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문제 정의
- 본 연구는 꿀벌에 대한 Vip3Aa 단백질의 위해성을 확인하기 위해 Vip3Aa 유전자가 삽입된 단백질 과발현 유전자를 제작하여 Vip3Aa 단백질이 발현되는 최적의 조건을 확립하였으며, 대량으로 순수분리 할 수 있는 방법을 개발하였다. 또한 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌의 급성섭식독성평가를 수행하여 Vip3Aa 단백질이 꿀벌에 미치는 위해성을 확인하였다.
- 본 연구에서 우리는 꿀벌에 대한 살충성 Vip3Aa 단백질의 위해성평가 방법을 마련하기 위해 Vip3Aa 단백질의 특성을 고려하여 대량으로 순수 분리할 수 있는 기법을 마련하였다. Vip3Aa 단백질을 대량으로 분리하기 위해 과발현용 pET28a 벡터를 이용하였고(Fig.
제안 방법
- 대장균 파쇄 후 상층액 부분을 취하여 전체 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동 하였다. Gel상에서 확인된 His-Vip3Aa 단백질 밴드의 정확성을 확인하기 위해 anti-his(His-Tag(27E8) Mouse, Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 western blot 실험을 수행하였다.
- Vip3Aa 단백질 노출 당일은 1, 4시간 동안 관찰하고 그 후에는 24, 48시간 동안 관찰하여 더듬이, 날개, 다리 등 직임이 없는 꿀벌 개체를 치사개체로 판단하였다. 그리고 기능장애, 운동실조, 혼수, 빈사, 과민반응 등의 증상을 보이는 개체는 일반중독증상으로 판단하여 수치화 하였다(Lim et al.
- Vip3Aa 단백질을 대량으로 분리하기 위해 4L의 LB 배지에 His-Vip3Aa-pET28a 유전자가 도입된 대장균을 접종하였다. 세포 배양액의 흡광도(600mm)가 0.
- Vip3Aa 단백질의 최적의 발현조건을 확인하기 위해 HisVip3Aa-pET28a 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 배양하는 과정에서 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG, Phytotechlab, USA) 0.1~1mM 농도로 첨가했다.
- 꿀벌 10마리가 수용된 시험용기에 Vip3Aa 단백질(1,000μg/2mL)을 0.2mL씩 투입하여 2~3시간 동안 섭식을 완료한 후 치사율 및 일반중독증상 확인으로 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌 위해성 여부를 평가하였다(Fig. 2).
- 0), Vip3Aa 단백질(1,000 μg) 350 μL와 50% 설탕용액 1,650 μL 혼합하여 각각의 stock solution을 조제하였다. 꿀벌이 10마리씩 수용된 시험 용기 입구 스펀지에 유리 급식관을 넣고 조제한 시험 물질 0.2 mL 투입하여 꿀벌들이 섭식하도록 하였다. 각각의 시험물질의 노출 후 2~3시간 경과 시 시험물질의 섭식을 완료 한 후 50% 설탕용액을 급이 하였다.
- 1~1mM 농도로 첨가했다. 대장균 파쇄 후 상층액 부분을 취하여 전체 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동 하였다. Gel상에서 확인된 His-Vip3Aa 단백질 밴드의 정확성을 확인하기 위해 anti-his(His-Tag(27E8) Mouse, Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 western blot 실험을 수행하였다.
- 본 연구는 꿀벌에 대한 Vip3Aa 단백질의 위해성을 확인하기 위해 Vip3Aa 유전자가 삽입된 단백질 과발현 유전자를 제작하여 Vip3Aa 단백질이 발현되는 최적의 조건을 확립하였으며, 대량으로 순수분리 할 수 있는 방법을 개발하였다. 또한 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌의 급성섭식독성평가를 수행하여 Vip3Aa 단백질이 꿀벌에 미치는 위해성을 확인하였다.
- 1d). 또한, 우리는 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질과 순수분리한 Vip3Aa 단백질의 동등성을 확인하기 위해 MALDI-TOF 분석을 수행하였고, PMF (Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 mass 값이 측정된 peptide들을 MASCOT software를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다. 그 결과 Vip3Aa 단백질이 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질의 아미노산 서열과 일치함을 알 수 있었다(Fig.
- 본 연구는 LMO 유전산물의 위해성평가를 위해 바실러스로부터 증폭된 Vip3Aa 유전자를 이용하여 대장균에서 단백질 순수분리 하였으며, MALDI-TOP 분석법을 통해 기존의 알려진 살충성 Vip3Aa 단백질과 동등한 단백질임을 증명하였다. 순수 분리한 Vip3Aa 단백질을 이용하여 꿀벌과독성 급성섭식독성평가를 수행하였다. 그 결과 무처리군, Hepes buffer, Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사 및 일반 중독증상을 보이는 개체는 발견되지 않았다.
- 꿀벌(Apis mellifera)을 이용한 Vip3Aa 단백질 위해성평가 실험을 하기 위해 경상북도 소재지 경농 중앙연구소 실외에서 약 4개월간 사육, 순화한 꿀벌을 사용하였다. 시험물질 투여 당일 오전 10시, 시험 대상종 꿀벌을 사육 통으로부터 채집 후 CO2 gas 이용 2분간 마취하고 시험용기당 10마리씩 수용하였다. 시험에 사용된 시료는 무처리(증류수), Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Bioshop, Canada) buffer (control, pH 8.
대상 데이터
- 꿀벌(Apis mellifera)을 이용한 Vip3Aa 단백질 위해성평가 실험을 하기 위해 경상북도 소재지 경농 중앙연구소 실외에서 약 4개월간 사육, 순화한 꿀벌을 사용하였다. 시험물질 투여 당일 오전 10시, 시험 대상종 꿀벌을 사육 통으로부터 채집 후 CO2 gas 이용 2분간 마취하고 시험용기당 10마리씩 수용하였다.
- 수거된 상층액에서 Vip3Aa 단백질을 순수분리하기 위해 Ni-NTA bead (NTA Agarose (25mL), Qiagen, USA)를 사용했다. 비특이적 결합 단백질을 제거는 10 mM imidazole(1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene, Glyoxaline, Merck, Germany)를 사용하였고, Vip3Aa 단백질의 용출은 50 mM imidazole을 사용하였다. 용출된 Vip3Aa 단백질 fraction들의 분자량 및 순도는 전기영동 gel상에서 확인하였으며, 순도가 높은 Vip3Aa 단백질 fraction들을 모아 fast protein liquid chromatography (FPLC; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 수행하여 Vip3Aa 단백질의 순도를 증가시켰다(Bergamasco et al.
- 45 µm nitro membrane filter system(Corning Syringe Filters, Merck, Germany)으로 여과시켜 수거했다. 수거된 상층액에서 Vip3Aa 단백질을 순수분리하기 위해 Ni-NTA bead (NTA Agarose (25mL), Qiagen, USA)를 사용했다. 비특이적 결합 단백질을 제거는 10 mM imidazole(1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene, Glyoxaline, Merck, Germany)를 사용하였고, Vip3Aa 단백질의 용출은 50 mM imidazole을 사용하였다.
- 시험에 사용된 시료는 무처리(증류수), Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Bioshop, Canada) buffer (control, pH 8.0), Vip3Aa 단백질(1,000 μg) 350 μL와 50% 설탕용액 1,650 μL 혼합하여 각각의 stock solution을 조제하였다.
- 실험에 사용된 Bt HD-1 Cell line은 충남대학교 농업생명과학대학 응용생물학과 생물학적 방제연구실로부터 확보하였다. 클로닝에 사용된 벡터는 pET28a이며, PCR 반응은 정방향 BamHI primer (5ʹ-GGATCC-ATGAACAAGAATAATACTAAATTAAGCAC-3ʹ)와 역방향 XhoI primer (5ʹ-CTC GAG-TTACTTAATAGAGACATCGTAAAAATGTACA-3ʹ)를 사용하였다(Bergamasco et al.
성능/효과
- 본 연구에서 우리는 꿀벌에 대한 살충성 Vip3Aa 단백질의 위해성평가 방법을 마련하기 위해 Vip3Aa 단백질의 특성을 고려하여 대량으로 순수 분리할 수 있는 기법을 마련하였다. Vip3Aa 단백질을 대량으로 분리하기 위해 과발현용 pET28a 벡터를 이용하였고(Fig. 1a) (Bergamasco et al. 2013; Patricia et al. 2013), 0.3 mM IPTG가 첨가되었을 때 과발현이 최적으로 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 우리는 Vip3Aa 단백질을 분리하는 과정에서 Vip3Aa 단백질이 대장균에서 수용성 상태로 발현되고 있음을 확인하였고(Fig.
- 또한, 우리는 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질과 순수분리한 Vip3Aa 단백질의 동등성을 확인하기 위해 MALDI-TOF 분석을 수행하였고, PMF (Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 mass 값이 측정된 peptide들을 MASCOT software를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다. 그 결과 Vip3Aa 단백질이 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질의 아미노산 서열과 일치함을 알 수 있었다(Fig. 1e).
- 순수 분리한 Vip3Aa 단백질을 이용하여 꿀벌과독성 급성섭식독성평가를 수행하였다. 그 결과 무처리군, Hepes buffer, Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사 및 일반 중독증상을 보이는 개체는 발견되지 않았다. 이 결과를 통해 Vip3Aa 단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는다는 결론을 얻을 수 있었다.
- 2). 그 결과, 시험물질 처리 후 1~48시간 동안 관찰한 결과 무처리군, buffer 및 Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사개체는 발견되지 않았다(Table 1). 또한 세 개의 처리군 모두 일반중독증상 역시 관찰되지 않았다(Table 2).
- 3 mM IPTG가 첨가되었을 때 과발현이 최적으로 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 우리는 Vip3Aa 단백질을 분리하는 과정에서 Vip3Aa 단백질이 대장균에서 수용성 상태로 발현되고 있음을 확인하였고(Fig. 1b, c), 다른 단백질과는 다르게 특이적으로 저농도의 imidazole (50mM)에서 순수분리 되는 것을 확인할 수 있었다. 용출된 단백질 fraction은 전기영동 상에서 확인 후 순도가 높은 fraction만 선택하여 FPLC를 수행한 결과 Vip3Aa 단백질이 고분자 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 본 연구는 LMO 유전산물의 위해성평가를 위해 바실러스로부터 증폭된 Vip3Aa 유전자를 이용하여 대장균에서 단백질 순수분리 하였으며, MALDI-TOP 분석법을 통해 기존의 알려진 살충성 Vip3Aa 단백질과 동등한 단백질임을 증명하였다. 순수 분리한 Vip3Aa 단백질을 이용하여 꿀벌과독성 급성섭식독성평가를 수행하였다.
- 1b, c), 다른 단백질과는 다르게 특이적으로 저농도의 imidazole (50mM)에서 순수분리 되는 것을 확인할 수 있었다. 용출된 단백질 fraction은 전기영동 상에서 확인 후 순도가 높은 fraction만 선택하여 FPLC를 수행한 결과 Vip3Aa 단백질이 고분자 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1d). 또한, 우리는 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질과 순수분리한 Vip3Aa 단백질의 동등성을 확인하기 위해 MALDI-TOF 분석을 수행하였고, PMF (Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 mass 값이 측정된 peptide들을 MASCOT software를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다.
- 그 결과 무처리군, Hepes buffer, Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사 및 일반 중독증상을 보이는 개체는 발견되지 않았다. 이 결과를 통해 Vip3Aa 단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는다는 결론을 얻을 수 있었다. 본 연구 결과는 향후 국내 LMO유전자 산물 위해성평가에 유용하게 활용될 것이라 사료된다.
후속연구
- 이 결과를 통해 Vip3Aa 단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는다는 결론을 얻을 수 있었다. 본 연구 결과는 향후 국내 LMO유전자 산물 위해성평가에 유용하게 활용될 것이라 사료된다.
- 본 연구를 통해 개발된 Vip3Aa 단백질의 대량 순수분리방법 및 꿀벌에 대한 급성섭식독성평가 방법은 향후 LM작물에 도입된 유전자 발현산물이 국내 생물종에 미치는 위해성 평가를 LMO 환경위해성평가 Tier 1 system 단계에 적용시킬 수 있고 체계적인 위해성평가방법 개발을 위한 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.
- 이러한 결과들을 통해 Vip3Aa단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는 것으로 판단된다. 위 결과들은 향후 LM 작물 서식지에 존재하는 초식곤충, 토양미생물 등의 위해성평가에 활용할 수 있을 것이라 판단된다.
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