다 높은 OD값을 보였다.
본 연구에서는 WSSV를 특이적으로 인식하는 MAb를 생산하고자 하였다. 무세포 단백질 합성시스템으로 제작한 WSSV의 VP28 재조합 단백질을 Ni-affinity column chromatography로 정제하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 약 27 kDa에서 단일 밴드가 관찰되었다 (data not shown).
, 2019). 본 연구를 통해 무세포 단백질 합성 시스템으로 WSSV의 VP28 부위에 대한 재조합 단백질을 생산할 수 있음이 확인되었다.
양성 대조구에서도 WSSV에 감염된 새우의 혈림프에서만 높은 OD값을 보였다. 이상의 결과, 제작된 6 개의 MAb는 ELISA에서 WSSV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다. 제작된 MAb의 isotype을 분석한 결과, H chain은 IgG1(15A11, 34H6, 38D1, 43A1)과 IgG2a (20G6과 31H2)로 나타났으며, L chain은 모두 kappa로 확인되었다 (data not shown).
양성 대조구에서도 WSSV에 감염된 새우의 아가미 조직 마쇄액에서만 약 25 kDa에서 밴드가 관찰되었다. 이상의 결과, 제작된 6개의 MAb는 western blot에서 WSSV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.
이상의 결과, 제작된 6 개의 MAb는 ELISA에서 WSSV에 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다. 제작된 MAb의 isotype을 분석한 결과, H chain은 IgG1(15A11, 34H6, 38D1, 43A1)과 IgG2a (20G6과 31H2)로 나타났으며, L chain은 모두 kappa로 확인되었다 (data not shown).
2). 특히, 15A11, 20G6,34H6 및 43A1 항체는 31H2과 38D1 보다 높은 OD값을 보였다. 양성 대조구에서도 WSSV에 감염된 새우의 혈림프에서만 높은 OD값을 보였다.

후속연구

본 연구에서는 무세포 단백질 발현 방법으로 제작된 WSSV의 rVP28을 사용하여 총 6개의 MAb를 생산하였다. 6개의 MAb는 western blot과 ELISA 상에서 WSSV에 감염된 새우와 정상새우를 뚜렷이 구분할 수 있어 본 연구에서 제작된 항체는 WSSV를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	무세포 단백질 발현 방법으로 제작된 WSSV의 장점은?	무세포 단백질 합성 시스템은 세포 배양과 같은 단계를 배제하면서 유전 정보를 특정 공간에 구애받지 않고 번역할 수 있는 장점을 가지고 있다(Gregorio et al., 2019).
	흰반점병이란 무엇인가?	흰반점병 (white spot disease, WSD)은 한국을 비롯하여 중국, 일본, 동남아시아, 미국 등지에서 양식되고 있는 새우에서 발생하는 질병으로 알려져 있다 (Egusa et al., 2006; OIE, 2017).
	WSD에 걸린 새우에게서 발견되는 현상은?	, 2006; OIE, 2017). WSD에 걸린 새우는 일반적으로 두흉갑에 흰반점이 형성되고, 병리조직학적으로는 외배엽과 중배엽 기원의 조직에서 세포의 핵 비대와 핵내 봉입체가 관찰된다(Egusa et al., 2006; OIE, 2017).

참고문헌 (11)

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Jeong, H.N., Jang, M.S., Oh, M.J. and Kim, W.S.: Production of monoclonal antibodies against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV, genotype IVa) from olive flounder. J. Fish Pathol., 30: 149-154, 2017.
Kim, W.S., Kim, S.W. and Oh, M.J.: Production of monoclonal antibodies against nervous necrosis virus (NNV, RGNNV genotype). Korean J. Fish Aquat. Sci., 51: 328-331, 2018.
Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 1970.

상세보기
Liddell, J.E. and Cryer, A.: A practical guide to monoclonal antibodies, pp. 90-104, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1991.
Makesh, M., Koteeswaran, A., Daniel Joy Chandran, N., Murali Manohar, B. and Ramasamy, V.: Development of monoclonal antibodies against VP28 of WSSV and its application to detect WSSV using immunocomb. Aquaculture, 261: 64-71, 2006.

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Sithigorngul, W., Rukpratanporn, S., Pecharaburanin, N., Longyant, S., Chaivisuthangkura, P. and Sithigorngul, P.: A simple and rapid immunochromatographic test strip for detection of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp. Dis. Aquat. Org., 72: 101-106, 2006.

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Vlak, J.M., Bonami, J.R., Flegel, T.W., Kou, G.H., Lightner, D.V., Lo, C.F., Loh, P.C. and Walker, P.W.: Family Nimaviridiae. In virus taxonomy, In Virus taxonomy: Eighth report of the international committee on taxonomy of viruses, pp. 187-192, editors. Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U and Ball, L. A., Elsevier/Academic Press, United Kingdom, 2005.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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