본 연구는 대기 중에 떠다니는 입자인 미세먼지의 발생원에 따라 여러 종류의 사람 세포주에 미치는 세포 독성 효과를 검증해 보고자 하였다. 실험에 사용된 미세먼지는 자동차의 공기 필터(차 미세먼지, 실외)와 집에 있는 청소기의 필터(집 미세먼지, 실내)에서 유래한 미세먼지를 에탄올 추출법으로 포집하여 여과한 다음 대략 $10{\mu}m$ 이하의 미세먼지를 세포배양액에 첨가하였다. MTT 분석 방법으로 조사된 세포성장의 반억제농도 값($IC_{50}$)은 집 미세먼지보다 차 미세먼지에서 각 세포에 대한 $IC_{50}$ 값이 유의적으로(p<0.05) 더 낮았고, 정상세포주인 섬유아세포(MRC-5) 및 사랑니 유래 중간엽성 성체줄기세포(DSC)에서 $IC_{50}$ 값은 폐암세포주(A-549) 및 위암세포주(AGS)에 비해 유의적으로(p<0.05) 더 낮았다. 차 미세먼지를 $100{\mu}g/ml$의 농도로 첨가하여 1주일동안 세포를 배양하여 세포배가시간을 조사하였던 바, 암세포주보다 MRC-5 및 DSC 세포주에서 미세먼지의 처리 후 세포배가시간이 유의적으로(p<0.05) 늘어나는 것을 관찰하였고, 미세먼지에 노출된 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제의 발현이 증가하여 세포의 노화가 일어나는 것을 관찰하였다. 또한, 차 미세먼지를 각 세포주의 $IC_{50}$ 값으로 1주일 동안 처리한 후, 염증 관련 유전자인 COX-2 및 IL-6의 발현이 유의적으로(p<0.05) 증가하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과로 보아, 미세먼지는 세포의 성장을 억제하고, 손상을 일으키면서 염증의 발현을 유도하는 것으로 조사되었다.
본 연구는 대기 중에 떠다니는 입자인 미세먼지의 발생원에 따라 여러 종류의 사람 세포주에 미치는 세포 독성 효과를 검증해 보고자 하였다. 실험에 사용된 미세먼지는 자동차의 공기 필터(차 미세먼지, 실외)와 집에 있는 청소기의 필터(집 미세먼지, 실내)에서 유래한 미세먼지를 에탄올 추출법으로 포집하여 여과한 다음 대략 $10{\mu}m$ 이하의 미세먼지를 세포배양액에 첨가하였다. MTT 분석 방법으로 조사된 세포성장의 반억제농도 값($IC_{50}$)은 집 미세먼지보다 차 미세먼지에서 각 세포에 대한 $IC_{50}$ 값이 유의적으로(p<0.05) 더 낮았고, 정상세포주인 섬유아세포(MRC-5) 및 사랑니 유래 중간엽성 성체줄기세포(DSC)에서 $IC_{50}$ 값은 폐암세포주(A-549) 및 위암세포주(AGS)에 비해 유의적으로(p<0.05) 더 낮았다. 차 미세먼지를 $100{\mu}g/ml$의 농도로 첨가하여 1주일동안 세포를 배양하여 세포배가시간을 조사하였던 바, 암세포주보다 MRC-5 및 DSC 세포주에서 미세먼지의 처리 후 세포배가시간이 유의적으로(p<0.05) 늘어나는 것을 관찰하였고, 미세먼지에 노출된 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제의 발현이 증가하여 세포의 노화가 일어나는 것을 관찰하였다. 또한, 차 미세먼지를 각 세포주의 $IC_{50}$ 값으로 1주일 동안 처리한 후, 염증 관련 유전자인 COX-2 및 IL-6의 발현이 유의적으로(p<0.05) 증가하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과로 보아, 미세먼지는 세포의 성장을 억제하고, 손상을 일으키면서 염증의 발현을 유도하는 것으로 조사되었다.
The present study investigated the cytotoxicity of particulate matter (PM) derived from car air filter (outdoor PM) and home cleaner filter (indoor PM) in the various human cell lines. Each outdoor and indoor PM were harvested by ethanol extraction method, subsequently sieved with 10 um filter paper...
The present study investigated the cytotoxicity of particulate matter (PM) derived from car air filter (outdoor PM) and home cleaner filter (indoor PM) in the various human cell lines. Each outdoor and indoor PM were harvested by ethanol extraction method, subsequently sieved with 10 um filter paper, sterilized with autoclave and added to culture media. The half maximal inhibitory concentration ($IC_{50}$) values was significantly (p<0.05) lower in the outdoor PM, compared with indoor PM, and the significantly (p<0.05) higher $IC_{50}$ values were observed in the cancer cell lines (A-549 lung adenocarcinoma and AGS stomach adenocarcinoma), than those of normal MRC-5 fibroblasts and dental papilla tissue derived-mesenchymal stem cells (DSC). After being exposed to $100{\mu}g/ml$ outdoor PM for 7 days, the population doubling time (PDT) was significantly (p<0.05) increased in especially MRC-5 and DSC cell lines, compared with untreated cell lines. Further, the expression of senescence-associated ${\beta}$-galactosidase activity was up-regulated in all the cells exposed to outdoor PM than those of untreated control. Besides, the expression level of inflammation-associated genes, such as cyclooxygenase-2 (COX-2) and interleukin-6 (IL-6) was found to be significantly (p<0.05) increased in the outdoor PM-treated cell lines than those of untreated cell lines. Our results showed that PM induces the cytotoxicity via arrest of cell growth, cell damage and inflammation response.
The present study investigated the cytotoxicity of particulate matter (PM) derived from car air filter (outdoor PM) and home cleaner filter (indoor PM) in the various human cell lines. Each outdoor and indoor PM were harvested by ethanol extraction method, subsequently sieved with 10 um filter paper, sterilized with autoclave and added to culture media. The half maximal inhibitory concentration ($IC_{50}$) values was significantly (p<0.05) lower in the outdoor PM, compared with indoor PM, and the significantly (p<0.05) higher $IC_{50}$ values were observed in the cancer cell lines (A-549 lung adenocarcinoma and AGS stomach adenocarcinoma), than those of normal MRC-5 fibroblasts and dental papilla tissue derived-mesenchymal stem cells (DSC). After being exposed to $100{\mu}g/ml$ outdoor PM for 7 days, the population doubling time (PDT) was significantly (p<0.05) increased in especially MRC-5 and DSC cell lines, compared with untreated cell lines. Further, the expression of senescence-associated ${\beta}$-galactosidase activity was up-regulated in all the cells exposed to outdoor PM than those of untreated control. Besides, the expression level of inflammation-associated genes, such as cyclooxygenase-2 (COX-2) and interleukin-6 (IL-6) was found to be significantly (p<0.05) increased in the outdoor PM-treated cell lines than those of untreated cell lines. Our results showed that PM induces the cytotoxicity via arrest of cell growth, cell damage and inflammation response.
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문제 정의
이렇게 추출한 미세먼지를 멸균하여 세균이나 곰팡이에 의해일어날 수 있는 세포의 손상이 일어날 수 있는 효과를 제거한다음 각 미세먼지를 사람에서 기원하는 여러 암세포주 및 정상체세포주에 처리하여 미세먼지의 발생원과 사람에서 기원하는 세포의 종류에 따라 미세먼지에 의한 반억제농도(halfmaximal inhibitory concentration, IC50) 값과 세포배가시간(population doubling time, PDT)을 측정하여, 각 미세먼지가세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 더 나아가, 미세먼지의 발생원이나 세포의 종류에 따라 일어날 수 있는 미세먼지에 의한 세포 성장 억제 효과뿐만 아니라 미세먼지는 세포의 직접적인 손상을 유발하고, 신체에 유입된 미세먼지는 인체에서 염증 반응을 유도한다고 보고하고 있어[37, 41], 이에미세먼지에 의한 세포 노화나 손상 정도를 조사하였고, 미세먼지에 직접적으로 노출된 세포에서 여러 염증 반응과 관련된 유전자의 발현 정도를 이 실험에서 좀 더 알아보고자 했다.
이에 본 연구를 통해 정상체세포, 성체줄기세포와 몇몇 암세포주를 포함한 여러 다양한 사람의 세포주에서 미세먼지의발생원에 따른 미세먼지의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여 우선 각 미세먼지에 대한 세포의 반억제농도의 측정과 함께 미세먼지에 노출된 세포의 세포배가시간의 변화를 조사하고 노화 관련 베타-갈락토시다아제의 발현으로 세포의 노화 및손상 정도를 조사하여 미세먼지가 세포에 미치는 직접적인영향을 알아보고자 했다. 또한, 미세먼지가 염증 유발에 관련되는지 알아보기 위해 여러 염증 관련 유전자의 발현 정도를알아보고자 하였다.
이에 본 연구를 통해 정상체세포, 성체줄기세포와 몇몇 암세포주를 포함한 여러 다양한 사람의 세포주에서 미세먼지의발생원에 따른 미세먼지의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여 우선 각 미세먼지에 대한 세포의 반억제농도의 측정과 함께 미세먼지에 노출된 세포의 세포배가시간의 변화를 조사하고 노화 관련 베타-갈락토시다아제의 발현으로 세포의 노화 및손상 정도를 조사하여 미세먼지가 세포에 미치는 직접적인영향을 알아보고자 했다. 또한, 미세먼지가 염증 유발에 관련되는지 알아보기 위해 여러 염증 관련 유전자의 발현 정도를알아보고자 하였다.
여러 선행의 연구에서 미세먼지는 세포 손상과 독성을 유발한다고 제안하고 있으나, 미세먼지에 노출된 여러 세포에서일어나는 독성 효과는 충분히 알려지지 않고 있다. 이에 우리는 미세먼지가 여러 종류의 세포에 미치는 독성 효과를 좀더 조사해 보고자 하였다. 또한, 미세먼지가 세포 독성이나 손상을 유발한다면 미세먼지의 발생원에 따른 세포 손상의차이가 있을 것이고, 사람에서 기원하는 여러 종류의 세포주에 따라 세포 손상 정도에 또한 차이가 있을 것이라는 생각하고 다음과 같은 실험을 진행하였다.
가설 설정
Analysis of cytotoxicity and determination of IC50 values by MTT assay in MRC-5, DSC, A-549 and AGS exposed to particulate matter. A: Inhibition curves of each cell line exposed to outdoor particulate matter. B: Inhibition curves of each cell line exposed to indoor particulate matter.
A: Inhibition curves of each cell line exposed to outdoor particulate matter. B: Inhibition curves of each cell line exposed to indoor particulate matter. C: Mean ± SEM of IC50 values in each cell line treated with indoor (□) and outdoor(■) particulate matter.
C: Mean ± SEM of IC50 values in each cell line treated with indoor (□) and outdoor(■) particulate matter.
제안 방법
개의 세포수(처리 전 세포수)를 계산하여 6-웰 세포배양 플레이트에 이식한 다음 대조군에는 신선한 배양액을 이용하여 배양하고실험군은 100 ug/ml의 차 미세먼지를 포함하는 배양액에서2~3일마다 배양액을 교환하며 1주일간 배양하였다. 1주일 후각 세포주의 세포수(처리 후 세포수)를 센 다음, 다음 공식에대입하여 미세먼지 처리에 의한 각 세포주의 세포주의 세포배가시간(population doubling time, PDT)을 계산하였다[18].PDT = 168 hr × log10/log2 (처리 후 세포수)-log (처리 후세포수).
6-웰 세포배양 플라스크에 각 웰 당 1×104개의 각 세포를이식한 다음, 차 미세먼지를 100 ug/ml의 농도로 포함한 배양액에서 1주일 동안 배양하여 각 세포주의 수를 세었고, 이에따라 세포배가시간을 측정하여 미세먼지가 세포의 성장이 미치는 효과를 정상배양액에서 배양한 대조군과 비교하였다(Fig. 4).
6-웰 세포배양 플레이트에 각 웰 당 1×104개의 각 세포를이식하고 0 mg/ml(기본 배양액), 0.1, 1, 10, 100 및 1,000 ug/ml의 미세먼지 농축액을 포함하는 배양액에서 1주일간 배양하였다.
3. Analysis of cytotoxicity and determination of IC50 values by MTT assay in MRC-5, DSC, A-549 and AGS exposed to particulate matter. A: Inhibition curves of each cell line exposed to outdoor particulate matter.
7).COX-2 및 IL6의 발현율은 항존유전자인 GAPDH의 발현과비교하여 상대적인 값으로 표시하였다. 대조군의 경우 COX-2의 발현율은 MRC-5는 검출되지 않았고, GAPDH에 비해 DSC에서는 10.
MRC-5, DSC, A-549 및 AGS 세포주 별로 1×104 개의 세포수(처리 전 세포수)를 계산하여 6-웰 세포배양 플레이트에 이식한 다음 대조군에는 신선한 배양액을 이용하여 배양하고실험군은 100 ug/ml의 차 미세먼지를 포함하는 배양액에서2~3일마다 배양액을 교환하며 1주일간 배양하였다.
MRC-5, DSC, A-549 및 AGS 세포주를 차 미세먼지에 대한각각의 반억제농도 값에서 1주일 동안 배양한 다음, 역전사효소-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chainreaction, RT-PCR)방법을 이용하여 세포내 염증 관련 유전자에 대한 발현을 검증하였다. 이 연구에서 사용된 염증 관련 유전자는 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 interleukin 6 (IL-6)이였고, 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 이전의 연구에서 증명되었다[24, 38].
MRC-5, DSC, A-549 및 AGS세포주를 6-웰 세포배양 플라스크에서 차 미세먼지 100 및 1,000 ug/ml을 포함하는 배양액에서 2~3일마다 배양액을 교환하며 1주일간 배양한 후 베타갈락토시다아제(β-galactosidase) 분석 세트(Cell Signaling Tech. USA)를 사용하여 세포 노화의 정도를 분석하였다.
이것을 다시 PCR 증폭 키트(Maximepre-mix PCR kit, iNtRON, Korea)를 사용하여 증폭되었다.PCR을 통한 DNA 증폭은 94℃에서 5분 동안 1회 처리 한 다음, 95℃ 30초, 60℃ 1분 및 72℃ 1분의 조건을 30회 동안 실시하였고, 최종적으로 72℃ 10분 동안 처리하였다. 증폭된 cDNA의 검증은 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 브롬화에티듐(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 다음, 자외선 하에서 관찰하였다.
RT-PCR 방법을 이용하여 실외의 차 미세먼지를 각 세포주의 반억제농도 값으로 1주일 동안 처리한 후, 각 세포주에서발현되는 COX-2 및 IL-6의 발현 정도를 조사하였다(Fig. 7).COX-2 및 IL6의 발현율은 항존유전자인 GAPDH의 발현과비교하여 상대적인 값으로 표시하였다.
각 세포주에 차 및 집 미세먼지를 0, 0.1, 1, 10, 100 및 1,000ug/ml의 농도로 배양액에 첨가하여 MTT 분석 방법으로 세포의 생존율을 분석하였다(Fig. 3). 각 세포주별로 미세먼지 농도를 첨가하지 않은 상태일 대 흡광도를 100%로 하여 상대적인흡광도를 비교하였고, 차 미세먼지(Fig.
이를 다시 12,000 g의조건으로 60분 동안 원심분리하여 에탄올이 포함된 상층액을 제거하여 미세먼지를 수집하였다. 다음으로 습윤멸균기(autoclave)로 세균류와 진균류를 멸균한 다음, 미세먼지의 무게를측정하여, -20℃에 보관한 다음 필요에 따라 실험에서 사용하였다(Fig. 1).
더 나아가, 이 연구에서 베타-갈락토시다아제의 발현을 분석하는 방법으로 미세먼지가 세포노화를 유도할 수 있는지 검증하였다. 다른 선행 연구에서도 이 방법은 세포노화를 검증하기 위해 가장 일반적으로 사용되었다[18, 25, 31].
5℃의 CO2 항온배양기에서 A-DMEM 세포배양액에 5%의혈청을 첨가하여 체외배양하였다. 도립위상차현미경(Nikon,Japan)으로 관찰하면서 3~4일마다 배양액을 교환해 주었고,세포가 80% 이상 증식하면 계대배양을 실시하였다. 세포의계대배양은 세포배양 플라스크의 배양액을 모두 제거한 다음,트립신을 첨가하여 대략 2분 동안 배양하여 세포배양 플라스크의 바닥에서 떨어진 세포를 회수한 뒤 원심분리관에 넣어 원심분리기로 돌려 25T 세포배양 플라스크에 1/4씩 분주하여각 세포를 계대배양하였다.
3B) 모두에서 미세먼지의 농도가 증가할수록 세포의 생존율이 낮아진다는 것을 확인하였으며, 1000 ug/ml 미세먼지농도에서 거의 모든 세포는 살아있지 않은 것이 관찰되었다.또한, Fig. 3A 및 Fig 3B를 기준으로, 각 세포의 생존율이 50%가 되는 지점의 반억제농도 값(IC50)을 비교하였다(Fig 3C). 차미세먼지에 노출된 후 IC50값은 MRC-5에서 50.
이에 우리는 미세먼지가 여러 종류의 세포에 미치는 독성 효과를 좀더 조사해 보고자 하였다. 또한, 미세먼지가 세포 독성이나 손상을 유발한다면 미세먼지의 발생원에 따른 세포 손상의차이가 있을 것이고, 사람에서 기원하는 여러 종류의 세포주에 따라 세포 손상 정도에 또한 차이가 있을 것이라는 생각하고 다음과 같은 실험을 진행하였다. 연구에 사용된 미세먼지는 차량의 공기 필터와 집에 있는 청소기의 필터에서 미세먼지를 각각 추출하였다.
미세먼지의 발생원에 따라 각 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 실외의 미세먼지를 대표하여 차량의 에어컨 필터에있는 먼지(차 미세먼지, 실외 미세먼지, outdoor PM)를 사용하였고, 일상 실내생활 과정에서 발생하는 미세먼지를 대표하여 청소기 필터에 있는 먼지(집 미세먼지, 실내 미세먼지, indoor PM)를 포집하여 연구를 진행하였다. 각 미세먼지는 경남진주시에 있는 자동차 업소에서 에어컨 필터와 청소기 필터를우선 수집하여 자른 다음, 원 등의 방법에 따라 70~80%의 에탄올이 포함된 비커에 넣어 밀봉하여 가끔 휘저어 주면서 실온에서 대략 1주일 동안 두었다[40].
이 연구에서 사용된 염증 관련 유전자는 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 interleukin 6 (IL-6)이였고, 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 이전의 연구에서 증명되었다[24, 38]. 실험 방법은 RNA 추출 전용 키트(RNeasymini kit, Qiagen, USA)를 이용해 각 세포주에서 총 RNA를 추출했고 RNA 농도는 분광광도계로 측정하였다. 1 ug의 총RNA는 cDNA 합성 전용 키트(Omniscript RT kit, Qiagen,USA)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 반응으로 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다.
또한, 미세먼지가 세포 독성이나 손상을 유발한다면 미세먼지의 발생원에 따른 세포 손상의차이가 있을 것이고, 사람에서 기원하는 여러 종류의 세포주에 따라 세포 손상 정도에 또한 차이가 있을 것이라는 생각하고 다음과 같은 실험을 진행하였다. 연구에 사용된 미세먼지는 차량의 공기 필터와 집에 있는 청소기의 필터에서 미세먼지를 각각 추출하였다. 우선, 에어컨 필터(실외)와 청소기 필터(실내)에서 미세먼지를 에탄올 추출방법으로 추출하여 10 um필터에 거르고 원심 분리하여 PM10 미세먼지를 추출했다.
연구에 사용된 미세먼지는 차량의 공기 필터와 집에 있는 청소기의 필터에서 미세먼지를 각각 추출하였다. 우선, 에어컨 필터(실외)와 청소기 필터(실내)에서 미세먼지를 에탄올 추출방법으로 추출하여 10 um필터에 거르고 원심 분리하여 PM10 미세먼지를 추출했다. 이렇게 추출한 미세먼지를 멸균하여 세균이나 곰팡이에 의해일어날 수 있는 세포의 손상이 일어날 수 있는 효과를 제거한다음 각 미세먼지를 사람에서 기원하는 여러 암세포주 및 정상체세포주에 처리하여 미세먼지의 발생원과 사람에서 기원하는 세포의 종류에 따라 미세먼지에 의한 반억제농도(halfmaximal inhibitory concentration, IC50) 값과 세포배가시간(population doubling time, PDT)을 측정하여, 각 미세먼지가세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다.
2% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)에서 15분 동안 실온에서 고정한 다음 다시D-PBS로 세척하였다. 이 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제 염색액으로 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고 이를 D-PBS로 세척 후 푸른색으로 염색된 세포를 도립위상차현미경(Nikon, Japan)하에서 관찰하였다.
우선, 에어컨 필터(실외)와 청소기 필터(실내)에서 미세먼지를 에탄올 추출방법으로 추출하여 10 um필터에 거르고 원심 분리하여 PM10 미세먼지를 추출했다. 이렇게 추출한 미세먼지를 멸균하여 세균이나 곰팡이에 의해일어날 수 있는 세포의 손상이 일어날 수 있는 효과를 제거한다음 각 미세먼지를 사람에서 기원하는 여러 암세포주 및 정상체세포주에 처리하여 미세먼지의 발생원과 사람에서 기원하는 세포의 종류에 따라 미세먼지에 의한 반억제농도(halfmaximal inhibitory concentration, IC50) 값과 세포배가시간(population doubling time, PDT)을 측정하여, 각 미세먼지가세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 더 나아가, 미세먼지의 발생원이나 세포의 종류에 따라 일어날 수 있는 미세먼지에 의한 세포 성장 억제 효과뿐만 아니라 미세먼지는 세포의 직접적인 손상을 유발하고, 신체에 유입된 미세먼지는 인체에서 염증 반응을 유도한다고 보고하고 있어[37, 41], 이에미세먼지에 의한 세포 노화나 손상 정도를 조사하였고, 미세먼지에 직접적으로 노출된 세포에서 여러 염증 반응과 관련된 유전자의 발현 정도를 이 실험에서 좀 더 알아보고자 했다.
정상배양액에서 배양한 대조군과 실외의 차 미세먼지가100 혹은 1,000 ug/ml로 첨가된 배양액에서 실험군의 각 세포주를 배양한 후, 노화 관련 베타-갈락토시다아제 활성도를 비교하여 세포의 손상이나 노화 정도를 비교하였다. 높은 베타갈락토시다아제 활성을 가지는 세포는 파란색으로 염색되어세포가 노화된 것임을 나타낸다.
PCR을 통한 DNA 증폭은 94℃에서 5분 동안 1회 처리 한 다음, 95℃ 30초, 60℃ 1분 및 72℃ 1분의 조건을 30회 동안 실시하였고, 최종적으로 72℃ 10분 동안 처리하였다. 증폭된 cDNA의 검증은 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 브롬화에티듐(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 다음, 자외선 하에서 관찰하였다. 증폭된 유전자의 강도는 GelQuant NET 프로그램(V.
이것을 다시 D-PBS로 세척하였고, 각 웰에dimethyl sulfoxide (DMSO)를 200 ul씩 첨가하여 30분 동안두어 포르마잔을 녹인 후, 이를 회수하였다. 회수된 포르마잔추출액을 각각 50 ul씩 분주하여 96-웰 플레이트에 넣어 플레이트 리더기(Perkin Elmer, USA)로 405 nm의 파장에서 흡광도를 조사하였다. 측정된 값은 미세먼지를 포함하지 않은 배양액에서 자란 세포에 대한 상대적인 값을 계산하여 엑셀 프로그램이나 온라인 프로그램(http://www.
대상 데이터
이 연구에서 사용된 세포주는 사람의 정상 섬유아세포(MRC5), 사랑니 유래 중간엽 성체줄기세포(DSC), 폐암 세포주(A549) 및 위암 세포주(AGS)를 각각 사용하였다. MRC-5, A-549및 AGS 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 분양받았고, 사랑니 유래 중간엽 성체줄기세포(DSC)의 분리 및 그 세포가 가지는 기본적인 줄기세포의 세포학적인 특성은 이전의 연구에서 증명되었다[9, 10]. 각 세포주들은36.
미세먼지의 발생원에 따라 각 세포에 미치는 영향을 조사하기 위해 실외의 미세먼지를 대표하여 차량의 에어컨 필터에있는 먼지(차 미세먼지, 실외 미세먼지, outdoor PM)를 사용하였고, 일상 실내생활 과정에서 발생하는 미세먼지를 대표하여 청소기 필터에 있는 먼지(집 미세먼지, 실내 미세먼지, indoor PM)를 포집하여 연구를 진행하였다. 각 미세먼지는 경남진주시에 있는 자동차 업소에서 에어컨 필터와 청소기 필터를우선 수집하여 자른 다음, 원 등의 방법에 따라 70~80%의 에탄올이 포함된 비커에 넣어 밀봉하여 가끔 휘저어 주면서 실온에서 대략 1주일 동안 두었다[40]. 미세먼지가 포함된 에탄올추출액은 종이필터(CHMLAB, Spain)를 사용하여 대략 10 μm이상의 크기를 가진 입자를 걸러내었다.
이 연구에서 다양한 종류의 사람 세포주를 사용하였다. 세포의 종류에 따라 집과 차 미세먼지에서의 반억제농도 값을비교하였을 때, 집과 차 미세먼지 모두에서 정상 섬유아세포인 MRC-5보다는 치아조직 유래 성체줄기세포인 DSC에서 좀더 높은 반억제농도 값을 나타내었고, 이 두 세포주보다는 폐암세포주인 A-549와 위암세포주인 AGS 세포주에 훨씬 높은반억제농도 값을 나타내어 정상체세포보다는 암세포에서 미세먼지에 대한 저항성이 컸다.
이 연구에서 사용된 세포주는 사람의 정상 섬유아세포(MRC5), 사랑니 유래 중간엽 성체줄기세포(DSC), 폐암 세포주(A549) 및 위암 세포주(AGS)를 각각 사용하였다. MRC-5, A-549및 AGS 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 분양받았고, 사랑니 유래 중간엽 성체줄기세포(DSC)의 분리 및 그 세포가 가지는 기본적인 줄기세포의 세포학적인 특성은 이전의 연구에서 증명되었다[9, 10].
MRC-5, DSC, A-549 및 AGS 세포주를 차 미세먼지에 대한각각의 반억제농도 값에서 1주일 동안 배양한 다음, 역전사효소-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chainreaction, RT-PCR)방법을 이용하여 세포내 염증 관련 유전자에 대한 발현을 검증하였다. 이 연구에서 사용된 염증 관련 유전자는 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 interleukin 6 (IL-6)이였고, 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 이전의 연구에서 증명되었다[24, 38]. 실험 방법은 RNA 추출 전용 키트(RNeasymini kit, Qiagen, USA)를 이용해 각 세포주에서 총 RNA를 추출했고 RNA 농도는 분광광도계로 측정하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하여 SPSS (21.0) 통계프로그램으로 평균 및 표준오차(Mean ± SEM)를 구하였다.
0) 통계프로그램으로 평균 및 표준오차(Mean ± SEM)를 구하였다.이 값들이 통계적인 유의성을 가지는지 검정하기 위하여 던컨(Duncan) 다중범위검정을 실시여 P의 값이 0.05 미만일 때통계적인 차이가 있는 것으로 하였다.
증폭된 cDNA의 검증은 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 실시하여 브롬화에티듐(ethidium bromide, EtBr)로 염색한 다음, 자외선 하에서 관찰하였다. 증폭된 유전자의 강도는 GelQuant NET 프로그램(V.1.7.8)을 이용하여 측정하였고, 각 유전자의 발현량은 항존유전자로 사용된 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 발현을 100%로 하여 상대적으로 비교하였다.
회수된 포르마잔추출액을 각각 50 ul씩 분주하여 96-웰 플레이트에 넣어 플레이트 리더기(Perkin Elmer, USA)로 405 nm의 파장에서 흡광도를 조사하였다. 측정된 값은 미세먼지를 포함하지 않은 배양액에서 자란 세포에 대한 상대적인 값을 계산하여 엑셀 프로그램이나 온라인 프로그램(http://www.ic50.tk/)을 이용하여 반억제농도(IC50) 값을 분석하였다.
성능/효과
높은 베타갈락토시다아제 활성을 가지는 세포는 파란색으로 염색되어세포가 노화된 것임을 나타낸다. MRC-5 및 DSC 세포주에서대조군보다 100 ug/ml의 미세먼지에 노출된 실험군에서 파란색이 더 진하게 나타난 것을 통해 미세먼지에 의해 세포 노화와 손상이 진행되는 것을 확인하였고, 1,000 ug/ml의 미세먼지를 포함하는 배양액에서는 MRC-5 및 DSC 세포가 모두 사멸되어 염색을 할 수 없었다(Fig. 5).
MRC-5의 경우 대조군의 배가시간은 약 43시간이었으나 실험군은 약 96시간으로 미세먼지의 농도가 100 μg/ml인 배양액의 세포의 증식 속도가 유의적으로(p<0.05) 현저히 억제되었다는 것을 알 수 있었다.
3). 각 세포주별로 미세먼지 농도를 첨가하지 않은 상태일 대 흡광도를 100%로 하여 상대적인흡광도를 비교하였고, 차 미세먼지(Fig. 3A) 및 집 미세먼지(Fig. 3B) 모두에서 미세먼지의 농도가 증가할수록 세포의 생존율이 낮아진다는 것을 확인하였으며, 1000 ug/ml 미세먼지농도에서 거의 모든 세포는 살아있지 않은 것이 관찰되었다.또한, Fig.
나아가, 두 미세먼지에서각 세포주간에 정상 섬유아세포인 MRC-5보다는 성체줄기세포인 DSC에서 이 둘의 세포주보다 폐암세포주인 A-549와 위암세포주인 AGS에서 IC50값이 유의적으로(p<0.05) 현저히 높아 암세포주는 미세먼지에 대한 저항성이 훨씬 크다는 것을알 수 있었다.
이 연구에서도 미세먼지는 세포 노화를 유발하는 것으로 증명되었고,역시 정상체세포보다 암세포에서 세포노화에 더 저항적이었다. 노화와 연관된 베타-갈락토시다아제의 발현뿐만 아니라,미세먼지의 처리 후 세포 형태의 변화를 관찰할 수 있었다.노화된 세포는 세포의 부피가 커지면서 세포가 세포배양접시에 부착이 되었을 때 편평한 모양을 하게 된다[8, 11].
대조군의 경우 COX-2의 발현율은 MRC-5는 검출되지 않았고, GAPDH에 비해 DSC에서는 10.8±1.42, A-549에서는 75.3±6.43, AGS에서는 각각6.4±1.11% 수준이었다.
또한, A-549 및 AGS 암세포주에서 100 ug/ml의 미세먼지를 포함하는 배양액에서 각 세포주를 배양하였을 때 보다는1,000 ug/ml의 미세먼지를 포함하는 배양액에서 세포가 노출되었을 때, 더욱 진하게 파란색을 나타내어 역시 높은 농도의미세먼지는 암세포의 세포 노화를 유도하는 것으로 확인하였으나, 정상세포주인 MRC-5와 DSC와 비교하여, 암세포주는미세먼지에 좀 더 저항적이라는 것을 이 실험에서도 알 수있었다(Fig. 6). 특히, 정상세포주뿐만 아니라 암세포주에서도미세먼지에 노출된 세포는 세포의 크기에서 점점 커지고 편평해지는 것을 관찰하여 세포의 형태학적인 변화가 종종 일어나는 것을 알 수 있었다.
또한,암세포인 A-549와 AGS 세포주는 정상체세포보다 세포배가시간이 짧아, 세포 분열속도가 빠르다는 것을 알 수 있었으며,100 ug/ml의 실외의 차 유래 미세먼지에서 세포배가시간은조금 증가하는 경향이 있었으나, 유의적인(p<0.05) 차이는 없었다.
미세먼지를 처리하지 않은 정상배양 세포의 현미경 사진과는 달리 세포의 세포막 주변에많은 미세먼지가 달라붙어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한,현미경 하에서 세포 주위에 있는 미세먼지를 관찰하였을 때,아주 작은 미세먼지와 함께 크기가 20 um 이상이 되는 상당히큰 미세먼지를 확인할 수 있었다. 필터로 여과 후 이렇게 크기가 큰 미세먼지가 현미경 하에서 나타난 것은 미세먼지를 배양액에 첨가하였을 때, 미세먼지끼리 서로 뭉쳐져서 나타난 현상이라고 생각된다.
2). 미세먼지를 처리하지 않은 정상배양 세포의 현미경 사진과는 달리 세포의 세포막 주변에많은 미세먼지가 달라붙어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한,현미경 하에서 세포 주위에 있는 미세먼지를 관찰하였을 때,아주 작은 미세먼지와 함께 크기가 20 um 이상이 되는 상당히큰 미세먼지를 확인할 수 있었다.
반면 미세먼지를 처리한 실험군의 경우 COX-2의 발현율은 MRC-5에서는 56.5±3.76, DSC에서는69.3±1.40, A-549에서는 85.7±8.53, AGS에서는 84.7±7.50% 수준이었으며, 폐암세포주인 A-549에서 COX-2 및 IL-6의 발현이 사용된 다른 세포주에 비해 현저히 상승되어 있는 것을알 수 있었다.
이 연구에서 다양한 종류의 사람 세포주를 사용하였다. 세포의 종류에 따라 집과 차 미세먼지에서의 반억제농도 값을비교하였을 때, 집과 차 미세먼지 모두에서 정상 섬유아세포인 MRC-5보다는 치아조직 유래 성체줄기세포인 DSC에서 좀더 높은 반억제농도 값을 나타내었고, 이 두 세포주보다는 폐암세포주인 A-549와 위암세포주인 AGS 세포주에 훨씬 높은반억제농도 값을 나타내어 정상체세포보다는 암세포에서 미세먼지에 대한 저항성이 컸다. 세포의 종류에 따라 미세먼지에 대한 세포 독성의 차이는 역시 불분명하다.
51시간이었다. 암세포인 A-549와 AGS 세포주는 정상 체세포와 성체줄기세포보다 세포배가시간이 짧아, 세포 분열속도가 좀 더 빠르다는 것을 알 수 있었다. 그러나 미세먼지를 첨가한 실험군인 MRC-5의 세포배가시간은 96.
이 연구에서 사용된 사람의 정상 및 암세포주는 배양액에첨가된 미세먼지 농도가 증가함에 따라 미세먼지는 세포의독성을 유발하여 세포의 생존율이 감소하였고, 세포의 노화와염증을 유발하는 것으로 나타났다. 그러나 미세먼지의 발생원에 따라 그 효과가 차이가 있었다.
또한, 초미세먼지의 농도가 각각 90 μg/m3와 180 μg/m3 이상으로 2시간 동안 지속되면 미세먼지 주의보 및 경보를내린다. 이 연구에서 차와 집에서 유래하는 미세먼지는 일반적인 체세포인 MRC-5 섬유아세포에서 평균적으로 대략 100ug/ml 정도이었고, 치아조직 유래 성체줄기세포에서는 평균적으로 대략 200 ug/ml 정도를 나타내었다. 그러나 미세먼지의 발생원에 따라 그 독성 효과는 조금 차이가 있을 것이고,이 실험에서는 발생 기원별 각 미세먼지를 일주일 동안 배양액에 첨가하여 직접적으로 세포를 노출하여 비교하여, 현재의연구 결과와 미세먼지 예보 수준의 값과 직접적인 비교는 할수 없겠지만, 현재의 연구에서 세포 성장의 반억제농도 값은환경청에서 고시한 미세먼지 및 초미세먼지의 예보수준에 값이 비슷하였다.
다른 선행 연구에서도 이 방법은 세포노화를 검증하기 위해 가장 일반적으로 사용되었다[18, 25, 31]. 이 연구에서도 미세먼지는 세포 노화를 유발하는 것으로 증명되었고,역시 정상체세포보다 암세포에서 세포노화에 더 저항적이었다. 노화와 연관된 베타-갈락토시다아제의 발현뿐만 아니라,미세먼지의 처리 후 세포 형태의 변화를 관찰할 수 있었다.
나아가, 정상적인 세포는 세포분열을 위해계속적인 성장인자(growth factors) 혹은 세포분열촉진인자(mitogens)의 자극이 필요하고, 정상적인 체세포는 이러한 자극이 없으면 세포사멸 단계에 접어들게 된다고 알려져 있지만, 암세포는 정상세포에 비해 이러한 자극 혹은 촉진 인자가없을지라도 유전적인 변이로 인해 계속적인 세포성장과 분열을 할 수 있다[6, 35]. 이 연구에서도 미세먼지에 노출된 세포는세포의 성장 억제가 유도되었지만, 이러한 것은 정상체세포보다 암세포에서 좀 더 저항적이었다. 이러한 이유는 암세포는정상세포보다 좀 더 세포사멸에 훨씬 저항적일 뿐만 아니라,이 연구에 나타난 것처럼 미세먼지에 의해 세포막으로 둘러싸인 세포는 성장인자 등의 세포의 외부 자극을 방해하는 역할을 할 수 있다.
이러한 IC50값의분석 결과를 통해 실내의 집 미세먼지보다 실외의 차 미세먼지가 유의적으로(p<0.05) 더 낮은 IC50값을 나타내어, 더 큰 독성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
60% 수준이었다. 이상의 결과에서 실외의 차 미세먼지에 노출된 세포는 COX-2 및 IL-6의 염증 관련 유전자의 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타나, 미세먼지에 노출된 세포는 염증반응이 일어나는 것으로 나타났다.
그러나 미세먼지의 발생원에 따라 그 효과가 차이가 있었다. 차에서 유래하는 실외 미세먼지와 집에서 유래하는 실내 미세먼지를 사용하여 세포 성장의 반억제농도를 비교해보았을 때, 집 미세먼지보다 차 미세먼지에 의한 반억제농도가 유의적으로 훨씬 낮아, 차 미세먼지가 세포에 더 큰 생장 억제와 독성 효과를 나타낸다는 것을알 수 있었다. 일반적으로 미세먼지 속에는 일반적으로 금속(elements) 화합물인 알루미늄, 철, 아연 농도가 상대적으로높았다고 하며, 여러 질산염(NO3-), 황산염(SO42-), 암모늄 이온(NH4+) 등의 이온 성분도 많이 포함되어 있다고 보고하고 있다[20, 21, 33].
6). 특히, 정상세포주뿐만 아니라 암세포주에서도미세먼지에 노출된 세포는 세포의 크기에서 점점 커지고 편평해지는 것을 관찰하여 세포의 형태학적인 변화가 종종 일어나는 것을 알 수 있었다.
또한, 오염원에서 직접 대기로 방출되는 1차 미세먼지는 대기 중의 산소나수증기 등과 반응하여 좀 더 다양한 2차 미세먼지가 자동차의필터에는 더 축적될 것으로 생각한다. 현재의 연구에서도 각미세먼지를 포집한 후 실내의 집 미세먼지보다 실외의 차 미세먼지의 색이 더 검은색을 띠고 있었다. 일반적으로 미세먼지는 계절에 따라 상이 할지라도, 실내보다 실외의 미세먼지농도가 더 높다고 보고하고 있다[2].
후속연구
이러한 이유는 암세포는정상세포보다 좀 더 세포사멸에 훨씬 저항적일 뿐만 아니라,이 연구에 나타난 것처럼 미세먼지에 의해 세포막으로 둘러싸인 세포는 성장인자 등의 세포의 외부 자극을 방해하는 역할을 할 수 있다. 그러나 암세포는 그런 외부 자극이 없이 세포가생존과 분열을 할 수 있어, 미세먼지에 대한 저항성이 좀 더클 것으로 생각되고, 미세먼지가 세포 내로 유입되어 세포사멸 단계를 자극하였는지는 대한 것은 좀 더 연구가 필요할것이라고 생각된다.
이에 후속 연구를 통해좀 더 밝혀보는 것도 좋을 것이라고 생각된다. 또한, 미세먼지의 농도가 높아질수록 세포의 증식 속도가 감소하고, 손상을주어 미세먼지를 줄이기 위해 개인적으로도 다양한 노력을하고 국가적 차원에서, 더 나아가 세계 여러 나라가 힘을 합쳐미세먼지의 농도를 줄이기 위한 노력이 필요할 것이다.
특히, 디젤엔진으로부터 생성되는 배기가스는 가솔린엔진의 배기가스보다 일산화탄소, 탄화수소, 질소 산화물,오존 등을 좀 더 많이 포함하고 있어 좀 더 검은 색을 나타내어, 공기 중으로 미세먼지가 더 많이 방출된다. 또한, 오염원에서 직접 대기로 방출되는 1차 미세먼지는 대기 중의 산소나수증기 등과 반응하여 좀 더 다양한 2차 미세먼지가 자동차의필터에는 더 축적될 것으로 생각한다. 현재의 연구에서도 각미세먼지를 포집한 후 실내의 집 미세먼지보다 실외의 차 미세먼지의 색이 더 검은색을 띠고 있었다.
이 연구에서 미세먼지가 세포에 미치는 독성 효과를 조사하였지만, 미세먼지가 세포 내로 유입되는지는 정확히 확인할수는 없었고, 미세먼지의 발생원에 따라 그 독성을 나타내는물질의 성분을 분석하지는 못하였다. 이에 후속 연구를 통해좀 더 밝혀보는 것도 좋을 것이라고 생각된다.
이 연구에서도 미세먼지에 노출된 여러 세포는 COX-2 및 IL-6의 발현이 증가하는 것으로 조사되었다. 이에 신체의 여러 조직에 미세먼지에 계속해서 노출되어지면이런 염증 관련 유전자의 발현이 급증하면서 염증반응이 일어나고 폐, 심장, 뇌 등을 구성하는 여러 세포와 조직에서 병리현상을 유발할 것으로 생각된다.
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