[논문]제주개의 microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석

고민정; 권슬기; 김혜란; 변재현; 김대철; 최봉환

doi:10.5352/jls.2019.29.6.637

제주개의 microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석
Genomic Polymorphism Analysis Using Microsatellites in the Jeju Dogs 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.6 = no.230, 2019년, pp.637 - 644

고민정 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 권슬기 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과) , 김혜란 (농촌진흥청 국립축산과학원 영양생리팀) , 변재현 (제주축산진흥원) , 김대철 (제주축산진흥원) , 최봉환 (농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과)

초록
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본 연구에서는 우리나라 토종견인 제주개의 보존 보호를 위해 그에 대한 유전적 특성을 파악하고자 개 7품종(제주개, 동경개, 독일 세퍼트, 진도개, 라브라도 레트리버, 풍산개, 삽살개)에 대해 총 139두와 microsatellite 마커 16종을 이용하여 대립유전자형을 분석하였다. 그 결과 16종의 marker에서 131개의 대립유전자 좌위를 확인하였고, 이 중 FH3381에서 18개의 가장 많은 대립유전자형이 확인되었으며 FH2834는 대립유전자형이 2개로 가장 적게 확인되었다. 또한, 마커별 기대되는 이형접합도의 전체적 평균치를 보았을 때 기대이형접합도와 관측이형접합도가 외래견보다 토종개가 높게 나타났고 PIC값은 0.000부터 0.862로 확인되었다. 제주개와 다른 품종 간의 계통수를 분석한 결과 삽살개와 94%로 가장 가까운 것으로 확인 되었다. 제주개와 다른 품종들 간의 유전적 거리를 확인한 결과 삽살개가 0.393으로 가장 가깝게 나타났고 토종개 중에서는 동경개와의 거리가 0.507로 가장 먼 것으로 나타났다. 개체별의 분포도를 살펴보면 제주개는 레트리버, 삽살개와 같은 그룹 내에 존재하였고 풍산개, 동경개, 진도개, 셰퍼트가 같은 그룹 내에 존재한 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구 결과를 통해 확인된 유전적 특성 정보들은 제주개의 유전적 특성 연구에 이용할 수 있는 기초적 자료로 활용가치가 높은 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to analyze the genetic characteristics of the Jeju dog for preservation and protection. A total of 139 dogs from 7 dog breeds, including the Jeju dog, were genotyped using 16 microsatellite markers. The results revealed 2-18 alleles per locus, with a total of 131 alleles among the 16 markers. Most alleles were identified for FH3381, which had 18 alleles, whereas FH2834 had the fewest alleles, with just 2. When the total mean value was observed, the expected heterozygosity and observed heterozygosity were higher for than for outgroup dogs, and the PIC values ranged from 0.000 to 0.862, respectively. The phylogenetic tree analysis of the Jeju dog and other dog varieties revealed that the Jeju dog is closest to the Sapsal dog (0.393). The phylogeny between the Jeju and Korean domestic dogs showed that the Jeju dog is most distant from the Dongkyung dog (0.507). Looking at the distribution individually, the Jeju dog is in the same group as the Labrador Retriever and the Sapsal dog. Meanwhile, the Poongsan, Dongkyung, and Jindo dogs and the German Shepherd were in the same group. Genetic information confirmed through the results of this study can be used as basic data to study the genetic characteristics of the Jeju dog.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. List of microsatellite markers
그림 Fig. 1. Phylogenetic tree showing the genetic relations among 7 breeds based on genetic distance in dogs. JJ: Jeju, DK: Dongkyung, GS: German Sherpherd, JD: Jindo, LR: Labrador Retriever, PS: Poongsan, SS: Sapsal.
표 Table 2. Expected and observed heterozygosity obtained from 16 microsatellites in 7 breeds
표 Table 3. Expected and observed heterozygosity obtained from 16 microsatellites loci in 7 breeds.
표 Table 4. Polymorphism information content (PIC) values obtained from 16 microsatellites in 7breeds
표 Table 5. F-statistic for inbreeding estimates within-population inbreeding coefficient (FIS) in 7 breeds canine populations
표 Table 6. Results of F-statistics per locus in 7 breeds canine
그림 Fig. 2. A neighbor joining dendrogram was constructed from allele-sharing distances among 139 individuals in 7 breeds.
표 Table 7. DA genetic distance matrix estimated from the frequencies of 16 microsatellites loci among the 7 breeds

AI 본문요약
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문제 정의

F-statistics(Fis, Fit, Fst) 결과는 수치가 클수록 집단 내 개체간 상관 정도가 높은 것을 의미하며 반대로 수치가 낮을수록 근친도가 낮음을 의미한다. 각 MS marker의 집단별 유전적 고정에 따른 근친도 및 집단간의 차별성 여부를 확인하기 위하여 실시하였다. 근친교배계수(Fis)는 각 집단별 이형접합체의 감소 정도를 나타내는 척도로써 근친도가 존재하면 양의 값으로 나타내며 음의 값은 존재하지 않음을 뜻한다.

가설 설정

He: expected heterozygosity, Ho: observed heterozygosity.

제안 방법

Microsatellite 마커를 이용한 분석을 위해 각 마커의 좌위는 미국 국립생물공학정보센터(NCBI, national center for biotechnology information)의 mapviewer 데이터베이스에 보고된 개의 microsatellite 유전자 좌위를 기초로 하여 선정하였고, 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(allele frequency), primer의 결합 반응 온도, 증폭 산물의 크기, 형광물질(dye) 등을 고려하여 최종적으로 16개 2세트로 나누어multiplex PCR이 가능하도록 조합되었다(Table 1).
PCR 산물은 1:70으로 희석한 후 희석액 1 ul, Hi-Di formamide (Applied Biosystems) 1 ml, GeneScan 500 LIZ size standard (Applied Biosystems) 10 ul를 혼합한 후 95℃에서 5분간 변성 반응을 시키고 ice에서 3분 동안 침지 한 뒤 자동 염기서열 분석 장치인 ABI 3730xl genetic analyzer (AppliedBiosystems)에 의해 각 유전자 좌위의 대립유전자를 검출하였고 대립유전자에 대한 분석은 GeneMapper version 4.0 software (Applied Biosystems)을 이용하여 PCR 산물의 크기와 표지 인자를 종류별로 분류하여 분석하였다.
그 후 multiplex PCR을 수행하기 위해 GeneAmp PCR system 9700 (AppliedBiosystems, USA) 기기에서 95℃에서 15분간의 변성 반응을 실시한 후 94℃에서 60초, 62℃에서 75초, 72℃에서 60초를 5 cycle, 94℃에서 60초, 61℃에서 75초, 72℃에서 60초를 5cycle, 94℃에서 60초, 60℃에서 75초, 72℃에서 60초를 25cycle을 수행한 후, 마지막으로 65℃에서 30분간 합성 반응을 실시하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 3% metaphor gel (Lonza,USA)을 이용하여 전기영동 과정을 통해 증폭 산물의 상태를 확인하였다.
5mM dNTP 3 ul를 혼합한 뒤 증류수를 첨가하여 총 25 ul로 준비하였다. 그 후 multiplex PCR을 수행하기 위해 GeneAmp PCR system 9700 (AppliedBiosystems, USA) 기기에서 95℃에서 15분간의 변성 반응을 실시한 후 94℃에서 60초, 62℃에서 75초, 72℃에서 60초를 5 cycle, 94℃에서 60초, 61℃에서 75초, 72℃에서 60초를 5cycle, 94℃에서 60초, 60℃에서 75초, 72℃에서 60초를 25cycle을 수행한 후, 마지막으로 65℃에서 30분간 합성 반응을 실시하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 3% metaphor gel (Lonza,USA)을 이용하여 전기영동 과정을 통해 증폭 산물의 상태를 확인하였다.
1). 또한 개체간의 유전적 분화 정도를 확인하기 위해 개체별 대립유전자 빈도를 근거로 allele-sharing을 측정하여 개체별 유전적 거리의 추정 값을 계산하였으며 Phylip v.3.0을 통해 tree file을 작성하여 TreeView v.1.6프로그램으로 개체별 Neighbor-Joining dendrogram을 작성하였다.
또한, 제주개의 혈통관리를 위하여 제주개의 안정적 사양관리를 통한 제주개 품종 정립과 유전학적 연구 활동이 필요하다. 이에 따라 본 연구에서는 제주개의 유전적 특성을 파악하기 위해 microsatellite 마커를 이용하여 제주개, 동경개, 세퍼트, 진도개, 레트리버, 풍산개, 삽살개의 총 139두의 DNA로 마커별 대립유전자형을 분석하였다.
우리나라에서는 천연기념물로 지정된 진도개를 비롯하여 삽살개, 동경개, 풍산개 등은 잘 알려져 있지만 그 외의 토종견들은 관심조차 받기 어려운 실정이다. 이에 따라 본 연구에서는 제주개의 혈통 관리 및 유전적 특성을 파악하기 위해 제주개를 포함한 동경개, 세퍼트, 진도개, 레트리버, 풍산개, 삽살개의 139 두 DNA로 microsatellite 마커 16종을 이용하여 분석한 결과를 품종별로 분류하여 기대이형접합도, 관측이형접합도 그리고 검출된 대립유전자수의 평균과 표준편차를 Table 2에 제시하였다. 기대이형접합도의 경우 진도개에서 가장 높은 0.
0을 이용하여 개체별 분지도 작성을 위한 tree file을 작성하였다. 작성된 tree file은 TreeView 프로그램을 이용하여 개체별 Neighbor-Joining phylogenetic dendrogram을 작성하여 Fig.2에 제시하였다. Fig.
을 계산하였다. 집단 간유전적 유연관계를 분석하기 위해 DISPAN program을 이용하여 유전적 거리를 추정하였고 NJ (Neighbor-Joining)의 clustering 방법을 통해 유전적 거리를 근거로 한 phylogenetic tree를 작성하였다(Fig. 1). 또한 개체간의 유전적 분화 정도를 확인하기 위해 개체별 대립유전자 빈도를 근거로 allele-sharing을 측정하여 개체별 유전적 거리의 추정 값을 계산하였으며 Phylip v.
품종 간의 유연관계를 알아보기 위해 MS toolkit software 분석에서 구해진 Da genetic distance matrix를 DISPAN program에 도입하여 유전적 거리를 계산하였으며 이렇게 분석된 결과를 근거로 NJ (Neighbor-Joining)의 clustering방법을 이용하여 Fig. 1에 집단간의 분지도를 작성하여 제시하였다. 제주개와 나머지 6품종의 유전적 근연관계를 나타내는 집단 간의 분지도를 보면 제주개는 한국 토종개 집단 안에 위치한 것을 알 수 있고, 외래견종과는 뚜렷이 다른 유전자형을 가지고 있음을 알 수 있다.

대상 데이터

개 품종 중 제주개(Jeju, JJ), 동경개(Dongkyung, DK), 세퍼트(German Sherpherd, GS), 진도개(Jindo, JD), 레트리버(Labrador Retriever, LR), 풍산개(Poongsan, PS), 삽살개(Sapsal,SS)를 포함한 7품종(총 139두)의 혈액을 채취하여 wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였고 ND-1000 spectrophotometer(Nanodrop, USA)를 이용하여 260 nm 와 280 nm에서 흡광도를 측정하여 실험에 이용하였다.

데이터처리

GeneMapper version 4.0 software에 의해 도출된 16종의 microsatellite loci에 대한 139두의 allele typing data를 microsatellite toolkit software를 통해 통계분석을 실시하여 각 집단에 대한 locus 별 대립유전자의 수와 대립유전자 빈도(allele frequency) 및 집단별 관측이형접합율(observed heterozygosity, H_o), 기대이형접합율(expectation heterozygosity, H_E), PIC (polymorphism information content)를 산출하였다. 또한 집단별 유전적 다양성을 조사하기 위해 FSTAT v.
또한 Weir&Cockerham (1984)의 방식을 통한 F-검정을 실시하여 집단내 유전자 분화 정도인 FIS을 계산하였다.
분석 된 집단간의 유전적 구조에 따라 각 개체들이 어떻게 분포되어 있는가를 확인하기 위하여 simple allele-sharing 측정 수준을 통하여 개체별 대립 유전자의 빈도를 근거로 각 개체들 간의 유전적 거리에 대한 추정 값을 계산하였으며, 이를 바탕으로 유전 분석 프로그램 중 하나인 Phylip v.3.0을 이용하여 개체별 분지도 작성을 위한 tree file을 작성하였다. 작성된 tree file은 TreeView 프로그램을 이용하여 개체별 Neighbor-Joining phylogenetic dendrogram을 작성하여 Fig.

이론/모형

3. pro-gram을 이용하여 Hardy-Weinberg법칙을 통해 기대이형접합율, microsatellite marker별 공시 품종 집단에 대한 전체 이형접합율(H_t), 집단 내 이형접합율(H_s), 유전자의 분화 정도(G_st)및 유전자 좌위의 다형성 정보량, 집단간 유연 관계 분석을 위한 집단간 유전적 거리 및 표준 오차의 추정은 Nei 등(1983)의 방법으로 DISPAN package (Ota, 1993)를 이용하여 계산하였다.

성능/효과

검출된 대립유전자의 수에서는 진도개에서 가장 높은 6.25±2.82, 제주개에서 가장 낮은 3.31±1.49로 관찰되었다.
806으로 나타났다. 관측이형접합도의 경우 제주개는 FH3921에서 0.889로 가장 높게 확인되었으며 동경개는 FH2712에서 1로 전체 중 가장 높게 나타났고 셰퍼드는 FH3381에서 0.85, 진도개는 FH2712에서 0.9, 레트리버는 FH2537과 FH2998에서 0.9, 풍산개는 FH3381에서 0.895, 삽살개는 FH3372와 FH2097에서 0.9로 확인되었다. 전체적으로 평균치를 보았을 때, 기대이형접합도와 관측이형접합도가 외래견(셰퍼드, 레트리버)보다 토종개(제주개, 동경개, 진도개, 풍산개, 삽살개)가 높게 나타났다.
또한 제주개와 다른 품종 간의 계통수를 분석한 결과 삽살개와 94%로 가장 가까운 것으로 확인 되었다. 이를 계통발생학적으로 유연관계를 분석하여 유전적 거리를 나타낸 결과는 Table 7에 제시하였다.
65)로 확인되었다. 본 연구의 결과와 같이 기대이형접합도와 관측이형접합도, PIC가 외래견종보다 토종견이 수치가 더 높게 나타났다. F-statistics(Fis, Fit, Fst) 결과는 수치가 클수록 집단 내 개체간 상관 정도가 높은 것을 의미하며 반대로 수치가 낮을수록 근친도가 낮음을 의미한다.
Table 3은 MS marker의 유전자형을 분석하여 품종별 기대 이형접합도와 관측이형접합도를 제시하였다. 분석 결과 기대 이형접합도의 경우 제주개는 0.412~0.790(평균 0.541)으로 나타났고 동경개 0.273~0.858(평균 0.643), 셰퍼드 0.000~0.828(평균 0.493), 진도개 0.296~0.907(평균 0.649), 레트리버 0.050~0.894(평균 0.524), 풍산개 0.323~0.866(평균 0.596), 삽살개에서는 0.296~0.806(평균 0.589)으로 나타났다. 제주개는 FH3381 마커에서 0.
Table 4는 다형성 정보량(PIC)의 분석 결과를 제시하였다. 분석 결과, 대립유전자 수는 2~18개(평균 8.2)로 확인되었고 마커들 중 FH3381에서 PIC가 평균 0.803으로 가장 높게 나타났다. 제주개의 PIC는 0.
9로 확인되었다. 전체적으로 평균치를 보았을 때, 기대이형접합도와 관측이형접합도가 외래견(셰퍼드, 레트리버)보다 토종개(제주개, 동경개, 진도개, 풍산개, 삽살개)가 높게 나타났다.
589)으로 나타났다. 제주개는 FH3381 마커에서 0.79로 가장 높게 확인되었으며 동경개, 셰퍼드, 레트리버도 FH3381에서 각 0.858, 0.828, 0.894, 0.866으로 확인되었다. 진도개는 FH3921에서 0.
1에 집단간의 분지도를 작성하여 제시하였다. 제주개와 나머지 6품종의 유전적 근연관계를 나타내는 집단 간의 분지도를 보면 제주개는 한국 토종개 집단 안에 위치한 것을 알 수 있고, 외래견종과는 뚜렷이 다른 유전자형을 가지고 있음을 알 수 있다.
이를 계통발생학적으로 유연관계를 분석하여 유전적 거리를 나타낸 결과는 Table 7에 제시하였다. 제주개와 다른 품종들 간의 유전적 거리를 확인한 결과 삽살개가 0.393으로 가장 가깝게 나타났고 토종개 중에서는 동경개와의 거리가 0.507로 가장 먼 것으로 나타났다. 또한 외래견들과의 거리는 토종개들과의 거리와 비교했을 때 확연하게 차이를 나타냈다
Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)에 따르면 기대이형접합도보다 관측 이형접합도의 수치가 높게 나타났을 경우 Fis는 음의 값을 나타내고 이형접합체초과임을 뜻한다[6]. 좌위별 Fis값은 -0.484(REN197E16) ~ 0.532(REN277O05)로 나타났으며 그 중 Fis값이 0이상인 수치가 가장 많은 좌위들은 FH3058으로 이형접합체초과임을 알 수 있고, 0이하인 수치가 가장 많은 좌위들은 REN204K13에서 발견되었으며 관측이형접합도보다 기대이형접합도가 높다는 것을 알 수 있다.

후속연구

현재 토종개인 제주개에 대한 체계적인 조사나 연구가 미진한 실정이다. 본 연구는 차후 제주개의 유전 특성을 반영한 MS marker의 선발 관련 연구를 통해 제주개의 순수화에 대한 보존 및 강화가 가능할 것으로 사료되며, 이를 통해 제주개의 유전적 특성 연구에 큰 도움이 될 것으로 사료된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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