[논문]불로초 균사배양 갯버들 추출물이 인간 피부 섬유아세포의 제1형 프로콜라겐 생성에 미치는 영향

정용운; 박영진

doi:10.4489/kjm.20190019

불로초 균사배양 갯버들 추출물이 인간 피부 섬유아세포의 제1형 프로콜라겐 생성에 미치는 영향
Effect of Ganoderma lucidum Solid-state Fermented Salix gracilistyla Extract on Type I Procollagen Biosynthesis in HDFn Cells 원문보기

한국균학회지 = The Korean journal of mycology, v.47 no.2, 2019년, pp.153 - 163

정용운 (건국대학교 의료생명대학 바이오융합과학부, 의료생명연구소) , 박영진 (건국대학교 의료생명대학 바이오융합과학부, 의료생명연구소)

초록
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본 연구는 갯버들(Salix gracilistyla)의 화장품 소재로의 활용가능성을 판단하기 위해, 기존 일반적인 방법이 아닌 균사배양 방법을 통해 가능성을 확인하였고, 구체적으로는 대표적인 약용버섯인 불로초(Ganoderma lucidum) 균사의 배양을 통하여 그 효능을 확인하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 DPPH 라디칼소거능 분석결과에서는, 갯버들 추출물(SGE)이 불로초 균사배양 갯버들 추출물(GLSGE) 보다 높게 평가되었으나, 콜라게나제 활성 억제 평가에서는 불로초 균사배양 갯버들 추출물(GLSGE)이 갯버들 추출물(SGE)과 비교하여 상대적으로 낮게 평가되었다. 그럼에도 불구하고, 불로초 균사배양 갯버들 추출물(GLSGE)은 갯버들 추출물(SGE)을 처리한 경우보다, HDFn 세포의 생존율을 높은 수준으로 증가시켰으며, HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐의 생합성 또한 매우 높은 수준으로 증가시키는 것이 확인되었다. 결과적으로 앞선 실험을 통해, 불로초 균사배양 갯버들 추출물이 항노화 활성을 가지는 기능성 화장품 소재로 활용 가능성이 있다고 사료되며, 기능성 소재의 효과를 더욱 증진시키기 위한 방안으로 불로초 균사의 배양이 효과적이라는 것을 의미한다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to investigate the feasibility of Salix gracilistyla production for cosmetic use through mycelial fermentation. The efficacy of this method was confirmed by fermentation using the mycelia of Ganoderma lucidum (a representative medicinal mushroom). Total polyphenol and flavonoid content and DPPH radical scavenging activity of S. gracilistyla extract (SGE) were found to be higher than those of G. lucidum fermented S. gracilistyla extract (GLSGE). GLSGE had relatively lower collagenase activity than SGE. However, GLSGE increased HDFn cell viability more potently than SGE, and increased the biosynthesis of type I procollagen. Thus, GLSGE could be used as an anti-aging cosmetic active ingredient. These results indicate that extract fermentation using G. lucidum mycelia can effectively enhance some beneficial effects of functional materials.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Total polyphenol (A) and flavonoid (B) contents. SGE, Salix gracilistyla 70% EtOH extract. GLSGE, Ganoderma lucidum fermented S. gracilistyla 70% EtOH extract. CE, catechin equivalent. GAE, gallic acid equivalent.
그림 Fig. 2. DPPH radical scavenging activities. SGE, Salix gracilistyla 70% EtOH extract. GLSGE, Ganoderma lucidum fermented S. gracilistyla 70% EtOH extract.
그림 Fig. 3. Effects of extracts on collagenase inhibitory activities. SGE, Salix gracilistyla 70% EtOH extract. GLSGE, Ganoderma lucidum fermented S. gracilistyla 70% EtOH extract. EGCG, epigallocatechin gallate (200 μM).
그림 Fig. 4. Effects of extracts on HDFn cell viability. SGE, Salix gracilistyla 70% EtOH extract. GLSGE, Ganoderma lucidum fermented S. gracilistyla 70% EtOH extract. Statistical significance of differences was evaluated using a one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test. a, p < 0.001 versus non-treatment. b, p < 0.001 versus 50 μg/mL of SGE. c, p < 0.001 versus 100 μg/mL of SGE. d, p < 0.001 versus 200 μg/mL of SGE.
그림 Fig. 5. Effects of extracts on cellular type I procollagen content of HDFn cells. SGE, Salix gracilistyla 70% EtOH extract. GLSGE, Ganoderma lucidum fermented S. gracilistyla 70% EtOH extract. a, p < 0.001 versus 50 μg/mL of SGE. b, p < 0.001 versus 100 μg/mL of SGE. c, p < 0.05 versus nontreatment.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 갯버들 및 불로초의 기능성 화장품 소재로의 활용가능성을 제고하고 다양한 기능성 소재의 효과를 더욱 증진시키기 위한 방안으로 불로초 균사의 배양이 효과적이라는 것을 제안하고자 수행하였다. 이를 위해 갯버들 추출물과 갯버들에 불로초 균사를 배양한 추출물의 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 콜라게나제 활성 억제율 및 인간 피부 섬유아 세포(human dermal fibroblast)의 type I procollagen 생성 유도능을 비교 분석하였다.

제안 방법

HDFn 세포를 FBS를 첨가하지 않은 DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)배지로 교환하고 갯버들 및 갯버들 불로초 균사 배양 추출물을 각 50 및 100 μg/mL를 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다.
반응 후 250 μL의 정지액(6% citric acid) 및 750 μL의 에틸아세테이트를 첨가하고 200 μL의 상층액을 320 nm에서 흡광도를 측정하여 콜라게나아제 저해활성을 평가하였다.
배지가 제거된 세포를 고정액으로 처리한 후 500 μL의 용해액으로 neutral red crystal을 용해시키고, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다.
불로초 균사배양 갯버들 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 분석을 위해 100 μL의 DPPH 용액 (0.2 mM in methanol, Santacruz Co.)과 메탄올에 희석된 다양한 농도의 시료 100 μL를 혼합하고 10분간 반응시킨 뒤 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
불로초 균사배양 갯버들 추출물의 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성에 미치는 영향을 평가에 앞서, 세포 생존율에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 4). 우선 갯버들 추출물을 농도별 (50, 100 및 200 μg/mL)로 처리 시 HDFn 세포의 생존율이 비 처리구보다 유의적인 수준에서 농도 의존적으로 감소함이 확인되었다.
불로초 균사배양 갯버들 추출물이 콜라게나제 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 각 추출물의 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 콜라게나제 저해 활성을 분석하였다(Fig. 3).
이러한 결과를 바탕으로 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성에 미치는 영향을 평가하였다(Fig. 5). HDFn 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 불로초 균사 배양 갯버들 추출물의 농도인 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 HDFn 세포에 처리하여 제1형 프로콜라겐 생합성에 미치는 영향을 분석한 결과, 두 농도 모두 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 증가하는 것이 확인되었다.
본 연구는 갯버들 및 불로초의 기능성 화장품 소재로의 활용가능성을 제고하고 다양한 기능성 소재의 효과를 더욱 증진시키기 위한 방안으로 불로초 균사의 배양이 효과적이라는 것을 제안하고자 수행하였다. 이를 위해 갯버들 추출물과 갯버들에 불로초 균사를 배양한 추출물의 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 콜라게나제 활성 억제율 및 인간 피부 섬유아 세포(human dermal fibroblast)의 type I procollagen 생성 유도능을 비교 분석하였다.
제1형 프로콜라겐 함량은 Procollagen Type I C- 펩티드 EIA 키트 (Takara, Korea)를 이용하여 분석 하였다. HDFn 세포를 6-well plate에서 7x10⁵ cells/well로 접종하고 37℃ (5% CO₂)에서 24시간 동안 부착시켰다.
총 페놀 함량은 gallic acid를 표준시료로 사용하여 건조 추출물 무게 (g)에 대한 Gallic Acid Equivalents (GAE)의 무게 (mg)로 표현하였으며, 총 플라보노이드 함량은 Catechin을 표준시료로 사용하여 건조 추출물 무게 (g)에 대한 Catechin Equivalents (CE)의 무게 (mg)로 표현하였다.
총 폴리페놀 함량은 20 μL (1 mg/mL)시료 추출물을 20 μL의 Folin-Ciocalteu (FC) 및 1% Na2CO3 160 μL와 혼합하여 1시간 동안 반응하고, 700 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
총 플라보노이드 함량은 25 μL (1 mg/mL)시료 추출물을 125 μL의 멸균증류수와 5% NaNO2 8 μL 와 혼합하여 5 분간 반응한 후 10% AlCl 3 15 μL를 첨가하고, 6 분간 추가 반응하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
배양이 완료된 갯버들을 40배의 70% 에탄올로 75℃에서 2시간, 2회 환류 추출하였다. 추출물을 여과지(Whatman No.2, GE Health care, UK)로 여과한 후 감압농축하여 추출물을 확보하였다.

대상 데이터

갯버들은 JW 파마켐에서 제공받아 사용하였으며, 분쇄된 갯버들을 증류수와 혼합하고 121℃ 조건에서 2시간 가압 멸균하여 갯버들 고체 배지를 제조하였다. 불로초 균사 액체종균을 10% (v/w) 접종하고 28℃에서 30일 동안 배양하였다.
불로초 균사배양을 위해 농촌진흥청 국립원예특작과학원 버섯과에서 분양받은 영지2호를 PDA (배지 1 L 당 agar 15 g, potato extract 4 g, glucose 20 g) 고체배지에 접종 후 25℃에서 5일간 배양하였다. 배양된 균사를 50 mL의 PDB 액체배지에 접종하고 28℃, 130 rpm조건으로 7일간 진탕배양 하여 액체 종균으로 사용하였다.
인간피부섬유아 (HDFn) 세포 (PCS-201-010, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA)는 10% FBS 및 1% 항생제 (페니실린 및 스트렙토마이신)를 함유하는 DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)배지를 사용하여 37℃ (5% CO₂)에서 배양하여 사용하였다.

데이터처리

Statistical significance of differences was evaluated using a one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test.
모든 실험은 3회 반복하여 평균값 ± 표준편차로 나타내었으며, Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) 프로그램을 사용하여 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA) 및 Tukey's test에 의한 사후검정을 통해 통계 분석을 수행하였다.

이론/모형

HDFn 세포 생존율은 In Vitro Toxicology Assay Kit (Sigma, Korea)를 사용하여 평가하였다. 다양한 농도의 시료가 처리된 세포를 37℃ (5% CO₂)조건에서 24시간 배양하고 neutral red를 처리한 후암상태에서 1시간 반응하였다.
총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 Falcone et al. [25]에 의해 기술된 방법에 의해 분석하였다. 총 폴리페놀 함량은 20 μL (1 mg/mL)시료 추출물을 20 μL의 Folin-Ciocalteu (FC) 및 1% Na₂CO₃ 160 μL와 혼합하여 1시간 동안 반응하고, 700 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.

성능/효과

HDFn 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 불로초 균사 배양 갯버들 추출물의 농도인 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 HDFn 세포에 처리하여 제1형 프로콜라겐 생합성에 미치는 영향을 분석한 결과, 두 농도 모두 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 증가하는 것이 확인되었다.
갯버들 추출물 50 μg/mL 농도 처리 시 HDFn 세포의 생존율은 65.95%이었으며, 동일 농도의 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 처리는 105.39%로 확인되었다.
갯버들 추출물 50 μg/mL 및 100 μg/mL 처리 시 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 각 28.15 및 23.16%로 감소하였고, 동일 농도의 불로초 균사배양 갯버들 추출물 처리는 각 117.43 및 124.52% 유의적인 수준에서 4배이상 증가하는 것이 확인되었다.
HDFn 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 불로초 균사 배양 갯버들 추출물의 농도인 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 HDFn 세포에 처리하여 제1형 프로콜라겐 생합성에 미치는 영향을 분석한 결과, 두 농도 모두 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 증가하는 것이 확인되었다. 그러나 동일한 농도의 갯버들 추출물 처리시 모든 농도에서 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 크게 감소하는 것이 확인되었다. 갯버들 추출물 50 μg/mL 및 100 μg/mL 처리 시 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 각 28.
2). 그러나 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과와 유사하게 DPPH 라디칼 소거능은 갯버들 추출물 보다 상대적으로 매우 낮게 평가되었다(Fig. 2).
그러나 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 DPPH 라디칼 소거능 평가 결과와 유사하게 불로초 균사 배양 갯버들 추출물 처리는 효과적으로 콜라게나제 활성을 저해하지 않는 것이 확인되어 갯버들 추출물 성분 중 콜라게나제 활성을 저해하는 성분이 불로초 균사의 다양한 효소 등의 작용에 의해 분해되거나, 전환되었다고 판단된다.
06 mg CE/g으로 확인되었다. 그러나 흥미롭게도 갯버들을 불로초 균사로 배양 후 추출된 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 10.1 mg GAE/g으로 분석되었으며, 총 플라보노이드 함량은 검출되지 않았다.
그러나 흥미롭게도 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 처리는 갯버들 추출물의 동일 처리 농도와 비교하여 유의적으로 증가시키는 것이 확인되었다. 갯버들 추출물 50 μg/mL 농도 처리 시 HDFn 세포의 생존율은 65.
따라서 갯버들을 불로초 균사로 배양 시 갯버들에 함유된 다앙한 폴리페놀과 플라보노이드 성분이 불로초가 생산하는 다양한 분해 효소 등에 의해 분해되어 그 함량이 감소하였으며, 이러한 결과로 DPPH 소거능도 함께 감소하였다고 사료된다.
따라서 갯버들의 불로초 균사 배양은 갯버들의 콜라게나제 저해활성을 효과적으로 상승시키지 못하며, 오히려 감소시키는 것이 확인되었다.
또한 갯버들 및 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 다양한 농도를 처리하여 DPPH 라디칼 소거 능을 분석한 결과, 갯버들 추출물은 농도 의존적으로 소거능이 증가하여 125 μg/mL의 농도부터는 거의 모든 DPPH 라디칼을 소거하는 것으로 평가되었다 (Fig. 2).
또한 갯버들 추출물 100 μg/mL 농도 처리 시 HDFn 세포의 생존율 더욱 감소하여 37.31%로 확인되었으나, 동일 농도의 불로초 균사배양 갯버들 추출물의 처리는 107.36% 로 약 3배 증가하는 것을 확인하였다.
또한 불로초 균사배양 갯버들 추출물 50 μg/mL 및 100 μg/mL의 처리는 비 처리 구 보다 각 17.43% 및 24.52%로 HDFn 세포의 제1형 프로콜라겐 생합성이 증가하는 것이 확인되었다.
불로초 균사배양 갯버들 추출물의 200 μg/mL 농도 처리는 HDFn 세포의 생존율을 유의적으로 감소시키는 것이 확인되었다.
1에 나타내었다. 우선 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하여 분석한 갯버들 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 136.02 mg GAE/g으로, AlCl₃ 방법을 이용한 갯버들 70% 에탄올 추출물의 총 플라보노이드 함량은 110.06 mg CE/g으로 확인되었다. 그러나 흥미롭게도 갯버들을 불로초 균사로 배양 후 추출된 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 10.
우선 갯버들 추출물을 농도별 (50, 100 및 200 μg/mL)로 처리 시 HDFn 세포의 생존율이 비 처리구보다 유의적인 수준에서 농도 의존적으로 감소함이 확인되었다.
우선 갯버들 추출물을 처리한 결과에서는 농도 의존적인 콜라게나제 저해 활성이 확인되었으며, 200 μg/mL 처리 농도 에서는 대조구인 epigallocatechin gallate (EGCG)보다 높은 수준인 21.19%로 콜라게나제 활성을 저해하는 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 갯버들의 불로초 균사 배양이 갯버들의 HDFn 세포의 생존율에 영향을 미치는 성분을 효과적으로 제거하고 이를 통하여 세포의 증식 및 제1형 프로콜라겐의 생합성을 효과적 으로 증가시킨다는 것을 의미하는 것이다.

후속연구

비록 불로초 균사배양 갯버들 추출물이 콜라게나제 활성을 효과적으로 억제하지는 못하였으나, 실제 피부의 콜라겐 생합성에 중요한 역할을 담당하는 HDFn 세포의 생존율 및 제1형 프로콜라겐의 생합성을 증가시킨다는 것은 불로초 균사배양 갯버들 추출물이 향후 피부 노화방지 등에 효과적으로 활용될 가능성이 크다는 것을 의미하는 것이다. 나아가 개발되거나 개발 중에 있는 기능성 소재의 효과를 증진시키기 위한 방안으로 버섯을 포함한 다양한 미생물의 활용이 효과적일 것이라고 사료된다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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