The purpose of this study was to investigate the melanogenesis inhibiting activity of the ethanol extract from Polygonum amphibium L. Firstly, the n-hexane (Hx), chloroform ($CHCl_3$), ethyl acetate (EA), n-butanol (BuOH), and water (Water) fractions were isolated from the P. amphibium L....
The purpose of this study was to investigate the melanogenesis inhibiting activity of the ethanol extract from Polygonum amphibium L. Firstly, the n-hexane (Hx), chloroform ($CHCl_3$), ethyl acetate (EA), n-butanol (BuOH), and water (Water) fractions were isolated from the P. amphibium L. ethanol extract. The efficacy of melanogenesis was found to significantly decrease via the EA and BuOH fractions when compared to the control in B16F10 cells. EA particularly showed the lowest melanin content in B16F10 cells when compared to all the other extracts. Concentration-dependent inhibition of melanin synthesis was also observed in the EA fraction at concentrations below $50{\mu}g/ml$, which did not exhibit cytotoxicity in B16F10 cells. Notably, the expression of three key proteins (tyrosinase, tyrosinase-related protein-1 (TRP-1), and TRP-2), which are involved in melanogenesis, were significantly decreased via the EA fraction. EA also inhibited body pigmentation in vivo in a zebrafish model. Overall, we demonstrated melanogenesis suppression using the EA fraction from P. amphibium L., which could be a potential candidate for an antimelanogenesis agent.
The purpose of this study was to investigate the melanogenesis inhibiting activity of the ethanol extract from Polygonum amphibium L. Firstly, the n-hexane (Hx), chloroform ($CHCl_3$), ethyl acetate (EA), n-butanol (BuOH), and water (Water) fractions were isolated from the P. amphibium L. ethanol extract. The efficacy of melanogenesis was found to significantly decrease via the EA and BuOH fractions when compared to the control in B16F10 cells. EA particularly showed the lowest melanin content in B16F10 cells when compared to all the other extracts. Concentration-dependent inhibition of melanin synthesis was also observed in the EA fraction at concentrations below $50{\mu}g/ml$, which did not exhibit cytotoxicity in B16F10 cells. Notably, the expression of three key proteins (tyrosinase, tyrosinase-related protein-1 (TRP-1), and TRP-2), which are involved in melanogenesis, were significantly decreased via the EA fraction. EA also inhibited body pigmentation in vivo in a zebrafish model. Overall, we demonstrated melanogenesis suppression using the EA fraction from P. amphibium L., which could be a potential candidate for an antimelanogenesis agent.
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문제 정의
따라서 본 연구를 통해서 미백에 대한 연구가 전무한 물여뀌 에탄올 추출물의 미백 활성을 B16F10 흑색종 세포와 제브라피쉬 embryo 모델을 이용하여 살펴보고자 한다.
제안 방법
멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다[9]. B16F10 세포 1 × 105개를 24-well plate의 각 well에 분주한 후 200 nM의 α-MSH를 첨가하여 하룻밤 배양하여 실험에 사용하였다.
물여뀌 전초 523 g을 에탄올로 추출하여 60.12 g의 에탄올 추출물의 회수하였다. 회수한 물여뀌 에탄올 추출물을 B16F10 세포를 이용하여 멜라닌 합성 저해능을 실험한 결과, 50 μg/ml의 농도에서 16.
제브라피쉬의 멜라닌 저해실험은 Choi 등의 방법을 변형하여 사용하였다[12]. 성숙 제브라피쉬 암수를 알 채취 전날 알 채취용 수조에 넣고 다음날 광주기 시기 1−2h 이후에 알을 채취하였다.
대상 데이터
물여뀌 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과를 살펴보기 위해 B16F10 세포와 제브라피쉬 embryo를 이용하였다. 그 결과, B16F10 세포의 멜라닌 합성이 저해되며 하위 분획 중 에틸 아세테이트 분획이 가장 높은 미백 효과를 나타내었다.
미백 활성 실험에 널리 이용되는 B16F10 mouse melanoma 세포 배양은 37℃, 5% CO2의 조건인 CO2 배양기(Thermofisher, USA)에서 배양되었다. 사용된 배지는 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.
데이터처리
본 연구의 모든 결과는 3회 반복 실험에 대한 평균(mean) ± 표준오차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 통계 분석은 Student’s t-test를 실시하여 관찰하였다.
이론/모형
Western blot 방법을 이용하여 melanin 합성에 작용하는 단백질(tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1),TRP-2 등)의 발현을 분석하였다. 상기의 B16F10 세포를 배양하여 25, 50 μg/ml 농도의 EA 분획을 72h 처리한 후, 상기 세포를 단백질분해효소 저해제(protease inhibitor cocktail, Sigma, USA)를 첨가한 RIPA 완충용액(10 mM Tris-HCl (pH 7.
또한 EA 분획의 멜라닌 합성 저해 기전을 알아보기 위하여 멜라닌 합성에 관련한 주요 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2에 대한 단백질 발현 정도를 western blot을 이용하여 확인하였다(Fig. 4).
성능/효과
각 분획 중 가장 높은 멜라닌 합성 저해능은 Fig. 2B에서와 같이 에틸 아세테이트 분획이 대조군 대비 통계적으로 유의미하게 감소하여 32.6%로 가장 높은 효과를 보였다.
Fig. 3B에서와 같이 농도 의존적으로 B16F10 세포내의 멜라닌 함량이 감소되는 경향을 보였으며, 이전 실험과 동일하게 50 μg/ml의 농도에서 대조군 대비 32.6% 감소되는 것을 확인하였다.
4% 저해됨을 확인하였다. EA 분획 50 μg/ml을 처리했을 때 요크(yolk) 부분의 색소 침착이 저해될 뿐만 아니라 EA 분획 처리 농도가 증가됨으로써 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였고 EA 분획 25 μg/ml 처리군에서는 대조군 대비 유의미한 저해를 보이지 않았지만 EA 분획 50 μg/ml 처리군에서는 통계적으로 유의미하게 대조군에 비해 저해됨(13.1%)을 확인하였다(Fig. 5B).
물여뀌 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 저해 효과를 살펴보기 위해 B16F10 세포와 제브라피쉬 embryo를 이용하였다. 그 결과, B16F10 세포의 멜라닌 합성이 저해되며 하위 분획 중 에틸 아세테이트 분획이 가장 높은 미백 효과를 나타내었다. 또한 제브라피쉬 embryo의 멜라닌 합성이 높게 저해됨을 확인하였다.
4). 그 결과, tyrosinase 단백질이 확연히 농도 의존적으로 감소되고 TRP-1, -2 단백질 발현은 tyrosinase 단백질에 비해 약하게 감소됨을 확인하였다. 따라서 tyrosinase 단백질이 주요기전으로 작용하여 EA 분획에 의해 저해됨으로써 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
그 결과, tyrosinase 단백질이 확연히 농도 의존적으로 감소되고 TRP-1, -2 단백질 발현은 tyrosinase 단백질에 비해 약하게 감소됨을 확인하였다. 따라서 tyrosinase 단백질이 주요기전으로 작용하여 EA 분획에 의해 저해됨으로써 멜라닌 합성 저해 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
5A와 같다. 양성대조군으로 이미 알려진 미백인 PTU(phenylthiourea )를 사용하였으며, PTU (50 μg/ml을)를 처리하였을 때 대조군 대비 70.4% 저해됨을 확인하였다. EA 분획 50 μg/ml을 처리했을 때 요크(yolk) 부분의 색소 침착이 저해될 뿐만 아니라 EA 분획 처리 농도가 증가됨으로써 멜라닌 합성이 저해됨을 확인하였고 EA 분획 25 μg/ml 처리군에서는 대조군 대비 유의미한 저해를 보이지 않았지만 EA 분획 50 μg/ml 처리군에서는 통계적으로 유의미하게 대조군에 비해 저해됨(13.
12 g의 에탄올 추출물의 회수하였다. 회수한 물여뀌 에탄올 추출물을 B16F10 세포를 이용하여 멜라닌 합성 저해능을 실험한 결과, 50 μg/ml의 농도에서 16.4% 저해하였다(Fig. 2A).
후속연구
제브라피쉬는 한 번에 다수(100−200개)의 알을 낳으며 발생이 빨라 실험 결과를 빠르게 도출할 수 있고, 세포실험에서 알 수 없는 여러 가지 결과를 알 수 있는 장점이 있다. 또한 동물실험을 통한 동물윤리 문제로 인해 하등동물 또는 세포 실험으로 대체하려 하나 생리활성의 복잡한 메커니즘으로 인해 연구에 한계가 있다[17]. 이와 같은 이유로 제브라피쉬는 새로운 동물모델로 각광을 받고 있다[18].
또한 제브라피쉬 embryo의 멜라닌 합성이 높게 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 에틸 아세테이트 분획의 활성단일물질 규명과 기전연구가 이루어져야 될 것이며 이를 바탕으로 이제껏 연구되지 않았던 담수 수변식물인 물여뀌 추출물이 미백 화장품 천연 소재로서의 활용 가능성이 높을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
물여뀌는 어디서 자라나?
)는 마디풀속 여뀌절에 속하는 식물로써 육상 및 수중 환경 모두에 서식할 수 있는 분류군이다. 현재 북미, 동아시아, 유럽 등 북반구의 온대에서 아한대 지방에 주로 자라며, 남미, 멕시코 및 남아프리카 등지에도 일부 유입되어 자라고 있는 것으로 알려져 있다[1]. 이러한 물여뀌에 대한 생리활성 연구는 많이 이루어져 있지 않으며, 림프구 활성화, 항암 및 항산화 효과에 대한 보고가 있을 뿐이다[2−4].
과생성된 멜라닌은 어떤 문제를 야기하는가?
이러한 미백 효과는 멜라닌의 합성 제어와 밀접한 관계가 있다. 멜라닌은 ultraviolet (UV)와 같은 고에너지 광원으로부터 피부를 보호하기 위해 멜라닌을 합성하지만 과생성시에는 기미 주근깨, 주름과 같은 피부질환을 야기한다[5, 6]. 이러한 멜라닌의 과생성을 억제하고 피부에 침착되는 멜라닌을 제어하는 물질을 찾는 연구가 최근 활발하며 현재 화장품과 같은 산업적으로 이용되는 멜라닌 저해제로 대표적인 물질은 arbutin과 kojic acid 등이 있다[7].
물여뀌는 무엇인가?
물여뀌(Polygonum amphibium L.)는 마디풀속 여뀌절에 속하는 식물로써 육상 및 수중 환경 모두에 서식할 수 있는 분류군이다. 현재 북미, 동아시아, 유럽 등 북반구의 온대에서 아한대 지방에 주로 자라며, 남미, 멕시코 및 남아프리카 등지에도 일부 유입되어 자라고 있는 것으로 알려져 있다[1].
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