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문제 정의
- 그러나 아직까지 유산균주를 이용하여 생물 전환 공정을 적용한 연교 추출물의 화장품 소재로서의 가능성에 대한 구체적인 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 연교의 열수 추출물, 유산균주를 이용하여 생물전환 공정을 적용한 추출물 및 에탄올 추출물을 대상으로 항산화 활성, 멜라닌 생성 억제능 및 항염증의 효능을 비교하였으며, 유산균주를 이용한 생물전환 연교추출물의 기능성 화장품 소재로서의 응용가치를 탐색하여, 천연물 신소재와 BT기술의 접목을 통한 산업적 응용 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 7 세포는 한국세포주은행에서 구입하였고 DMEM에 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomycin (100 IU/50 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. B16-F10 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌 생성 억제 실험을 수행하였고, RAW 264.7 세포를 이용하여 세포내 NO 생성을 측정하였다.
- NO 생성 저해능을 측정하기 위하여 세포 배양액내 NO 양 을 nitrite와 nitrate 형태로 측정하였다. RAW 264.
- 7 세포를 6 well plate에 1 × 106 cells/well로 분주하고 연교 추출물을 10, 30, 50, 70, 100 ㎍/㎖의 농도로 가한 후 LPS 1 ㎍/㎖을 첨가하여 세포를 자극하고 24시간 배양하였다. NO 생성량은 24시간 후 상등액을 모아 griess reagent 로 10분간 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Jeong et al., 2009).
- 3 ㎖ 를 혼합하여, 실온 에서 40분간 방치한 후 415 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하였다.
- RAW 264.7 세포를 6 well plate에 1 × 106 cells/well로 분주하고 연교 추출물을 10, 30, 50, 70, 100 ㎍/㎖의 농도로 가한 후 LPS 1 ㎍/㎖을 첨가하여 세포를 자극하고 24시간 배양하였다.
- 각 연교 추출물 0.2 ㎖ 에 3차 증류수 5 ㎖ 를 가한 후 Folin-Ciocalteau's phenol reagent 시약 0.5 ㎖를 혼합하여 실온에 3분간 방치한 후 2% Na2CO3 용액 1 ㎖ 를 혼합하고 다시 실온에 1시간 방치한 후 729 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로 caffeic acid를 이용한 표준곡선으로부터 환산하였다.
- 멜라닌 합성 과정에 핵심 역할을 하는 효소인 tyrosinase에 대한 다양한 연교 추출물의 멜라닌 생성 억제력을 알아보기 위하여 α-MSH 및 theophilline 처리군 에서 생성된 멜라닌 생성량 (100%)과 비교하였다.
- 1 를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며 SOD 유사활성은 시료첨가 및 무 첨가군 간의 흡광도 차이를 백분율로 환산하였다.
- 배양 후 혈청 5%와 α-MSH 10 nM, theophilline 2 mM 이 포함된 배지로 교체하였으며, 이때 각 연교 추출물들을 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다.
- 본 연구에서는 3가지의 다른 방법으로 연교를 추출하여 항산화 활성, 미백 및 항염 효과를 조사하였다. 그 결과 유산균 주를 이용하여 생물공정을 적용한 추출물들이 높은 항산화 활성을 가지며, 미백 및 항염증의 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
- 분비된 멜라닌의 양은 흡광도 490 ㎚에서 측정하였고, 멜라닌 생성량을 α-MSH 무처리군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
- 연교 300 g을 10배 부피의 70% 에탄올을 이용하여 상온에서 3일간 추출하고 증발 농축한 후 동결 건조시켜 추출물을 얻었다 (Sample 3).
- 연교 추출물의 DPPH 프리 라디컬에 대한 소거활성을 측정 하여 항산화력을 살펴보았다 (Geun et al., 2010). 에탄올에녹인 100 µM DPPH 용액 180 ㎕ 와 연교 추출물을 각각 20 ㎕ 씩 96 well plate에 첨가하고 37℃에서 20분간 반응시켰다.
- 연교 추출물의 멜라닌 생성 억제능을 측정하기 위하여 B16-F10 세포를 96 well plate에 1 × 104cells/well의 농도로 분주하고, 세포가 바닥에 부착할 수 있도록 24시간 동안 배양하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 AOAC의 Folin-Denis 방법을 수정하여 Folin-Ciocalteau's phenol reagent가 추출물의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 정량하였다 (Gutfinger, 1981).
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 연교 (Forsythiae Fructus, 連翹)는 경북의 성에서 재배하고 있는 국내산을 구입하여 이물질을 제거하고 사용하였다 .
- 생물전환 공정에 사용된 시험균주로는 유산균인 Lactobacillus plantarum (LP2, KCTC 3108), Lactobacillus acidophillus (LA, KCTC 3164), Lactobacillus casei (LC, KCTC 3109), Lactobacillus lactis (LL, KCTC 3769), Leuconostoc mesenteroides (LM, KCTC 3100), Bifidobacterium longum (BL, KCTC 3128)이 이용되었으며 한국세포주은행 (KCTC)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 B16-F10 melanoma와 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하였고 DMEM에 10% fetal bovine serum과 penicillin/streptomycin (100 IU/50 ㎍/㎖)을 첨가하여 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 배양하였다. B16-F10 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌 생성 억제 실험을 수행하였고, RAW 264.
- 실험에 사용한 시약은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), BHT (butylatedhydroxy toluene), DNS (3,5-dinitrosalocylic acid), glucose, caffeic acid, quercetin, arbutin, pyrogallol, griess reagent, tris-HCl buffer (tris [hydroxymethyl] amino-methane+EDTA), LPS (lipopolysaccharide) aluminium nitrate, potassium acetate, sodium phosphate buffer, DMEM (Dulbecco‘s modified Eagle’s medium), α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone), LDOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin), fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, formaldehyde, theophilline, PBS (phosphate buffered saline solution) 등은 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 외의 기타 시약은 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 microplate reader (Synergy-HT, Bio-TEK Instruments, USA), CO2 incubator (MCO 175, Sanyo Electric Co., Japan), pH meter (Orion, 520A, USA), 냉동건조기 등을 사용하여 측정하였다.
- 실험에 사용한 시약은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), BHT (butylatedhydroxy toluene), DNS (3,5-dinitrosalocylic acid), glucose, caffeic acid, quercetin, arbutin, pyrogallol, griess reagent, tris-HCl buffer (tris [hydroxymethyl] amino-methane+EDTA), LPS (lipopolysaccharide) aluminium nitrate, potassium acetate, sodium phosphate buffer, DMEM (Dulbecco‘s modified Eagle’s medium), α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone), LDOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin), fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, formaldehyde, theophilline, PBS (phosphate buffered saline solution) 등은 Sigma (USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 외의 기타 시약은 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
- Sample 1: hot water extract, LA: Lactobacillus acidophillus, LL: Lactobacillus lactis, LM: Leuconostoc mesenteroides, BL: Bifidobacterium longum, sample 3: 70% ethanol extract Statistical analysis of data was performed using Student’s t-test.
- Statistical analysis of data was performed using Student’s t-test.
이론/모형
- SOD 유사 활성은 Marklund와 Marklund의 방법 (Marklund and Marklund, 1974)에 따라 과산화수소 (H2O2)로 전환반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 검정하였다. 연교 추출물 0.
- 5 ㎖를 혼합하여 실온에 3분간 방치한 후 2% Na2CO3 용액 1 ㎖ 를 혼합하고 다시 실온에 1시간 방치한 후 729 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로 caffeic acid를 이용한 표준곡선으로부터 환산하였다. 총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법 (Moreno et al., 2000)을 이용하여 측정하였으며, 추출물 0.5 ㎖ 에 10% aluminium nirate 0.1 ㎖ 와 1 M potassium acetate 0.1 ㎖ 및 ethanol 4.3 ㎖ 를 혼합하여, 실온 에서 40분간 방치한 후 415 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin을 표준물질로 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하였다.
성능/효과
- 이는 유산균주를 이용한 생물전환 과정 중 다양한 생리활성 성분이 증가되는 것으로 사료되며, 본 연구에서도 유산균주를 이용하여 생물전환 공정을 적용한 추출물들에서 총 폴리페놀 및플라보노이드 함량이 증가됨을 확인할 수 있었다. SOD 유사 활성 측정에서는 유산균주를 이용한 생물전환군인 Sample 2-LC와 2-LL이 각각 57%, 60%를 나타내어 다른 추출물에 비해서 높은 활성을 나타내었다.
- 본 연구에서는 3가지의 다른 방법으로 연교를 추출하여 항산화 활성, 미백 및 항염 효과를 조사하였다. 그 결과 유산균 주를 이용하여 생물공정을 적용한 추출물들이 높은 항산화 활성을 가지며, 미백 및 항염증의 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. Hatano 등(1989)은 천연물에 존재하는 배당체는 비배당체와 당의 결합으로 이루어져 있으며, 이러한 배당체는 다양한 호르몬, 알칼로이드, 플라보노이드 등의 구조를 이루며 생물전환 효소에 의하여 당이 가수분해 될 수 있다고 보고하였으며, Kim (2009b)은 체내 흡수가 어려운 인삼의 사포닌 성분 중 ginsenoside Rb1을 유산균주를 이용한 생물전환을 통해서 인체 내 흡수율을 높여서, 높은 항산화 활성 및 면역반응에 중요한 역할을 한다고 보고한 바 있다.
- Hatano 등(1989)은 천연물에 존재하는 배당체는 비배당체와 당의 결합으로 이루어져 있으며, 이러한 배당체는 다양한 호르몬, 알칼로이드, 플라보노이드 등의 구조를 이루며 생물전환 효소에 의하여 당이 가수분해 될 수 있다고 보고하였으며, Kim (2009b)은 체내 흡수가 어려운 인삼의 사포닌 성분 중 ginsenoside Rb1을 유산균주를 이용한 생물전환을 통해서 인체 내 흡수율을 높여서, 높은 항산화 활성 및 면역반응에 중요한 역할을 한다고 보고한 바 있다. 그러므로 본 연구에서도 유산균주를 이용하여 생물전환공정을 적용한 추출물 들이 단순 추출법을 이용한 열수 추출물과 비교하여 높은 항산화활성, 미백 및 항염증의 효과를 보인 것은 생물전환에 의한 영향이라고 사료된다. 따라서 생물전환공정을 적용한 연교 추출물은 항산화 활성 및 피부 흡수율의 증진을 통해서 미백 및 항염증의 피부 개선효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
- 에탄올 추출물인 Sample 3은 100 ㎍/㎖에서 50% 이상의 NO 생성 감소율을 나타내었다. 그러므로 생물전환공정을 이용한 모든 연교추출 물들과 에탄올 추출물이 열수 추출물군에 비해 NO 생성 억제력을 가지고 있음을 확인하였으며, 염증 유발 물질에 대해 효과적인 항염증의 효능을 가지는 것으로 판단된다.
- 이는 Moon 등 (2007)의 선행 연구와도 일치하는 결과로서 꿀풀 추출물의 열수 추출물 항산화 활성 실험에서 꿀풀 추출물 자체의 전자 공여능은 낮았으나 꿀풀 추출물에 유산균을 첨가하여 실험한 결과에서 높은 전자 공여능의 차이를 나타내었다고 보고하였다. 그러므로 이와 같은 결과를 통해서 생물전환공정을 이용한 추출물들 (Sample 2-LL과 2-LA)이 열수 추출물보다 SOD유사활성 및 DPPH 프리 라디컬 소거능의 활성이 더 높음을 확인하였으며, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에서도 높은 함량을 나타냄을 검증하였다. 따라서 항산화 활성이 높은 유산균의 탐색과 생산은 산업적 적용이 아주 유효할 것으로 사료된다.
- 또한 LPS 처리군과 비교시 30 ㎍/㎖ 이상에서 NO 생성지수의 통계적인 유의한 차이가 있음을 확인하였다 (P < 0.05).
- 7 세포에서 조직내 염증반응을 촉진시킨다 (Boje and Arora, 1992). 본연구에서는 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7세포를 LPS 로 활성화시킴과 동시에 RAW 264.7 세포의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 연교 추출물을 농도별 10, 30, 50, 70, 100 ㎍/㎖로 세포에 처리한 결과 생물전환공정을 적용한 추출물 Sample 2-LL과 Sample 2-BL이 농도 100 ㎍/㎖에서 각각 70%와 50%의 감소율을 나타내어 LPS로 인한 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시켰다 (Fig 2). 또한 LPS 처리군과 비교시 30 ㎍/㎖ 이상에서 NO 생성지수의 통계적인 유의한 차이가 있음을 확인하였다 (P < 0.
- 시료 1 ㎖ 당 총 플라보노이드의 함량은 Sample 2–LA가 0.078 ㎎/㎖로써 다른 추출물과 비교하여 가장 높은 함량을 보였으며, 에탄올 추출물인 Sample 3은 0.071 ㎎/㎖로써 두 번째로 높았다.
- , 2011). 연교 추출물들의 항산화 활성 측정 결과 (Table 1), 시료 1 ㎖ 당 총 폴리페놀 함량은 열수 및 에탄올 추출물에 비해 유산균 주를 이용한 생물전환공정을 이용한 대부분의 추출물들에서 높은 함량을 보였다. 특히 Sample 2-LL이 총 폴리페놀 함량 11.
- Park (2010)은 유산균을 이용한 홍삼의 총 폴리페놀 함량이 증가하여 높은 항산화 활성을 갖는다고 보고하였으며, Kim (2009a)은 김치에서 분리해낸 유산균 (Lactobacillus acillus plantarum P23)을 이용한 스피루리나 연구에서, 균주가 생산하는 각종 효소 등에 의한 영양성분의 증가로 다양한 peptide와 amino acid를 생성하여, 피부의 항산화 효과가 있음을 보고하였다. 이는 유산균주를 이용한 생물전환 과정 중 다양한 생리활성 성분이 증가되는 것으로 사료되며, 본 연구에서도 유산균주를 이용하여 생물전환 공정을 적용한 추출물들에서 총 폴리페놀 및플라보노이드 함량이 증가됨을 확인할 수 있었다. SOD 유사 활성 측정에서는 유산균주를 이용한 생물전환군인 Sample 2-LC와 2-LL이 각각 57%, 60%를 나타내어 다른 추출물에 비해서 높은 활성을 나타내었다.
- DPPH는 자체적으로 비교적 안정된 프리 라디컬을 가지는 화합물로서 항산화 물질에 환원되어 항산화력을 검증하는데 널리 사용되는 물질이다. 이러한 DPPH를 이용한 프리 라디컬 소거능 측정 결과, 유산균주를 이용한 생물전환공정을 적용한 Sample 2-LL이 190%로 가장 높은 프리라디컬 소거능을 보였으며, 에탄올 추출물 또한 180%의 DPPH 라디컬 소거능을 보여 열수 추출물과 비교해서 비교적 높은 항산화 활성을 보였다. 이는 Moon 등 (2007)의 선행 연구와도 일치하는 결과로서 꿀풀 추출물의 열수 추출물 항산화 활성 실험에서 꿀풀 추출물 자체의 전자 공여능은 낮았으나 꿀풀 추출물에 유산균을 첨가하여 실험한 결과에서 높은 전자 공여능의 차이를 나타내었다고 보고하였다.
- 멜라닌 합성 과정에 핵심 역할을 하는 효소인 tyrosinase에 대한 다양한 연교 추출물의 멜라닌 생성 억제력을 알아보기 위하여 α-MSH 및 theophilline 처리군 에서 생성된 멜라닌 생성량 (100%)과 비교하였다. 측정 결과 모든 연교 추출물에서 멜라닌 생성 저해 효과를 확인 할 수 있었다 (Fig 1). 특히 생물전환군인 Sample 2-LL은 농도별 25, 50, 100 ㎍/㎖에서 각각 63%, 56%, 55%로 다른 추출물에 비해서 농도 의존적인 멜라닌 생성 지수의 감소를 확인할 수 있었으며, 총 폴리페놀함량 및 플라보노이드 함량, SOD 유사활성 과 DPPH 프리 라디컬 소거능의 항산화 실험의 긍정적인 결과들이 추출물들의 멜라닌 생성 억제력에도 영향을 미친 것으로 판단된다.
- 측정 결과 모든 연교 추출물에서 멜라닌 생성 저해 효과를 확인 할 수 있었다 (Fig 1). 특히 생물전환군인 Sample 2-LL은 농도별 25, 50, 100 ㎍/㎖에서 각각 63%, 56%, 55%로 다른 추출물에 비해서 농도 의존적인 멜라닌 생성 지수의 감소를 확인할 수 있었으며, 총 폴리페놀함량 및 플라보노이드 함량, SOD 유사활성 과 DPPH 프리 라디컬 소거능의 항산화 실험의 긍정적인 결과들이 추출물들의 멜라닌 생성 억제력에도 영향을 미친 것으로 판단된다. 따라서 높은 항산화 활성을 나타내었던 생물전환공정을 적용한 연교 추출물이 차후 다른 추출물에 비해서 미백소재로서의 높은 효능을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 특히 생물전환군인 Sample 2-LL은 농도별 25, 50, 100 ㎍/㎖에서 각각 63%, 56%, 55%로 다른 추출물에 비해서 농도 의존적인 멜라닌 생성 지수의 감소를 확인할 수 있었으며, 총 폴리페놀함량 및 플라보노이드 함량, SOD 유사활성 과 DPPH 프리 라디컬 소거능의 항산화 실험의 긍정적인 결과들이 추출물들의 멜라닌 생성 억제력에도 영향을 미친 것으로 판단된다. 따라서 높은 항산화 활성을 나타내었던 생물전환공정을 적용한 연교 추출물이 차후 다른 추출물에 비해서 미백소재로서의 높은 효능을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 그러므로 본 연구에서도 유산균주를 이용하여 생물전환공정을 적용한 추출물 들이 단순 추출법을 이용한 열수 추출물과 비교하여 높은 항산화활성, 미백 및 항염증의 효과를 보인 것은 생물전환에 의한 영향이라고 사료된다. 따라서 생물전환공정을 적용한 연교 추출물은 항산화 활성 및 피부 흡수율의 증진을 통해서 미백 및 항염증의 피부 개선효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 기능성 화장품 소재에서 우수한 천연약용작물로서의 응용가치가 있을 것으로 생각되며, 생물전환 화장품에 대한 연구가 더욱더 다각적 측면에서 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 생물전환공정을 적용한 연교 추출물은 항산화 활성 및 피부 흡수율의 증진을 통해서 미백 및 항염증의 피부 개선효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 기능성 화장품 소재에서 우수한 천연약용작물로서의 응용가치가 있을 것으로 생각되며, 생물전환 화장품에 대한 연구가 더욱더 다각적 측면에서 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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