[논문]치담(治痰) 한약의 항알츠하이머 효능 비교 연구

곽채원; 최진규; 김정희; 오명숙

doi:10.6116/kjh.2019.34.4.9.

치담(治痰) 한약의 항알츠하이머 효능 비교 연구
Comparative study on anti-Alzheimer's effects of herbal medicines treating phlegm 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.34 no.4, 2019년, pp.9 - 18

곽채원 (경희대학교 일반대학원 나노의약생명과학과) , 최진규 (경희대학교 경희동서약학연구소) , 김정희 (경희대학교 일반대학원 나노의약생명과학과) , 오명숙 (경희대학교 일반대학원 나노의약생명과학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : It has been known to be correlated between phlegm and dementia from the perspective of oriental medicine, but it is unexplored whether herbal medicines to treat phlegm have pharmacological actions on Alzheimer's disease (AD). The aim of this study was to evaluate and to compare effects of herbal medicines to treat phlegm against AD in vitro. Methods : We selected 11 herbal medicines which treat phlegm and obtained each extract by boiling in 10-fold distilled water for 2 h. And we performed the assay of acetylcholinesterase (AChE) inhibitory effects of 11 herbal extracts. Next, we evaluated neuroprotective effects of them against amyloid $beta_{25-35}$ ($A{\beta}_{25-35}$) plaque-induced toxicity in HT22 mouse hippocampal neuronal cells using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. To investigate whether they show the anti-inflammatory effects against lipopolysaccharide (LPS), we also measured the levels of nitric oxide (NO) in BV2 microglia cells using griess reagent assay. Results : We found that Gamiyeongsin-hwan (GYH) and Cheonghunhwadam-tang (CHT) exhibited remarkable AChE inhibitory effects. In HT22 cells, Arisaematis Rhizoma, Trichosanthis Semen and Fritillariae Thunbergii Bulbus suppressed $A{\beta}_{25-35}$ plaque-induced neuronal cell death. In BV2 cells, Cheongung-hwan significantly inhibited the increase of NO contents induced by LPS and GYH and CHT showed a tendency to inhibit LPS-induced NO generation. Conclusions : These results suggest that several herbal medicines to treat phlegm showed the significant effects on AChE inhibition, neuroprotection against $A{\beta}_{25-35}$ plaque-induced toxicity, and inhibition of NO generation. Therefore, we demonstrate the possibility that herbal medicines with treating phlegm has effects against AD.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig.1 The process of selecting a candidate for treating Alzheimer's disease. We searched herbs to belong to "溫化寒痰藥" and "淸化熱痰藥 "category and herbal formulae to treat "痰". Except for herbs or herbal formulae of animals, minerals, shellfishes and seaweeds, 8 herbs and 3 herbal formulae were selected as candidates.
표 Table 1. The list of herbal extracts
표 Table 2. Yields of herbal extracts
그림 Fig 2. Effects of herbal extracts on cell death induced by Aβ_25-35 plaque in HT22 cells. HT22 cells were treated with herbal extracts for 3 h and incubated (A) without or (B) with Aβ_25-35 plaque (3 μmol/L) for a further 23 h. Cell viabilities were measured by MTT assay 26 h after sample treatment and are presented as percentage of control. Values are mean ± SEM. * p < 0.05, *** p < 0.001 vs. control group, ### p < 0.001 vs. Aβ_25-35 plaque- only group. PT; Pinelliae Tuber, AR; Arisaematis Rhizoma, GF; Gleditsiae Fructus, TS; Trichosanthis Semen, FT; Fritillariae Thunbergii Bulbus, FC; Fritillariae Cirrhosae Bulbus, BS; Benincasae Semen, CR; Cynanchi Stauntonii Rhizoma et Radix; GYH; Gamiyeongsin-hwan, CHT; Cheonghunhwadam-tang, CGH; Cheongung-hwan
표 Table 3. Inhibitory effects of herbal extracts on AChE activity
그림 Fig. 3. Inhibitory effects of herbal extracts on LPS-induced production of NO in BV2 cells. (A) The cells were treated with herbal extracts for 24 h. (B, C) The cells were treated with 100 ng/㎖ LPS for 23 h after pre-treatment with herbal extracts or quercetin (positive control, Q) for 1 h. NO generation was determined by the nitrite levels in the supernatant using the griess reagent. Cell viability was measured by MTT assay 24 h after sample treatment and are presented as percentage of control. Values are mean ± SEM. *** p < 0.001 vs. control group, ### p < 0.001 vs. LPS-only group. PT; Pinelliae Tuber, AR; Arisaematis Rhizoma, GF; Gleditsiae Fructus, TS; Trichosanthis Semen, FT; Fritillariae Thunbergii Bulbus, FC; Fritillariae Cirrhosae Bulbus, BS; Benincasae Semen, CR; Cynanchi Stauntonii Rhizoma et Radix; GYH; Gamiyeongsin-hwan, CHT; Cheonghunhwadam- tang, CGH; Cheongung-hwan
표 Table 4. Summary of evaluation of anti-Alzheimer’s effects of herbal medicines treating phlegm

AI 본문요약
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문제 정의

이처럼 다양한 질환에서 선행 연구가 진행되고 있지만 알츠하이머병에 대한 연구는 진행된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 총 11종의 治痰 약재 및 처방 추출물의 acetylcholinesterase (AChE) 억제 활성, nitric oxide (NO) 생성량, 세포 생존율 측정에서 유의미한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
NO는 ONOO-로 변화되어 과량 생성이 되면 산화적 스트레스를 일으켜 microglia 세포를 활성화하며^42,43), 이러한 microglia 세포의 과도한 활성화는 만성염증을 유발하여 신경퇴행성 뇌질환을 일으키는 주요 원인으로 작용한다⁴⁴⁾. 본 실험에서는 BV2 microglia 세포에서 LPS 독성에 대한 11종 한약재 추출물의 NO 생성 억제 효과를 평가하였다. 그 결과 GF와 CR에서 BV2 세포에 대한 독성을 보였으며, LPS 의해 세포 생존율이 약간 감소한 한약재 추출물 처리군도 있었으나 실험에는 영향을 미치지 않았다.
본 연구에서는 HT22 세포에서 Aβ25–35 plaque 독성에 대한 11종 추출물의 세포보효효과를 알아보기 위하여 세포생존율을 측정하였을 때, AR, TS, FT 처리군에서 Aβ25–35 plaque 단독 처리군 대비 세포 생존율이 유의하게 증가하는 것으로 보아 세포보호효과가 있음을 확인하였다.
본 연구에서는 治痰 효능 약재 8종 및 처방 3종에 대한 항알츠하이머 효능 평가를 수행하였고, 다음과 같은 결론을 얻었다.
본 연구에서는 治痰 효능이 알려져 있는 11종의 약재 또는 처방 추출물에 대한 AChE 억제 효과, 해마 신경세포보호효과, NO 생성 억제 효과를 알아보고자 하였다.

제안 방법

11종 추출물이 BV2 세포에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. BV2 세포에서 100 ㎍/㎖로 처리 후, 세포생존율을 확인하였을 때, GF와 CR에서 세포독성이 관찰됨을 확인하였다(Fig.
11종 추출물이 HT22 세포에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. HT22 세포에서 100 ㎍/㎖로 처리 후, 세포 생존율을 확인하였을 때, GF와 CR에서 세포독성이 관찰됨을 확인하였다 (Fig.
Aβ25–35 plaque으로 유도된 독성에 대한 세포생존율을 확인하기 위하여 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 3시간 전처리 한 후, 3 μmol/L의 Aβ25–35 plaque를 23시간 더 처리하였다.
AChE 저해 활성 측정은 Ellman법³¹⁾의 방법을 변형하여 colorimetric 방법으로 측정하였으며, acetylthiocholine iodide를 기질로 사용하였다. 620 ㎕의 0.
0×10⁴ cells/well로 분주하고 24시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 24시간 동안 처리하였다. LPS로 유도된 독성에 대한 세포생존율을 확인하기 위하여 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 1시간 전처리 한 후, 100 ng/㎖의 LPS를 23시간 더 처리하였다. 양성대조군은 Quercetin(10 μM)을 사용하였다33).
LPS로 유도한 NO 발현 억제 효능을 확인하기 위해 griess reagent를 이용한 발색시험을 수행하였다. BV2 세포를 96 well microplate에 3.
상층액 70 ㎕을 회수하여 동량의 griess reagent와 반응시켜 10분 뒤 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite 농도는 sodium nitrite를 표준물질로 하여 정량곡선 대비 수치로 계산하였다.
간단히 설명하자면, Aβ25–35 monomer를 증류수로 희석하여 500 μmol/L 만큼 최종농도를 설정한 후 37℃에서 3일 동안 incubation하여 amyloid plaque을 제조하였다.
본 실험에서 사용한 약재들은 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 구입하였다. 건조된 약재들을 분쇄기를 이용하여 분말화한 후 10배의 2차 증류수를 가하여 환류 추출기에서 2 시간 동안 가열 추출하였으며, 감압 여과 후, 여과액을 동결건조하여 powder 형태의 시료를 얻었다. 동결건조 후의 수율(yield, %)은 半夏(Pinelliae Tuber; PT) 2.
다음으로 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도된 NO 증가에 대한 영향을 알아보기 위하여 MTT assay 및 NO 생성량을 측정하였다. LPS는 그람 음성균의 세포표면을 구성하는 물질로서 microglia 세포의 활성을 유도하여 pro-inflammatory cytokine을 생성하고, 이는 세포의 염증반응을 일으킨다41).
본 연구에서는 “溫化寒痰藥” 또는 “淸化熱痰藥” 배속의 후보약재와 治痰 처방을 조사하였다.
본 연구에서는 11종 한약재 추출물의 항알츠하이머 효능을 AChE 억제 효능 평가, HT22 해마 신경 세포에서 Aβ25–35 plaque 독성에 대한 세포 보효 효과 평가, BV2 신경아교세포에서 LPS 독성에 대한 NO 생성 억제 효능 평가를 통하여 확인하였다.
세포생존율을 확인하기 위하여 BV2 세포를 96 well microplate에 3.0×104 cells/well로 분주하고 24시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 24시간 동안 처리하였다.
세포생존율을 확인하기 위하여 HT22 세포를 96 well microplate에 3.0×103 cells/well로 분주하고 18시간 후, 한약재 추출물을 100 ㎍/㎖로 26시간 동안 처리하였다.
약물처리 및 Aβ25–35 plaque과의 반응이 종료된 후 상층액을 제거하고 MTT 1 ㎎/㎖를 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 DMSO를 이용해 decrystalization 후 spectrophotometer로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
양성대조군은 Quercetin(10 μM)을 사용하였다33). 약물처리 및 LPS와 반응이 종료된 후 상층액을 제거하고 MTT 1 ㎎/㎖를 처리하여 4시간 동안 반응시킨 후 용액을 제거하고 DMSO를 이용해 decrystalization 후 spectrophotometer로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
한의학적으로 치매를 설명할 수 있는 범주 중에서 健忘에 대한 문헌을 중점으로 살펴보았다. <<東醫寶鑑>>에서 健忘은 다른 臟腑 중에서도 心과 脾와 관련되어 있다고 하였다.

대상 데이터

Dimethyl sulfoxide (DMSO), lipopolysaccharide (LPS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), acetylthiocholine iodide, 5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), AChE from Electrophorus electricus, sodium phosphate dibasic, sodium phosphate monobasic, griess reagent 등은 SigmaAldrich사(St Louis, CA USA)에서 구입하였고, Aβ25–35 human, mouse/rat는 Anaspec사(Fremont, CA USA)에서 구입하였고, sodium bicarbonate 등은 덕산종합과학(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
We searched herbs to belong to "溫化寒痰藥" and "淸化熱痰藥 "category and herbal formulae to treat "痰". Except for herbs or herbal formulae of animals, minerals, shellfishes and seaweeds, 8 herbs and 3 herbal formulae were selected as candidates.
본 연구에서는 “溫化寒痰藥” 또는 “淸化熱痰藥” 배속의 후보약재와 治痰 처방을 조사하였다. 그 중 동물성, 광물류, 해조류, 조개류 약재거나 알츠하이머병에 대한 선행연구가 있는 약재 및 처방을 제외하여 8종 약재(半夏, 天南星, 皂莢, 栝樓仁, 浙貝母, 川貝母, 冬瓜子, 白前)와 3종 처방(加味寧神丸, 淸暈化痰湯, 川芎丸)을 선정하였다(Fig. 1). 선정 약재 및 처방들의 선행연구를 살펴보면 半夏는 항천식 효과⁸⁾, 항구토 효과⁹⁾, 복수암 억제 효과¹⁰⁾, 항비만 효과¹¹⁾ 등이 보고되어 있으며, 天南星은 자궁경부암 세포의 증식억제 효과¹²⁾, 발모 촉진 및 유도효과13)등이 보고되어 있다.
본 실험에서 사용한 약재들은 광명당제약(Ulsan, Korea)에서 구입하였다. 건조된 약재들을 분쇄기를 이용하여 분말화한 후 10배의 2차 증류수를 가하여 환류 추출기에서 2 시간 동안 가열 추출하였으며, 감압 여과 후, 여과액을 동결건조하여 powder 형태의 시료를 얻었다.
세포배양에 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin은 Hyclone (Auckland, New Zealnad)에서 구입하여 사용하였다.
실험에는 HT22 해마 신경 세포를 사용하였으며 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양하여 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO₂, 95% air 조건인 incubator에서 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 high-glucose DMEM 배지를 사용하였다.
실험에는 BV2 미세아교세포를 사용하였으며 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양하여 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO2, 95% air 조건인 incubator에서 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 high-glucose DMEM 배지를 사용하였다.
실험에는 HT22 해마 신경 세포를 사용하였으며 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양하여 사용하였다. 세포배양은 37℃의 5% CO₂, 95% air 조건인 incubator에서 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 high-glucose DMEM 배지를 사용하였다.
양성대조군은 Quercetin(10 μM)을 사용하였다33).

데이터처리

통계처리는 Graphpad Prism 5.0 software (San Diego, USA)를 이용하였으며, 통계적 유의성은 One-way ANOVA, 사후검정은 Tukey’s test를 사용하였다.

성능/효과

1. AChE 억제 효능 평가를 하였을 때, 加味寧神丸, 淸暈化痰湯의 우수한 AChE 억제능을 확인하였다.
11종 추출물의 AChE 억제 활성을 100 ㎍/㎖ 농도에서 측정한 결과 PT, AR, FT, FC, CGH에서는 억제 활성을 나타내지 않았으며, GF는 1.33±1.75%, TS는 5.04±1.02%, BS는 2.22±0.83%, CR은 12.12±0.62%, GYH는 72.40±0.16%, CHT는 67.79±0.24%의 억제 활성을 보였다 (Table 3).
2. HT22 해마신경세포에서 Aβ25–35 plaque 단독 처리군 대비 天南星, 栝樓仁, 浙貝母 처리군에서 세포 생존율이 유의하게 증가함을 확인하였다.
3. BV2 microglia 세포에서 LPS 단독 처리군 대비 川芎丸 처리군에서 NO 생성량이 유의하게 감소하였으며, 加味寧神丸, 淸暈化痰湯에서도 NO 생성량이 감소함을 확인하였다.
11종 추출물이 BV2 세포에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. BV2 세포에서 100 ㎍/㎖로 처리 후, 세포생존율을 확인하였을 때, GF와 CR에서 세포독성이 관찰됨을 확인하였다(Fig. 3A). 이 후 GF, CR을 제외한 9종 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 처리 후, LPS 독성에 대한 세포 생존율을 확인하였을 때, 세포 독성이 관찰되지 않았다(Fig.
11종 추출물이 HT22 세포에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. HT22 세포에서 100 ㎍/㎖로 처리 후, 세포 생존율을 확인하였을 때, GF와 CR에서 세포독성이 관찰됨을 확인하였다 (Fig. 2A). 이 후 GF, CR을 제외한 9종 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 처리 후, Aβ25–35 plaque 독성에 대한 세포 생존율을 확인하였을 때, Aβ_25–35 plaque 단독 처리군(32.
본 실험에서는 BV2 microglia 세포에서 LPS 독성에 대한 11종 한약재 추출물의 NO 생성 억제 효과를 평가하였다. 그 결과 GF와 CR에서 BV2 세포에 대한 독성을 보였으며, LPS 의해 세포 생존율이 약간 감소한 한약재 추출물 처리군도 있었으나 실험에는 영향을 미치지 않았다. 반면 CGH 처리군에서 LPS 단독 처리군 대비 통계적으로 유의하게 NO 생성을 억제하였으며, GYH, CHT 처리군에서도 LPS 단독 처리군 대비 NO 생성 억제 경향을 확인하였다.
또한 GYH(229.85±15.06 μmol/L), CHT(233.42±9.91 μmol/L) 처리군에서도 LPS 단독 처리군 대비 NO 생성량이 감소하는 경향이 나타났다(Fig. 3C).
또한 상등액을 이용하여 NO 생성량을 측정하였을 때, LPS 단독 처리군(278.95±10.89 μmol/L)에서 대조군(28.84±1.08 μmol/L) 대비 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.001), 한약재 추출물 처리군 중 CGH(141.41±9.91 μmol/L) 처리군에서 LPS 단독 처리군 대비 NO 생성량이 통계적으로 유의하게 감소하였다.
그 결과 GF와 CR에서 BV2 세포에 대한 독성을 보였으며, LPS 의해 세포 생존율이 약간 감소한 한약재 추출물 처리군도 있었으나 실험에는 영향을 미치지 않았다. 반면 CGH 처리군에서 LPS 단독 처리군 대비 통계적으로 유의하게 NO 생성을 억제하였으며, GYH, CHT 처리군에서도 LPS 단독 처리군 대비 NO 생성 억제 경향을 확인하였다. CGH의 구성 약재 중 桔梗이 君藥으로 사용되는데 길경 추출물이 BV2 microglia 세포에서 LPS 독성에 의한 NO 및 prostaglandin E2 생성을 억제하고, cyclooxygenase-2와 inducible NO synthase 발현을 감소 시키며, interleurkin-8을 감소시켜서 항염증 효능을 나타낸다고 보고하였다⁴⁵⁾.
이 후 GF, CR을 제외한 9종 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 처리 후, Aβ25–35 plaque 독성에 대한 세포 생존율을 확인하였을 때, Aβ25–35 plaque 단독 처리군(32.22±0.5%)에서 대조군 대비 세포 생존율이 통계적으로 유의하게 감소하였으며(p < 0.001), 한약재 추출물 처리군 중 AR(41.54±0.35%), TS(39.42±0.51%), FT(47.45±1.01%) 처리군에서 Aβ25–35 plaque 단독 처리군 대비 세포 생존율이 유의하게 증가하였다(Fig. 2B).
3A). 이 후 GF, CR을 제외한 9종 한약재 추출물을 10 ㎍/㎖로 처리 후, LPS 독성에 대한 세포 생존율을 확인하였을 때, 세포 독성이 관찰되지 않았다(Fig. 3B). 또한 상등액을 이용하여 NO 생성량을 측정하였을 때, LPS 단독 처리군(278.
plaque 독성에 대한 세포 보효 효과 평가, BV2 신경아교세포에서 LPS 독성에 대한 NO 생성 억제 효능 평가를 통하여 확인하였다. 이상의 결과는 治痰 효능을 가지는 약재 또는 처방이 항알츠하이머 소재로서의 가능성을 세포 수준 연구에서 처음 규명하였다는 점에서 시사하는 바가 크다.
한약재 추출물의 AChE 억제활성을 측정한 결과 GYH는 72.40±0.16%, CHT에서는 67.79±0.24%의 억제 활성을 보였다.

후속연구

이상의 결과는 治痰 한약재의 항알츠하이머 소재로서의 가능성을 과학적으로 규명한 점에서 시사하는 바가 크다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치매란?	치매는 주요 신경 인지 장애로 정의하고 있으며, 기억력, 학습, 언어, 행정기능, 사회적 인식, 운동 능력 등과 같은 여러 인지 기능 장애가 나타나게 된다. 전 세계적으로 2015년까지 약 4,700만명의 환자들이 치매를 앓고 있으며, 2050년에는 약 3배가 늘어날 것으로 전망된다1,2).
	한의학적의 치매란?	한의학적으로 치매를 설명할 수 있는 범주 중에서 健忘에 대한 문헌을 중점으로 살펴보았다. <<東醫寶鑑>>에서 健忘은 다른 臟腑 중에서도 心과 脾와 관련되어 있다고 하였다. 心이 傷하게 되면 血이 줄어들고 흩어져서 神이 제자리를 못하게되고, 脾가 傷하면 衛氣가 쇠약해져서 健忘이 생긴다고 하였다. 이렇게 健忘은 精神이 부족해서 생기는 경우도 있지만, 痰에 의해 생기는 경우도 있다.
	알츠하이머병의 병리적 기전은?	치매의 종류는 대뇌의 위축과 노인반, 신경원섬유의 변화로 병리적 현상이 나타나는 알츠하이머병이 약 50%를 차지하며 그 밖에 혈관성 치매, 파킨슨병성 치매 등이 있다3). 치매에서 높은 비중을 차지하고 있는 알츠하이머병의 병리적 기전은 뇌에서 amyloid beta(Aβ) plaque의 생성 및 축적과 함께 tau protein의 과인산화로 neurofibrillary tangle이 형성되어 발생하는 신경세포손상이 주된 원인으로 알려져 있다4). 현재 시판되고 있는 콜린성 치료제인 donepezil, rivastigmine, galantamine 등의 아세틸콜린 분해 효소 억제제가 치매 질병에 주로 사용되고 있지만5), 일시적으로 증상을 개선하는 수준이며, 모든 환자에게 적용을 하지 못한다는 점에서 보다 근본적인 치료제 개발이 필요한 실정이다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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