[논문]아카시아 잎 추출물의 생리 활성 및 고분자 미셀과 세포투과 펩티드를 적용한 피부흡수증진 효과

허수현; 박수인; 안규민; 신문삼

doi:10.17703/jcct.2019.5.3.271

아카시아 잎 추출물의 생리 활성 및 고분자 미셀과 세포투과 펩티드를 적용한 피부흡수증진 효과
Physiological Activity of Robinia pseudo acacia Leaf Extracts and Enhancement of Skin Permeation Using Polymer Micelles and Cell Penetrating Peptide 원문보기

Journal of the convergence on culture technology : JCCT = 문화기술의 융합, v.5 no.3, 2019년, pp.271 - 282

허수현 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학전공) , 박수인 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학전공) , 안규민 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학전공) , 신문삼 (을지대학교 대학원 시니어헬스케어학과 화장품약리학전공)

초록
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본 연구의 목적은 아카시아 잎의 생리활성을 평가하고 고분자 미셀과 세포투과 펩티드를 이용한 피부흡수 증진에 관한 것이다. 아카시아 잎을 열수 및 에탄올 추출한 후에, 항노화, 미백, 항균 등 다양한 생리활성을 측정하였다. 총 polyphenol 함량은 열수 추출에서 56.88 mg/g, 에탄올 추출에서 47.42 mg/g이고, DPPH radical 소거능은 농도 $1,000{\mu}g/mL$에서, 에탄올 추출물의 경우 44.24% 저해율을 나타냈고 이는 열수 추출물의 값(41.50%)보다 더 좋은 효능을 나타냈다. Elastase 저해능 실험결과에서 농도 의존성을 보였으며, 아카시아 잎 에탄올 추출물 $500{\mu}g/mL$에서 가장 높은 54.09% 저해능, 열수 추출물은 36.95% 저해능을 보였다. SOD 유사 활성능 결과에서 농도 의존적인 결과를 보였고, 모든 농도에서 아카시아 잎 에탄올 추출물이 열수 추출물의 값보다 높았다. $500{\mu}g/mL$에서 76.41%, 같은 농도에서 아카시아 잎 에탄올 추출에서 86.31%로 더욱 높은 활성을 나타냈다. Tyrosinase 저해능 실험에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 20 mg/mL에서 56.47% 저해율, 아카시아 잎 열수 추출물은 23.05% 저해율이 나타났다. 항균실험 결과에서는 아카시아 열수 추출물은 항균효과를 나타내지 못했지만, 아카시아 에탄올 추출물은 P ropionbacterium acnes 균주에서 11.00 mm의 최대 clear zone을, Bacillus subtilis 균주에선 10.50 mm로 최대 clear zone을 제시하였다. 난용성 문제와 피부 흡수율을 증진시키기 위하여, 아카시아 에탄올 추출물과 1.0% 세포투과 펩티드(6개 알르기닌, R6)을 함유한 108.23, 126.47 nm로 약 1/10배 미세한 나노입자 크기를 갖는 PCL-PEG 고분자 미셀이 성공적으로 제조되었고, 우수한 경피흡수 증진 효과를 나타낼 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to evaluate physiological activity of Robinia pseudo-acacia leaf and its skin penetration using polymer micelles and skin penetrating peptide. After extraction with Robinia pseudo-acacia using the ethanol and distilled water, various physiological activities were examined. The total concentration of polyphenol compounds was determined to be 47.42 mg/g (ethanol extract), 56.88 mg/g (hydrothermal extract) and DPPH radical scavenging ability at $1,000{\mu}g/mL$ was 44.24% in ethanol extract and it is higher than value(41.50%) in hydrothermal extract. The elastase inhibitory assay showed concentration dependence and elastase inhibition of Robinia pseudo acacia leaf ethanol extract was 54.09%, which was the highest at $500{\mu}g/mL$. In the SOD-like experiments, the concentration-dependent results were showed and the SOD-like activity of the Robinia pseudo-acacia leaf ethanol extract was higher than that of the Robinia pseudo acacia leaf hydrothermal extract at all concentrations. At a concentration of $500{\mu}g/mL$, Robinia pseudo acacia leaf ethanol extract showed the highest SOD-like activity of 76.41%. The tyrosinase inhibition at $20{\mu}g/mL$ was determined to be 56.47% (ethanol extract), 23.05% (hydrothermal extract). In the antimicrobial experiments, the hydrothermal extract had no effect, but ethanol extract represented maximum clear zone of 11.00 mm in Propionbacterium acnes strain and maximum clear zone of 10.50 mm. in Bacillus subtilis strain. To solve the problem of insolubility and to improve skin penetration, PCL-PEG polymer micelles containing Robinia pseudo-acacia leaf ethanol extracts and 1.0% cell permeable peptide, hexa-D-arginine (R6) were successfully prepared with particle size of 108.23 and 126.47 nm and excellent skin permeation effects could be showed.

주제어

표/그림 (12)

표 표 1. 항균시험에 사용된 균주와 배양 조건목록 Table 1. List of strains and cultivation condition used for antimicrobial experiments
표 표 2. 아카시아 잎 분석을 위한 조건 Table 2. HPLC operation conditions for determination of acacia leaf
그림 그림 1. 아카시아 잎 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(%) Figure 1. DPPH radical scavenging activity of AWE, AEE.
표 표 3. 아카시아 잎으로부터의 총 polyphenol 함량 Table 3. The Contents of Total Polyphenols of Water and Ethanolic Extract from Acaia.
그림 그림 2. 아카시아 잎 추출물의 Elastase 저해 활성능 Figure 2. Inhibition of Elastase of AWE, AEE.
그림 그림 3. 아카시아 잎 추출물의 SOD 유사활성능 Figure 3. SOD-like activity scavenging of AWE, AEE.
그림 그림 4. 아카시아 잎 추출물의 Tyrosinase 저해 활성능 Figure 4. Inhibition of mushroom tyrosinase of AWE, AEE
표 표 4. 아카시아 잎 추출물의 Propionbacterium acnes 균주에 대한 항균 clear zone 효능 Table 4. The effect of AWE, AEE amount on area of clear zone against Propionbacterium acnes.
표 표 5. 아카시아 잎 추출물의 Bacillus subtilis 균주에 대한 항균 clear zone 효능 Table 5. The effect of AWE, AEE amount on area of clear zone against Bacillus subtilis.
표 표 6. 아카시아 잎 에탄올 추출물과 1.0%의 PCL-PEG 고분자 미셀 함유, 그리고 세포투과 펩티드 R6 혼합 PCL-PEG 고분자 미셀 함유시 각각의 입도 크기 Table 6. Particle size of AEE 1.0% water and ethanol (1:1) solution, AEE 1.0% PCL-PEG polymer micelle and AEE 1.0% PCL-PEG polymer micelle containing cell penetrating peptide R6.
표 표 7. 아카시아 잎 에탄올 추출물과 고분자 미셀, 세포투과 펩티드 혼합 고분자 미셀의 누적된 침투 함유량 Table 7. Cumulative amount permeated of Acacia Ethanol Extract., its polymer micelle and its polymer micelle containing cell penetrating peptide, R6 .
그림 그림 5. 아카시아 잎 에탄올 추출물과 고분자 미셀, 세포투과 펩티드 혼합 고분자 미셀의 누적된 침투 함유량 Figure 5. Cumulative amount permeated of Acacia Ethanol Extract, its polymer micelle and its polymer micelle containing cell penetrating peptide.

AI 본문요약
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문제 정의

높은 생리 활성을 갖는 아카시아 잎 에탄올 추출물을 가용화했지만 표피 각질층의 피부 장벽 기능으로 경피 투과도는 여전히 낮을 것이라고 생각하여 이에 세포투과 펩티드인 R6를 이용하여 경피 투과도를 증진시키고자 하였다. 세포막 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptide, CPP)는 양이온성 아미노산인 arginine이 높은비율로 구성되어 있어 이는 세포 내 투과 성능을 높임을 알 수 있다.
이는 PCL과 PEG의 배합비를 다양하게 조절하여 다양한 난용성 물질을 가용화시킬 수 있고, 생체적합성 고분자라는 장점이 있다. 따라서 본 실험에서는 AEE(Acacia Ethanol Extract) 1.0% 함유 PCL-PEG고분자 미셀, 세포투과 펩티드(R6) 0.1%를 혼합한 AEE1.0% 함유 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하여 난용성인아카시아 잎 에탄올 추출물을 가용화시키는 데 성공하였다. 이를 AEE 1.
따라서 본 연구에서는 아카시아 잎을 대상으로 열수(hot water)와 에탄올(EtOH)로 추출하고, 생리 활성을 확인하기 위해 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 항산화(총 polyphenol 함량, DPPH radical 소거능, SOD 유사 활성능), 주름 개선(elastase 활성 저해능), 미백(tyrosinase 활성 저해능) 활성을 측정하고자 하였고, (2) 난용성인 아카시아 잎 에탄올 추출물을 가용화시키기 위해 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하고자 하였으며, (3) 아카시아 잎 에탄올 추출물의 피부 흡수를 증진시키기 위해 세포투과 펩티드인 R6 (hexa-Darginine)를 함께 적용하여 경피 투과도 증가를 확인하고자 하였다. 이를 통하여 아카시아 잎 에탄올 추출물의 기능성 화장품 천연 신소재로써 활용 가능성을 제시하고자 한다.
따라서 본 연구에서는 아카시아 잎을 대상으로 열수(hot water)와 에탄올(EtOH)로 추출하고, 생리 활성을 확인하기 위해 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 항산화(총 polyphenol 함량, DPPH radical 소거능, SOD 유사 활성능), 주름 개선(elastase 활성 저해능), 미백(tyrosinase 활성 저해능) 활성을 측정하고자 하였고, (2) 난용성인 아카시아 잎 에탄올 추출물을 가용화시키기 위해 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하고자 하였으며, (3) 아카시아 잎 에탄올 추출물의 피부 흡수를 증진시키기 위해 세포투과 펩티드인 R6 (hexa-Darginine)를 함께 적용하여 경피 투과도 증가를 확인하고자 하였다. 이를 통하여 아카시아 잎 에탄올 추출물의 기능성 화장품 천연 신소재로써 활용 가능성을 제시하고자 한다.

제안 방법

5 mMtyrosine (Sigma, T3754)을 40 μL씩 첨가하고 15분 동안 암실에서 반응시켰다. 490 nm에서 흡광도를 측정하고 tyrosinase 효소 활성 억제율을 구하였다. 양성 대조군으로 kojic acid를 사용하였으며 음성 대조군으로 tyrosinase 대신 0.
Elastase 활성 저해능은 EnzChek elastase assay kit(ThermoFisher, USA)를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 1xReaction buffer로 희석한 시료를 50μL씩 분주 후 100 ㎍/㎖ DQ elastin solution을 50 ul 넣어준다.
Tyrosinase 저해 활성 측정은 Kubo 등의 방법을 응용하여 측정하였다[13]. Tyrosinase 활성 억제 측정은 96 well을 사용하여 흡광도를 측정하였다. 96-well micro plate에 0.
Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 반응에서 pyrogallol은 무레 존재하는 uperoxide radical에 의해 자동 산화가 일어나 갈색 물질을 형성하여 이를 분광광도계로 분석하고, superoxide 포착 활성이 있는 물질이 존재 시 pyrogallol의 산화 속도가 낮아지는 원리를 이용하여 superoxide 포착활성을 간접적으로 측정할 수있다[11, 12]. 각 아카시아 잎의 SOD 유사 활성능은 Superoxide Anion Assay Kit(Sigma aldrich, USA)를이용하여 측정하였다. 일정 농도로 희석한 시료 20 μL에 WST working solution을 200 μL 가하고, enzyme working solution을 20 μL 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다.
경피 투과도는 Franz Diffusion Cells and Systems(PermeGear, USA)를 이용하여 측정하였다. 인공피부 Neoderm®-E(Tegoscience, Korea)를 receptor chamber 위에 각질층이 위를 향하도록 놓고, donor chamber를 각질층 위에 올려 고정시킨 후 receptor chamber에 receptor medium인 PBS(Sigma aldrich, USA)를 8.
세포막과 피부 각질 세포간 지질은 모두 지질 이중층 구조로 유사하기 때문에 세포투과 펩티드를 경피 투과에 적용할 수 있을 것이라 사료된다. 따라서 본 실험에서는 AEE(Acacia Ethanol Extract) 1.0%함유 에탄올과 증류수 1:1 혼합 용매, AEE 1.0% 함유PCL-PEG 고분자 미셀, 세포투과 펩티드 R6 0.1%를 혼합한 AEE 1% 함유 PCL-PEG 고분자 미셀을 대상으로 경피 투과도를 측정하였다.
47 nm로 입자크기를 1/10배로 줄일 수 있었다. 따라서PCL-PEG 고분자 미셀을 이용해 난용성인 아카시아 잎에탄올 추출물을 가용화에 성공하였고, 입자크기의 감소로 경피 투과도도 향상될 것으로 기대하고 경피흡수실험을 진행하였다.
본 연구에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물을 대상으로 polyphenol 화합물의 함량 및 항노화, 미백, 항균 등다양한 생리 활성을 확인할 수 있었고, 생분해성을 갖는 양친매성 PCL-PEG를 사용하여 제형 안정성을 높이고, 효능을 극대화하기 위해 세포투과 펩티드(R6)를이용하여 피부 투과도를 증가시켰다. 아카시아 잎 에탄올 추출물의 천연 기능성 화장품 소재로써 가능성을 확인하였고, 이를 활용한 기능성 화장품의 제조·활용 및이 분야 연구의 기초 자료로 활용하는 데 있어 매우 유용한 천연소재로써 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 아카시아 잎 열수 및 에탄올 추출물에 대한 생리활성을 평가하였고, 고분자 미셀과 세포투과펩티드를 이용하여 난용성 약물의 가용화, 안정화, 나노입자수준으로 입자크기 감소 및 피부흡수의 증가효과를 확인하였다.
아카시아 잎을 열수 및 에탄올 추출공정을 이용해 각각 추출하였다. 열수 추출방법은 아카시아 잎 분말에 정제수를 가하여 80 ℃ 항온조에서 4시간 동안 추출하고 종이 여과지를 이용하여 감압 여과한 다음, 동결건조기(Freeze dryer, ilShin, Korea)로 동결 건조하여 분말을 얻었다.
양성 대조군으로 kojic acid를 사용하였으며 음성 대조군으로 tyrosinase 대신 0.1 M sodium phosphate buffer를 20 μ L씩 동일하게 분주하였다.
양성 대조군으로는 N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-chloromethylketone를 사용하였으며 음성 대조군으로 elastase 효소액 대신 100 mM 1 xReaction buffer를 50 μL씩 분주하였다.
열수 추출방법은 아카시아 잎 분말에 정제수를 가하여 80 ℃ 항온조에서 4시간 동안 추출하고 종이 여과지를 이용하여 감압 여과한 다음, 동결건조기(Freeze dryer, ilShin, Korea)로 동결 건조하여 분말을 얻었다. 에탄올 추출물은 아카시아 잎 분말에 85% 에탄올을 가하여 3일 동안 추출하여 종이 여과지를 이용하여 감압 여과하였다. 그 후 감압 농축기(Eyela, Japan) 농축 과정을 거쳐 동결건조기로 동결 건조하여 분말을 얻었다.
아카시아 잎을 열수 및 에탄올 추출공정을 이용해 각각 추출하였다. 열수 추출방법은 아카시아 잎 분말에 정제수를 가하여 80 ℃ 항온조에서 4시간 동안 추출하고 종이 여과지를 이용하여 감압 여과한 다음, 동결건조기(Freeze dryer, ilShin, Korea)로 동결 건조하여 분말을 얻었다. 에탄올 추출물은 아카시아 잎 분말에 85% 에탄올을 가하여 3일 동안 추출하여 종이 여과지를 이용하여 감압 여과하였다.
하지만 아카시아 잎 에탄올 추출물은 난용성 성분을 함유하고 있어 제형에 어려운 문제를 갖고 있으며, 피부흡수의 어려움을 지니고 있다. 이것을 해결하고자 PCL-PEG 고분자 미셀을 적용하여 수용액에 가용화하고 세포투과펩티드(R6)를 이용하여 경피투과를 증진하고자 하였다. PCL-PEG는 소수성 PCL과 친수성 PEG의 공중합체로, 양친매성을 가지므로 수용액 상에서 미셀을 형성하여 소수성의 물질을포집할 수 있다.
6⨯150nm, Waters, USA)를, 펌프는 pump(SP930D, Youngin, Korea)을, 검출기는dectector(UV730D, Youngin, Korea)을 이용하였으며 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 이동상은 solvent A(water :formic acid = 99.9 : 0.1, v/v)와 solvent B(acetonitile :formic = 99.92 : 0.08, v/v)를 사용하여 0.3 mL/min에서 0.5mL/min의 유속으로 10분간 분석하였으며, 6.8 retention time에서 3,5-dihydroxy benzoic acid이 검출되었다. 자세한 분석조건은 Table 2에 제시하였다.
0% 함유 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하여 난용성인아카시아 잎 에탄올 추출물을 가용화시키는 데 성공하였다. 이를 AEE 1.0% 함유 에탄올과 증류수 1:1 혼합용매와 비교하여 입도 분석을 진행하였고 그 결과는Table 6에 제시하였다. 고분자 미셀을 함유하지 않은아카시아 잎 추출물(AEE)의 입자크기는 1,060.
인공피부 Neoderm®-E(Tegoscience, Korea)를 receptor chamber 위에 각질층이 위를 향하도록 놓고, donor chamber를 각질층 위에 올려 고정시킨 후 receptor chamber에 receptor medium인 PBS(Sigma aldrich, USA)를 8.5 mL 채워주었다.
일정 농도로 희석한 시료 100 μL에 Folin-Denis’ reagent(Sigma aldrich,USA)를 100 μL 가하여 3분간 반응시킨 후 10% Na2CO3를 100 μL 첨가하였다.
, Korea) 혼합한 PCL-PEG 고분자 미셀은 R6를 첨가한 후 증류수로 최종 무게를 맞췄다. 입도는 Dynamic Light Scattering System(Microtrac, USA)를 이용하여 측정하였다.
지표성분은 3,5-dihydroxy benzoic acid(Sigma aldrich, USA)로 설정하였고, 분석기기는 HPLC(Acme 9000, Youngin, Korea)이며, 컬럼은 SunfireTMC18 (3.5µm 4.6⨯150nm, Waters, USA)를, 펌프는 pump(SP930D, Youngin, Korea)을, 검출기는dectector(UV730D, Youngin, Korea)을 이용하였으며 280nm에서 흡광도를 측정하였다.
투과된 시료가 균일하게 혼합되도록 stirbar는 500 rpm을 유지하면서 4, 8, 12, 16, 20, 24시간 후에 각각 sampling port를 통해 시료가 용해되어있는 receptor medium을 500 μL 채취하고, 동량의 receptor medium을 보충하였다. 채취한 receptor medium은 HPLC를 이용하여 정량하였다[15]. 지표성분은 3,5-dihydroxy benzoic acid(Sigma aldrich, USA)로 설정하였고, 분석기기는 HPLC(Acme 9000, Youngin, Korea)이며, 컬럼은 SunfireTMC18 (3.
투과된 시료가 균일하게 혼합되도록 stirbar는 500 rpm을 유지하면서 4, 8, 12, 16, 20, 24시간 후에 각각 sampling port를 통해 시료가 용해되어있는 receptor medium을 500 μL 채취하고, 동량의 receptor medium을 보충하였다.

대상 데이터

PCL-PEG 고분자(Mn=2,500, Mw=2,500 ; PCL와 PEG 비율 1:1)는 Sigma aldrich (USA) 에서 구매하였으며, R6(hexa-D-arginine)는 DermafirmCo. (Seongnam, Korea)에서 구입하였다.
, Gimpo, Korea), 항온기(ChangShin Science,Seoul, Korea)이다. PCL-PEG 고분자(Mn=2,500, Mw=2,500 ; PCL와 PEG 비율 1:1)는 Sigma aldrich (USA) 에서 구매하였으며, R6(hexa-D-arginine)는 DermafirmCo. (Seongnam, Korea)에서 구입하였다.
PCL-PEG(Sigma aldrich, USA)는 Mn=2,500, Mw=2,500,PCL과 PEG 비율 1:1을 사용하였고, PCL-PEG 고분자 미셀의 제조 과정은 다음과 같다. 교반기로 60 ℃에서 에탄올(Samchun Chemicals, Korea)에 PCL-PEG를 시료 무게 대비 5배 녹인 후, 시료를 가하여 완전히 용해시키고, 감압 농축기로 에탄올을 모두 휘발시킨 후 정제수로 최종 무게를 맞췄다.
August 31, 2019. pISSN 2384-0358, eISSN 2384-0366- 275 -subtilis, Propionibacterium acnes는 한국미생물 보존센터(KCCM)와 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 균주인 Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Bacillus subtilis는 Muller-Hinton medium을 사용하여 37 ℃에서 24시간 배양 후 1회 재배양 후에 분광 광도계를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 맞추어 사용하였다.
교반기로 60 ℃에서 에탄올(Samchun Chemicals, Korea)에 PCL-PEG를 시료 무게 대비 5배 녹인 후, 시료를 가하여 완전히 용해시키고, 감압 농축기로 에탄올을 모두 휘발시킨 후 정제수로 최종 무게를 맞췄다. 세포투과 펩티드 hexa-D-arginine인 R6(DermafirmCo., Korea) 혼합한 PCL-PEG 고분자 미셀은 R6를 첨가한 후 증류수로 최종 무게를 맞췄다. 입도는 Dynamic Light Scattering System(Microtrac, USA)를 이용하여 측정하였다.
pISSN 2384-0358, eISSN 2384-0366- 275 -subtilis, Propionibacterium acnes는 한국미생물 보존센터(KCCM)와 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용된 균주인 Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Bacillus subtilis는 Muller-Hinton medium을 사용하여 37 ℃에서 24시간 배양 후 1회 재배양 후에 분광 광도계를 사용하여 600 nm에서 흡광도를 맞추어 사용하였다. 그리고 Propionibacteriumacnes는 Reinforced closridial medium을 사용하였으며 가스팩을 밀폐용기에 넣어 혐기성 환경을 만들어 준 후 밀폐용기에서 72시간 배양 후 1회 재배양 후 분광광도계를 사용해 600 nm에서 흡광도를 맞추어 사용하였다.
DPPH radical은 페놀성 화합물, 방향족 아민류 등에 의해 수소 및 전자를 받으면 보라색빛을 띠는 라디칼로서 항산화 물질과 반응하면 노란빛으로 변하는 특징을 가지고 있다[16]. 아카시아 잎 추출물 AWE(Acacia water extract), AEE(Acacia ethanolextract)에서 측정한 실험을 진행하였고 그 결과는 Figure 1에 나타내었다. 125 ~ 1,000 μg/mL에 따라 DPPH radical 소거능 결과에서는 아카시아 잎 에탄올,열수 추출물에서 농도 의존적인 결과를 보였으며, 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 1,000 μg/mL에서 44.
그리고 Propionibacteriumacnes는 Reinforced closridial medium을 사용하였으며 가스팩을 밀폐용기에 넣어 혐기성 환경을 만들어 준 후 밀폐용기에서 72시간 배양 후 1회 재배양 후 분광광도계를 사용해 600 nm에서 흡광도를 맞추어 사용하였다. 양성 대조군으로 Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis는 methyl paraben을,Propionibacterium acnes는 salicylic acid를 사용하였다. 배양조건은 Table 1에 나타내었다.
45 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 용액 120 μL을 넣고 암실에서 30분 반응 후 Multi-Mode Microplate Reader로 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 ascorbic acid를 사용하였다.
항산화 실험과 미백실험, 항균시험에 사용된 polyphenol, DPPH, Elastase, Tyrosinase, SOD 등 각 실험 제조에 사용된 용액은 Sigma aldrich(USA)의 제품을 사용하였고 실험에 사용한 기기는 흡수 분광광도계(SYNERGY HTX multi-mode reader, Bio Tek,Seoul, Korea), 원심분리기(Supra-25K, Hanil Scientific Inc., Gimpo, Korea), 항온기(ChangShin Science,Seoul, Korea)이다. PCL-PEG 고분자(Mn=2,500, Mw=2,500 ; PCL와 PEG 비율 1:1)는 Sigma aldrich (USA) 에서 구매하였으며, R6(hexa-D-arginine)는 DermafirmCo.

데이터처리

항균 시험을 제외한 모든 실험은 각 세 번의 반복적인 실험을 통하여 결과를 얻었고, 실험에 의해 얻어진값들의 평균±표준편차로 나타내었다. 통계분석은 SPSS프로그램(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용해 독립표본 t 검정과 일원 배치 분산분석(analysis of variance,ANOYA)을 하였다.
항균 시험을 제외한 모든 실험은 각 세 번의 반복적인 실험을 통하여 결과를 얻었고, 실험에 의해 얻어진값들의 평균±표준편차로 나타내었다.

이론/모형

안정한 라디칼인 DPPH는 산화방지 Physiological Activity of Robinia pseudo-acacia Leaf Extracts and Enhancement of Skin Permeation Using Polymer Micelles andCell Penetrating Peptide- 274 -물질로부터 전자 혹은 수소를 제공받으면 non-radical로 전환된다. DPPH radical scavenging을 이용한 항산화 효과의 측정은 Blois의 방법에 따라 측정하였다[10]. 추출물 용액 100 μL에 0.
총 폴리페놀(total polyphenol content) 측정법은 시료의 항산화능력을 측정하는 방법은 아니지만, 시료에 함유되어 있는 폴리페놀 화합물의 양을 측정함으로써 항산화능력을 예측할 수 있으므로 항산화 연구에 폭넓게 이용되는 방법이다. polyphenol의 정량은 Folindanis의 방법에 따라 측정하였다[8]. 일정 농도로 희석한 시료 100 μL에 Folin-Denis’ reagent(Sigma aldrich,USA)를 100 μL 가하여 3분간 반응시킨 후 10% Na2CO3를 100 μL 첨가하였다.
아카시아 잎 열수 및 에탄올 추출물의 항균 활성을 측정하기 위해서 disc diffusion test를 시행하였다[14]. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus The Journal of the Convergence on Culture Technology (JCCT) Vol.
항균시험은 4개 균주(Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Bacillus subtilis, Propionibacteriumacnes)에 대하여 paper disc 법을 이용하여 3회 실험 후저해영역(clear zone)을 측정한 결과를 Table 4와 Table5에 나타내었다.

성능/효과

125 ~ 1,000 μg/mL에 따라 DPPH radical 소거능 결과에서는 아카시아 잎 에탄올,열수 추출물에서 농도 의존적인 결과를 보였으며, 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 1,000 μg/mL에서 44.24%저해율을 보였고 같은 농도에서 아카시아 잎 열수 추출물은 41.50% 저해율을 보였다.
4시간에서 AEE, AEE 고분자 미셀, R6 혼합 AEE고분자 미셀의 투과량은 각각 14.85, 20.99, 29.97 μg/cm²으로 AEE에 비해, 고분자 미셀은 약 1.43배, R6혼합 고분자 미셀은 약 2.02배 많은 양이 투과되었다.
62.5 ~ 500 μg/mL에, 따라 농도 의존적인 결과를 보이고 있고, 농도 500 μg/mL에서, 열수추출물의 SOD 활성능은 76.41%이고, 에탄올추출물의 SOD 활성능은86.31%로 더 좋은 SOD 유사활성을 나타내었다.
그 경피 투과도 실험결과는 Table 7과 Figure 5에 제시하였다. AEE, AEE 고분자 미셀, R6 혼합 AEE 고분자 미셀의 3가지 모든 경우에, 4시간에서 투과량이 급격히 상승한 후 24시간에서는 완만한 상승세를 보였다.
00mm의 clear zone으로 가장 높은 항균효능을 나타내었다(Table 4). Bacillus subtilis 균주에서는 에탄올 추출물(AEE) 5.0 mg/mL에서 가장 높은 항균력인 10.50mm의 clear zone을 보였다(Table 5). 이 결과는 아카시아 잎 에탄올 추출물에서 보다 많은 항균 유효성분을 함유하는 것으로 생각된다.
DPPH radical 소거능 실험에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 1,000μg/mL에서 44.24% 저해율을 보였고 같은 농도에서 아카시아 잎 열수 추출물은 41.50% 저해율을 나타냈다.
SOD 유사활성능 결과에서는 아카시아 잎 열수 추출물 농도 500 μg/mL에서 76.41%, 같은 농도에서 아카시아 잎 에탄올추출에서 86.31% 로 더욱 높은 활성을 나타냈다.
0% 함유 에탄올과 증류수 1:1 혼합용매와 비교하여 입도 분석을 진행하였고 그 결과는Table 6에 제시하였다. 고분자 미셀을 함유하지 않은아카시아 잎 추출물(AEE)의 입자크기는 1,060.00 nm이지만, AEE 1.0% PCL-PEG 미셀, R6 0.1% 혼합 AEE1.0% PCL-PEG 미셀의 입도는 각각 108.23, 126.47 nm로 입자크기를 1/10배로 줄일 수 있었다. 따라서PCL-PEG 고분자 미셀을 이용해 난용성인 아카시아 잎에탄올 추출물을 가용화에 성공하였고, 입자크기의 감소로 경피 투과도도 향상될 것으로 기대하고 경피흡수실험을 진행하였다.
56배 많은 양이 투과되었다. 그러므로 PCL-PEG 고분자미셀로 가용화시키면 입도의 감소로 경피 투과도가증가하고, 여기에 세포투과 펩티드인 R6를 함께 적용하면 경피 투과도가 상당량 증가하는 것을 알 수있었다.
또한 24시간에서 AEE, AEE 고분자 미셀, R6 혼합AEE 고분자 미셀의 누적 투과량은 각각 35.72,46.58, 55.65 μg/cm²으로 AEE에 비해, 고분자 미셀은 약 1.19배, R6 혼합 고분자 미셀은 약 1.56배 많은 양이 투과되었다.
또한, 아카시아 잎 에탄올 추출물, PCL-PEG 고분자 미셀적용, 세포투과펩티드(R6)를 함유한 PCL-PEG 고분자미셀의 24시간 최종 누적 투과량은 각각 35.72 μg/cm²,46.58 μg/cm², 55.65 μg/cm²으로 증가괸 경피흡수 결과를 확인하였다.
모든 농도에서 에탄올 추출물이 더 좋은 효과를 나타냈었으며, 농도500 μg/mL에서 아카시아 잎 에탄올 추출물은 54.09%저해율을 보였고, 아카시아 잎 열수 추출물은 36.95% 저해율을 나타내었다.
미백기능에 효과를 나타내는 Tyrosinase 실험에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 20 μg/mL에서 56.47% 저해율을 보였고 같은 농도에서 아카시아 잎 열수 추출물은23.05% 저해율이 나타났다.
아카시아 잎 열수 추출물(AWE)은 4개 균에 clearzone을 나타내지 않았으며, 에탄올 추출물(AEE)은 2개균주(Propionbacterium acnes, Bacillus subtilis)에서 효과를 확인할 수 있었는데, Propionbacterium acnes 균주에서 에탄올 추출물(AEE) 10.0 mg/mL에서 11.00mm의 clear zone으로 가장 높은 항균효능을 나타내었다(Table 4). Bacillus subtilis 균주에서는 에탄올 추출물(AEE) 5.
아카시아 잎은 항산화, 미백 활성, 항균 효과를 나타내고 있으며, 폴리페놀 함량 실험을 제외한 대부분의 실험 결과에서, 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 더 좋은생리활성 효과를 확인하였다. 하지만 아카시아 잎 에탄올 추출물은 난용성 성분을 함유하고 있어 제형에 어려운 문제를 갖고 있으며, 피부흡수의 어려움을 지니고 있다.
이를 바탕으로 총 polyphenol 함량 실험을 제외한 대부분 항산화, 미백, 항균실험에서 아카시아 잎 에탄올추출이 열수 추출보다 우수함을 확인하였다. 아카시아잎 에탄올 추출물의 난용성과 경피흡수의 어려움을 해결하기 위해 PCL-PEG 고분자 미셀과 세포투과펩티드(R6)를 적용한 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하여 아카시아 잎 에탄올 추출물을 100 nm 내외로 가용화시키는데 성공하였고 입자크기도 각각 108.23, 126.47 nm로약 1/10배 미세한 나노입자 크기를 얻을 수 있었다. 또한, 아카시아 잎 에탄올 추출물, PCL-PEG 고분자 미셀적용, 세포투과펩티드(R6)를 함유한 PCL-PEG 고분자미셀의 24시간 최종 누적 투과량은 각각 35.
5, 5, 10, 20 mg/mL의 농도에서 실험 결과를 Figure 4에 제시하였으며, 농도 의존성을 확인하였고 모든 농도에서 아카시아 잎 에탄올 추출물이 더 우수한 효능을 나타내었다. 아카시아잎의 Tyrosinase 저해능을 확인한 시험결과에서, 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 20 mg/mL에서 56.47% 저해율을 보였고 같은 농도에서 아카시아 잎 열수 추출물은 23.05% 저해율을 나타내었다.
50% 저해율을 보였다. 양성 대조군인 ascorbicacid에 비해 낮은 항산화 활성이 확인되었지만, 천연물기준으로 보았을 때 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었다.
이를 바탕으로 총 polyphenol 함량 실험을 제외한 대부분 항산화, 미백, 항균실험에서 아카시아 잎 에탄올추출이 열수 추출보다 우수함을 확인하였다. 아카시아잎 에탄올 추출물의 난용성과 경피흡수의 어려움을 해결하기 위해 PCL-PEG 고분자 미셀과 세포투과펩티드(R6)를 적용한 PCL-PEG 고분자 미셀을 제조하여 아카시아 잎 에탄올 추출물을 100 nm 내외로 가용화시키는데 성공하였고 입자크기도 각각 108.
주름개선에 효과를 나타내는 elastase 저해능 결과에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 500 μg/mL에서54.09% 저해율을 보였고 같은 농도에서 아카시아 잎 열수 추출물은 36.95% 저해율을 확인하였다.
65 μg/cm²으로 증가괸 경피흡수 결과를 확인하였다. 즉, PCL-PEG 고분자 미셀로 가용화시키면, 입자크기 감소로 경피 투과도가 증가하고, 여기에 세포투과 펩티드인 R6를 함께 적용하면, 경피 투과도가 훨씬 더 증가하는 것을 알 수 있었다.
총 polyphenol 함량은 열수 추출에서 56.88 ㎎/g, 에탄올 추출에서 47.42 ㎎/g으로 분석되었고 열수 추출에서더 많은 polyphenol 함량을 나타냈다. DPPH radical 소거능 실험에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물 농도 1,000μg/mL에서 44.
05% 저해율이 나타났다. 항균 시험의 경우 아카시아잎 열수 추출은 4개 모든 균주에서 clear zone을 확인할수 없었지만, 에탄올 추출물은 Propionbacterium acnes균주에서 11.00 mm의 최대 clear zone을, Bacillussubtilis 균주에선 10.50 mm의 최대 clear zone을 나타내었다.

후속연구

세포막 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptide, CPP)는 양이온성 아미노산인 arginine이 높은비율로 구성되어 있어 이는 세포 내 투과 성능을 높임을 알 수 있다. 세포막과 피부 각질 세포간 지질은 모두 지질 이중층 구조로 유사하기 때문에 세포투과 펩티드를 경피 투과에 적용할 수 있을 것이라 사료된다. 따라서 본 실험에서는 AEE(Acacia Ethanol Extract) 1.
세포투과 펩티드는 주로 세포막을 투과하는 연구에 집중되어 있고 피부 세포간지질을 투과하는 연구는 미미한 실정이다. 세포막과 피부 각질세포간 지질은 서로 주성분은 다르지만, 모두 지질 이중층 구조로 유사하기 때문에 세포투과 펩티드를 경피투과에 적용할 수 있고 세포투과 펩티드의 핵심 아미노산 서열인 arginine oligomer를 기능성 물질과 함께 화장품에 적용한다면 피부 흡수 증진으로 기능성 물질의 효능을 극대화 할 수 있을 것이라 기대된다.
본 연구에서는 아카시아 잎 에탄올 추출물을 대상으로 polyphenol 화합물의 함량 및 항노화, 미백, 항균 등다양한 생리 활성을 확인할 수 있었고, 생분해성을 갖는 양친매성 PCL-PEG를 사용하여 제형 안정성을 높이고, 효능을 극대화하기 위해 세포투과 펩티드(R6)를이용하여 피부 투과도를 증가시켰다. 아카시아 잎 에탄올 추출물의 천연 기능성 화장품 소재로써 가능성을 확인하였고, 이를 활용한 기능성 화장품의 제조·활용 및이 분야 연구의 기초 자료로 활용하는 데 있어 매우 유용한 천연소재로써 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아카시아란 무엇인가?	아카시아(Robinia pseudoacacia)는 아까시 나무에서 기원된 것으로 콩아과(Faboideae)에 속하는 낙엽교목이다. 아카시아의 화장품 약리효과에 대한 연구로는 아카시아 꽃을 대상으로 한 연구가 일부 되어 있지만[4], 아카시아 잎을 대상으로 한 연구는 부족하며 이에 대한 화장품 약리효과를 측정하며 기능성 화장품의 천연 신소재로써 이용될 수 있는 가능성이 충분할 것이다.
	화장품의 확대된 기능은 무엇인가?	또한 고령화 사회로 접어들면서 노화에 대처하기 위한 화장품의 역할은 점점 커지고 있다. 화장품을 단순히 인체를 아름답게 하며 청결을 위한 제품에서, 이제는 피부 또는 모발을 건강하게 유지시키며 미백효과로 인한 기미제거와 피부 노화를 개선하고 지연시키기 위한 주름제거, 보습, 보호 및 피부 활성의 부분으로 접근이 이루어지고 있다. 이러한 관심이 높아짐에 따라 항산화 효과와 항균활성을 나타내는 활성 성분에 관심이 집중되고 있는 반면 의약품이나 화장품 분야 등에서 많이 활용되고 있는 활성 성분은 주로 합성 물질이다.
	생리활성물질이 난용성이라는 특성을 가지기 때문에 발생할 수 있는 문제점은 무엇인가?	천연 신소재에 존재하는 많은 생리활성물질이 난용성으로 수용액에 용해되지 않아 유기용매를 사용하여 용해시켜야 한다. 이는 피부에 자극이 될 수 있어 안전성 문제가 대두되고 피부와의 접촉면적이 적어 피부로의 흡수, 전달이 잘 되지 않는다. 이를 생분해성을 갖는양친매성(amphiphilic) 자기 회합형 나노구조체(selfassembled nano structure)인 PCL(polycaprolactone)-PEG(polyethyleneglycol) 고분자 미셀을 이용하여 난용성 물질을 수용액에 가용화를 할 수 있다[5].

저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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