[논문]참당귀에서 분리한 다당의 면역활성에 대한 당쇄의 역할

신광순

doi:10.9721/kjfst.2019.51.4.336

초록
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참당귀 유래 면역활성 다당의 활성과 구조의 상관관계를 규명하고자 조다당 AGE-0로부터 두 차례의 연속적인 컬럼 크로마토그래피를 실행하여 단일 정제 다당 AGE-2c-I을 얻었다. AGE-2c-I은 농도의존적으로 우수한 항보체 활성을 보여주었으며, 일반화학적 특성을 분석한 결과, 분자량 약 140 kDa의 고분자 다당으로 4종의 구성당과 13종의 당쇄 결합양식으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 이 다당은 ${\beta}$-glucosyl Yariv reagent와의 높은 반응성을 보임으로써 arabino-3,6-galactan의 구조를 가진 rhamnogalacturonan-I 구조임을 추정할 수 있었다. 한편, AGE-2c-I의 미세구조의 해명과 항보체 활성에 관여하는 다당 중의 활성부위 검토를 위해 ${\alpha}$-L-arabinofuranosidase와 endo-1,4-${\beta}$-galactanase를 이용한 연속적 가수분해를 행하고 얻은 단편획분들을 이용, 구성당 및 당쇄결합 양식 분석, ${\beta}$-glucosyl Yariv reagent와의 반응성 검토 및 항보체 활성 결과를 분석한 결과, 참당귀 유래 항보체활성 다당 AGE-2c-I은 rhamnogalacturonan-I과 유사한 구조를 소유하고 있음이 확인되었으며, AGE-2c-I의 측쇄 구조인 arabino-${\beta}$-3,6-galactan 사슬이 항보체 활성 발현에 주요 역할을 수행하며, 5-linked Araf와 3,5-branched Araf로 구성된 ${\alpha}$-arabinan 측쇄가 활성에 부분적으로 관여하고 있음을 최종 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

To elucidate structure-function relationship of polysaccharide from Angelica gigas, the AGE-2c-I was purified by two successive chromatography steps. AGE-2c-I showed a potent anti-complementary activity in a dose-dependent manner. AGE-2c-I with a molecular weight of 140 kDa comprised four monosaccha...

To elucidate structure-function relationship of polysaccharide from Angelica gigas, the AGE-2c-I was purified by two successive chromatography steps. AGE-2c-I showed a potent anti-complementary activity in a dose-dependent manner. AGE-2c-I with a molecular weight of 140 kDa comprised four monosaccharides and 13 glycosyl linkages, and strongly reacted with ${\beta}$-glucosyl Yariv reagent. For the fine structure analysis of AGE-2c-I, it was sequentially digested by exo-arabinofuranosidase and endo-galactanase. The results indicated that AGE-2c-I was a typical RG-I polysaccharide with side chains such as highly branched ${\alpha}$-arabinan, ${\beta}$-($1{\rightarrow}4$)-galactan and arabino-${\beta}$-3,6-galactan. To characterize the active moiety of AGE-2c-I, the anti-complementary activities of AGE-2c-I and its subfractions were assayed. It was observed that the anti-complementary activity of AGE-2c-I was due to the entire structure that resembled RG-I. In addition, arabino-${\beta}$-3,6-galactan side chain (GN-I) in AGE-2c-I probably plays a crucial role in the anti-complementary activity, whereas ${\alpha}$-arabinan side chain (AFN-I) consisting of 5-linked Araf and 3,5-branched Araf partially contributes to the activity.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Isolation and purification of the polysaccharides from Angelica gigas NAKAI and sequential enzymatic digestion for structural analysis.
$Fig. 2. Single radial gel diffusion (A) and reactivity (B) between β-glucosyl Yariv reagent and AGE-2c-I and its subfractions after serial enzymatic digestion.$ 그림 Fig. 2. Single radial gel diffusion (A) and reactivity (B) between β-glucosyl Yariv reagent and AGE-2c-I and its subfractions after serial enzymatic digestion.
표 Table 1. Chemical properties of AGE-2c-I purified from Angelica gigas NAKAI
$Fig. 3. Anti-complementary activities of AGE-2c-I and its subfractions obtained from serial enzymatic digestion.$ 그림 Fig. 3. Anti-complementary activities of AGE-2c-I and its subfractions obtained from serial enzymatic digestion.
$Table 2. Sugar compositions of the AGE-2c-I subfractions after serial enzymatic digestion$ 표 Table 2. Sugar compositions of the AGE-2c-I subfractions after serial enzymatic digestion
$Table 3. Methylation analysis of the AGE-2c-I subfractions after serial enzymatic digestion$ 표 Table 3. Methylation analysis of the AGE-2c-I subfractions after serial enzymatic digestion
그림 Fig. 4. A possible structure of AGE-2c-I, anti-complementary polysaccharide purified from Angelica gigas NAKAI.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 최근 각광받고 있는 다당 소재를 참당귀로부터 분리 정제하여 선천면역계의 초기 면역반응에 중요한 역할을 하는 항보체에 대한 활성능을 측정하고, 이에 대한 활성 물질로 추정되는 다당의 미세 구조를 해석하여 다당 구조와 활성과의 상관관계를 확인함으로써 건강기능성 소재 개발에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다.

제안 방법

다당 시료의 일반성분을 분석하기 위해 갈락토오즈, 갈락투론산, 소혈청알부민 및 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 중성당(phenol-sulfuric acid법) (Dubois 등, 1956), 산성당(m-hydroxybiphenyl법)(Blumenkrantz, 1973), 단백질(Bradford법)(Bradford, 1976) 및 KDO (thiobarbituric acid 법) (Karkhanis 등, 1978) 함량 측정을 진행하였다. 구성당 분석은 Jones과 Albersheim의 방법(1972)을 일부 변형하여 다당시료를 2M trifluoroacetic acid (TFA)를 이용, 가수분해 후 alditol acetate 유도체로 전환하여 gas chromatography (GC)를 이용, 분석하였다.
다당 시료의 일반성분을 분석하기 위해 갈락토오즈, 갈락투론산, 소혈청알부민 및 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 중성당(phenol-sulfuric acid법) (Dubois 등, 1956), 산성당(m-hydroxybiphenyl법)(Blumenkrantz, 1973), 단백질(Bradford법)(Bradford, 1976) 및 KDO (thiobarbituric acid 법) (Karkhanis 등, 1978) 함량 측정을 진행하였다. 구성당 분석은 Jones과 Albersheim의 방법(1972)을 일부 변형하여 다당시료를 2M trifluoroacetic acid (TFA)를 이용, 가수분해 후 alditol acetate 유도체로 전환하여 gas chromatography (GC)를 이용, 분석하였다.
항보체 활성은 Meyer법(1964)에 따라 시료에 의한 보체 활성화 후, 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test 방법으로 측정하였다. 한편 항보체 활성은 정상인의 혈청과 GVB++, 증류수만으로 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH50, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH50, %)로써 나타내었다.

대상 데이터

본 연구에서 사용된 참당귀는 2016년도에 강원도 홍천군에서 재배되어 수확한 것을 구입하여 사용하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 IBM SPSS Statistics 21 (IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 통계처리 하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(means)과 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 시료 및 처리 농도간의 유의적 차이는 p<0.
, Armonk, NY, USA)을 이용하여 통계처리 하였으며 모든 측정 항목에 대한 평균(means)과 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 시료 및 처리 농도간의 유의적 차이는 p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple test 일원배치 분산분석으로 실시하였다.

이론/모형

다당 시료의 결합양식(linkage form)을 확인하기 위해 Hakomori방법(Narui 등, 1982)을 이용, methylation analysis를 행하였다. 먼저 1 mg의 다당 시료를 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후, methylsulfinyl carbanion (MSCA)와 반응하여 polyalkoxide로 전환시킨 후 iodomethane (CH3I)을 첨가하여 methyl화 시켰으며, 이를 partially methylated alditol acetate (PMAA)로 전환하여 GC-mass spectrometry (MS)로 분석하였다.

성능/효과

그러나 endo-Galnase 처리를 거친 GN-I에서는 β-(1→4)-galactan 부위가 제거되었음에도 AFN-I에 비해 활성이 증가하는 양상을 보임으로써, β-(1→4)-galactan 곁사슬은 항보체 활성에 큰 공헌을 하지 못함을 알 수 있었다. 따라서 참당귀 유래 면역활성다당 AGE-2c-I은 RG-I의 특징적 구조를 소유하며, 측쇄로 존재하는 II형의 arabino-β-3,6-galactan 구조가 주된 활성부위로 작용하며, 또 다른 측쇄인 α-(1→5)-arabinan 구조도 일부 활성에 공헌하는 것으로 최종 확인할 수 있었다.
체내로 침입하는 외부감염물질에 대해 초기에 반응하는 선천 면역계 인자 중 하나인 보체(complement)에 대하여 참당귀 유래 다당의 활성화 여부를 측정하기 위해 Meyer의 방법에 따라 항보체 활성을 측정한 결과, 농도의존적으로 우수한 활성을 나타내었으며 특히, AGE 2c-I의 1,000 μg/mL의 농도에서 동일 농도로 처리한 양성대조군 PSK에 준하는 우수한 항보체 활성을 보였다 (Fig. 3). 양성대조군인 PSK는 현재 항암제로 시판되는 운지버섯 유래 면역활성 다당이며, 일반적으로 1,000 μg/mL의 농도에서 60%이상의 항보체 활성을 나타내는 다당체는 그 약리활성이 통상적으로 인정된다고 알려져 있으므로(Yamada 등, 1992), AGE 2c-I의 보체계 활성화능이 우수함을 재차 확인할 수 있었다.
이러한 사실은 galactan 주쇄에 짧은 arabinofuranoside들이 α 결합으로 붙어 존재하다가 exo-Arafase의 처리에 의해 분해됨으로써 말단의 galactose 잔기들이 많이 노출된 결과로 해석될 수 있었다. 한편 rhamnose 합들은 전체적으로 증가 양상을 보였다. 이상의 결과로부터 AGE2c-I 다당은 C3 위치에서 측쇄를 갖는 α-(1→5)-arabinan을 하고 있음을 추정할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	단일 정제 다당 AGE-2c-I의 특성은?	참당귀 유래 면역활성 다당의 활성과 구조의 상관관계를 규명하고자 조다당 AGE-0로부터 두 차례의 연속적인 컬럼 크로마토그래피를 실행하여 단일 정제 다당 AGE-2c-I을 얻었다. AGE-2c-I은 농도의존적으로 우수한 항보체 활성을 보여주었으며, 일반화학적 특성을 분석한 결과, 분자량 약 140 kDa의 고분자 다당으로 4종의 구성당과 13종의 당쇄 결합양식으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 이 다당은 β-glucosyl Yariv reagent와의 높은 반응성을 보임으로써 arabino-3,6-galactan의 구조를 가진 rham- nogalacturonan-I 구조임을 추정할 수 있었다.
	참당귀(Angelica gigas NAKAI)란 무엇인가?	참당귀(Angelica gigas NAKAI)는 우리나라를 비롯한 동양권에서 오랜 기간 동안 질병치료와 예방의 목적으로 사용되어온 생약재로써, 항염증 활성(Ma 등, 2009), 항암활성(Lee 등, 2003), 항당뇨 활성(Kim 등, 2008) 및 항알러지 효과(Joo 등, 2010) 등의 약리활성이 확인된 바 있다. 특히 참당귀 뿌리에 decursin과 decusinol angelate가 다량 함유되어 있다고 보고되었는데(Ahn 등, 1998), 특히 decursin은 백혈병 치료와 신장독성 경감, 당뇨성 고혈압 치료 등에 효과가 있으며(Kang 등, 2003), 새로운 기작의 항암제로써의 기능도 확인되어 개별인정형 건강기능성 식품의 원료로 사용되고 있다(Choi 등, 2012).
	참당귀 뿌리는 어떤 치료 효과가 있는가?	참당귀(Angelica gigas NAKAI)는 우리나라를 비롯한 동양권에서 오랜 기간 동안 질병치료와 예방의 목적으로 사용되어온 생약재로써, 항염증 활성(Ma 등, 2009), 항암활성(Lee 등, 2003), 항당뇨 활성(Kim 등, 2008) 및 항알러지 효과(Joo 등, 2010) 등의 약리활성이 확인된 바 있다. 특히 참당귀 뿌리에 decursin과 decusinol angelate가 다량 함유되어 있다고 보고되었는데(Ahn 등, 1998), 특히 decursin은 백혈병 치료와 신장독성 경감, 당뇨성 고혈압 치료 등에 효과가 있으며(Kang 등, 2003), 새로운 기작의 항암제로써의 기능도 확인되어 개별인정형 건강기능성 식품의 원료로 사용되고 있다(Choi 등, 2012). 또한, 당귀에서 추출한 수용성 다당물질에는 항보체활성 및 B-lymphocyte 증식활성, interferon 생산 활성 등이 보고되어 있으며, 이를 Angelan이라 칭하고 다른다당류들과는 다른 고유의 면역증강 기작을 보인다고 보고되기도 하였다(Kiyohara와 Yamada, 1991).

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