[논문]금속전달 유전자(MTP1)의 과발현 애기장대에서 발현 위치에 따른 내성 증가 연구

김동균

doi:10.17703/jcct.2019.5.3.327

[국내논문] 금속전달 유전자(MTP1)의 과발현 애기장대에서 발현 위치에 따른 내성 증가 연구
Overexpression of the Metal Transport Protein1 gene (MTP1) in Arabidopsis Increased tolerance by expression site 원문보기

Journal of the convergence on culture technology : JCCT = 문화기술의 융합, v.5 no.3, 2019년, pp.327 - 332

초록
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현대 과학자들은 식물정화공정과 같은 새로운 기술로 중금속을 제거하려고 한다. 이런 최첨단 기술 중 하나는 토양의 특정 중금속을 제거하는 형질 전환 식물을 개발하는 것이다. 본 연구자는 T. goingense Metal Transport Protein 1 유전자와 TgMTP1 : GFP 유전자를 발현하는 형질 전환 벡터를 구축했다. 형질전환체 식물을 선택하여 형질 전환 된 유전자를 애기 장대 게놈에서 확인했다. 발현은 Arabidopsis 세포, 조직 및 기관의 여러 부분에서 확인되었다. Arabidopsis thaliana에서 TgMTP1 과발현하는 식물에 중금속이온이 처리되었을 때 형질 전환 식물체는 비 형질 전환 체보다 중금속 내성이 높았다. 추가 연구를 위해 4 (Zn, Ni, Co, Cd.)가지 중금속에 대한 내성이 향상된 형질 전환 식물을 선택했다. 선택된 T3 TgMTP1 과다 발현 애기 장대 식물은 중금속에 내성이 증가된다. 이 식물은 액포 내에 중금속을 축적하고 동시에 원형질막에 발현되는 MTP1 유전자의 발현을 특징으로 한다. 결론적으로, 이러한 식물은 식물 정화 응용 분야 및 내성이 증가 된 식물로 사용될 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Today's scientists try to remove heavy metals with many new technologies such as phytoremediation. One of the best cutting edge technologies is developing transgenic plants to remove certain heavy metal in soil. I constructed the transformation vector expressing T. goesingense Metal Transport Protein1 gene and TgMTP1: GFP genes. The transgenic plants were selected and confirmed the transformed genes into Arabidopsis thaliana genome. Expression was confirmed in several parts in Arabidopsis cells, tissues and organs. When TgMTP1 overexpressing Arabidopsis thaliana were subjected, transgenic plants showed higher heavy metal tolerance than non-transgenic. For further study I selected the transgenic plant lines with enhanced tolerance against four different heavy metals; Zn, Ni, Co, Cd. The accumulation of these metals in these plants was further analyzed. The TgMTP1 overexpressing Arabidopsis thaliana plant of selected lines are resistant against heavy metals. This plant is characterized by the expression of the MTP1 gene accumulating heavy metal in the vacuole and being simultaneously expressed on the plasma membrane. In conclusion, these plants may be used in plant purification applications, and as a plant with increased tolerance.

Keyword

표/그림 (5)

그림 그림 1. 유전자 재조합 vector 지도와 발현 분석 Figure 1.Linear map of binary vector (pCambia1302-TgMTP1 or pCambia1302-TgMTP1- GFP ) and the expression with RT-PCR. A, 35S:CaMV 35S, TgMTP1, GFP: Green Fluorescent Protein gene, NOS：Nopaline Synthase terminator, Bar gene: Phosphothiothricine acetyltransferase, LB: T-DNA left border, RB: T-DNA right border. Vector construction and transformation with TgMTP1:GFP) overexpressing transgenic plants. B, The expression of TgMTP1 in transgenic Arabidopsis thaliana plants with RT-PCR.
그림 그림 2. 발현 지역의 현미경 연구 Figure 2. Localization studies with TgMTP1:GFP overexpressing transgenic plants. Vacuolar membrane(vm), plasma membrane(pm) A sepal cell, B and C callus cell . A - C (500nm fluorescence light), D (600nm bright field), x 400 .
그림 그림 3. Plate 위에 4 종류 중금속 이온 처리 후 차이가보이는 농도에서식물들의 성장을 분석 비교 Figure 3. Plate assay for comparison between 4 different metals with overexpressing plant (TgMTP1) and WT, wild-type Arabidopsis plant (Col-0). MS media treated with cobalt 100 μM Concentration, zinc 150 μM Concentration, Nickle 50 μM Concentration, 25 μM Concentration.
그림 그림 4. Plate 위에 4 종류 중금속 이온 처리 후 여러 농도에서 식물들의 성장을 분석 비교 Figure 4.Plate assay treated with different metals : Overexpressing plant (TgMTP1, blue ) and WT, wild-type Arabidopsis plant (Col-0, white) for growth effect (A) and root development (B).0:No metal contained MS media as control, Co 50 and 100: MS media treated with cobalt 50 and 100 μM Concentration, Zn 100 and 150: MS media treated with zinc 100 and 150 μM Concentration, Ni 50 and 100: MS media treated with Nickle 50 and 100 μM Concentration, Cd 25 and 50: MS media treated with cadmium 25 and 50 μM Concentration.
그림 그림 5 Plate 위에 니케 이온 처리 후 뿌리 켈루스 성장분석 비교 Figure 5. Plate assay for root callus growth treated with Ni: mtp1, mutant of MTP1 Arabidopsis from seed stock center ABRC)

AI 본문요약
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문제 정의

최근에는 생명과학기술의 급속한 발전으로 이런 목적에 부합하는 유전공학적인 측면에서 식물체를 만들려는 시도가 가장 첨단 기술로 활발하다 [ 9,10 ]. 이는 토양 속의 중금속을 잘 흡수하는 식물을 선별하고 특이한 유전자를 발굴하여 연구한다. 이 유전자를 사용하여 유전공학적 연구과정을 거쳐서 환경 정화용으로 사용하는 방법이다.
이런 중금속을 식물 체내에 특히 액포에 과다하게 축적 할 수 있는 유전자로 MTP1이 밝혀졌다[ 4 ]. 본 연구는 TgMTP1 유전자를 과발현 시켜서 생체 내에서 중금속 축적 기작을 연구 할 것이며 환경 정화용 활용 유전자로 가능한지를 확인하고, 환경 정화공정에 필요한 식물체로써 가능한지를 논의할 것이다.
애기장대 MTP1의 발현실험에서는 줄기의 액포막에 위치하여 액포에 중금속을 축적하는 결과를 보고하였으며[ 7 ], TgMTP1을 애기장대에 과발현 연구에서도 액포에 발현되며 중금속을 축적하는 결과를 보고하였다[ 4 ]. 본 연구에서는 꽃잎과 Callus는 액포와 원형질 막에 동시발현 되는 현상을 보인다. 꽃잎 세포포의 액막에 강하게 발현되지만(Fig.
본 연구에서는 부가적으로 종이 다른 식물에 유전자 과발현 형질 전환체는 유전자 기능을 연구하는 목적과 다르게 다른 용도로 사용할 수 있는 효과가 발생할 수 있다는 것을 보여준다. 즉, MTP family 유전자의 특성에 따른 형질 전환체를 만들어 식물정화공정을 효율화시켜 토양오염을 방지할 가능성이 있다.
연구자들은 유용한 유전자를 발현하여 새로운 육종을 시도하고, 오염된 토양을 정화하는 식물정화 공정도구를 발견할 목적으로 금속 전달 유전자를 발현시켜왔다. 본 연구에서 냉이 금속전달유전자인 Tg MTP₁ 유전자를 발현시키는 벡터를 구성하여 형질전환 된 애기장대 식물체를 만들었으며 과발현 연구를 시도하였다.

제안 방법

org)에서 공급해주어서 사용하였다. 애기장대 종자시료에 미생물을 제거하기 위해서 멸균수로 세척하고 1차 표면소독을 70% 에탄올로 처리 후, 표면의 왁스가 어느 정도 제거된 후 1% sodium hypochlorite(락스) 용액으로 20분간 담가 2차 표면소독을 하였다. 그리고 강력 살균제 락스를 제거하기 위해 멸균수로 5회 반복하여 철저히 세척을 하였다.
기내에서 배양된 식물체 뿌리에서 callus를 유도하여, 형성된 callus를 계대배양하여 중금속 처리효과를 단일 세포내 성장효과를 살펴보기 위해서 plate assay하였다. 중금속효과와 세포내 성장 축적을 위해서 식물 내 미량원소이면서 과축적 할 경우 치명적 효과를 나타내는 Co, Zn, Ni, Cd을 농도 별로 처리하였다.
기내에서 배양된 식물체 뿌리에서 callus를 유도하여, 형성된 callus를 계대배양하여 중금속 처리효과를 단일 세포내 성장효과를 살펴보기 위해서 plate assay하였다. 중금속효과와 세포내 성장 축적을 위해서 식물 내 미량원소이면서 과축적 할 경우 치명적 효과를 나타내는 Co, Zn, Ni, Cd을 농도 별로 처리하였다.
5 T2 종자에서 자란 식물을 BASTA-resistant segregation 비율에 따른 Homozygous 종자를 T3 선별하였다. 일차적으로 선발된 식물체를 RT-PCR을 하였다.
일차적으로 선발된 식물체를 RT-PCR을 하였다. PCR로 형질전환이 확인된 식물체를 무작위로 선발하여 분석을 실시하였다(Fig.1B),. 시료는 배양기에서 생육중인 식물체의 잎으로부터의 RNA 분리방법에 따라 수행하였다.
중금속 처리하여 plate assay를 하기 위하여 Co, Zn, Ni, Cd을 처리하였다. 중금속 처리를 위하여 기내에서 증식시킨 식물체를 생육을 위해 기내에서 꺼내어 순화한 후 pot로 옮겼다.
중금속 처리를 위하여 기내에서 증식시킨 식물체를 생육을 위해 기내에서 꺼내어 순화한 후 pot로 옮겼다. 생육 6주 된 식물체 처리실험은 미량원소가 첨가 된 수용액에 동일양을 부어주며 동일한 환경 조건에서 2 주간 배양하여 변화 정도를 조사하였다. 동일한 실험을 3회 이상 반복하였고 각각의 실험에 10개체 이상을 사용하였다.
com)가 사용되었고 형광 빛은 500와 540 nm였다. 광학현미경 해상도를 위해서 대물 렌즈를 40배로 하여 총 400배율을 사용하였다.
GFP의 발현양상이 현미경으로 조사되었다. 효과적인 중금속 내성의 원인을 탐구하기 위하여 원형질막에 위치하거나, tonoplast(액포)막에 위치하거나, 이 두 가지 발현 위치를 알아보았다. 그 결과 잎 뒷면, 꽃잎, 특별히 root에서 유도된 Callus 세포에도 발현 되었다.
많이 발현되는 식물체의 T3 line을 사용하여 여러 실험을 진행하였다. Tg MTP₁ 과발현 line에서 표현형이 확정된 T₃ line으로 Tg MTP₁ 과발현의 종자를 선별하여서 여러 중금속 저항성 실험을 실시하였다.
많이 발현되는 식물체의 T3 line을 사용하여 여러 실험을 진행하였다. Tg MTP₁ 과발현 line에서 표현형이 확정된 T₃ line으로 Tg MTP₁ 과발현의 종자를 선별하여서 여러 중금속 저항성 실험을 실시하였다. MS media에 Cd(카드미움), Co(코발트), Zn(아연), Ni(니켈) 이온들을 여러 농도에서 plate assay를 수행하였다 (Figs.
Tg MTP₁ 과발현 line에서 표현형이 확정된 T₃ line으로 Tg MTP₁ 과발현의 종자를 선별하여서 여러 중금속 저항성 실험을 실시하였다. MS media에 Cd(카드미움), Co(코발트), Zn(아연), Ni(니켈) 이온들을 여러 농도에서 plate assay를 수행하였다 (Figs. 3, 4). Tg MTP₁ 과발현 식물체는 4종류의 중금속에서 저항성을 나타내었으며, 뿌리 생장과 측근의 수에서(Fig.
길이성장은 감소하는 전형적인 생산성 증가형으로 씨앗생성과 열매생산 증가형으로 변하는 표현형이다[ 5 ]. 세포 수준에서 발현과 중금속 내성을 확인하기 위해서 Col-0야생종, Atmtp1 돌연변이종, 그리고 Tg MTP₁ 과발현 형질전환체 뿌리에서 callus를 유도하여 성장을 비교하였다. 50 µM Ni 농도배지에서 Tg MTP₁ 과발현 식물 callus가 가장 잘 자랐다.
연구자들은 유용한 유전자를 발현하여 새로운 육종을 시도하고, 오염된 토양을 정화하는 식물정화 공정도구를 발견할 목적으로 금속 전달 유전자를 발현시켜왔다. 본 연구에서 냉이 금속전달유전자인 Tg MTP₁ 유전자를 발현시키는 벡터를 구성하여 형질전환 된 애기장대 식물체를 만들었으며 과발현 연구를 시도하였다. 유전자를 과발현 시키는 line 을 선별하여서 유전자를 test하는 여러 실험을 하였다.
본 연구에서 냉이 금속전달유전자인 Tg MTP₁ 유전자를 발현시키는 벡터를 구성하여 형질전환 된 애기장대 식물체를 만들었으며 과발현 연구를 시도하였다. 유전자를 과발현 시키는 line 을 선별하여서 유전자를 test하는 여러 실험을 하였다. 특히 Tg MTP₁ 과발현 선별 line은 저항성이 증가하였다.
특히 Tg MTP₁ 과발현 선별 line은 저항성이 증가하였다. 애기장대 세포, 조직, 기관에서 여러 부분에 발현을 확인하였다. 또한 이 식물에 여러 중금속을 처리하여서 저항성을 확인하였다.
애기장대 세포, 조직, 기관에서 여러 부분에 발현을 확인하였다. 또한 이 식물에 여러 중금속을 처리하여서 저항성을 확인하였다. 이 식물체는 액포에 중금속을 축적하는 MTP₁ 유전자가 발현되고 원형질막에 동시에 발현되는 양상이어서 미래에 활용할 수 있는 식물정화공정 식물체일수 있고 내성이 증가하는 식물체로도 사용 가능함을 보여준다.

대상 데이터

애기장대 형질전환에는 Arabidopsis thaliana Col-0(CS6000)와 callus 유도용으로 mtp1 돌연변이 종자를 Arabidopsis Stock Center ABRC(http://www.arabidopsis.org)에서 공급해주어서 사용하였다. 애기장대 종자시료에 미생물을 제거하기 위해서 멸균수로 세척하고 1차 표면소독을 70% 에탄올로 처리 후, 표면의 왁스가 어느 정도 제거된 후 1% sodium hypochlorite(락스) 용액으로 20분간 담가 2차 표면소독을 하였다.
3’ 지역에 mGFP와 mHA를 연결시켜서 발현될 수 있도록 유도하였다[ 4 ]. 이것을 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 도입하였으며(Fig.1A), 또한 대조구로 이용하기 위하여 vector pCAMBIA 1302 벡터만 도입된 Agrobacterium도 준비하였다. floral dipping 방법을 사용하여 애기장대에 형질전환을 시도하였다[ 14 ].
생육 6주 된 식물체 처리실험은 미량원소가 첨가 된 수용액에 동일양을 부어주며 동일한 환경 조건에서 2 주간 배양하여 변화 정도를 조사하였다. 동일한 실험을 3회 이상 반복하였고 각각의 실험에 10개체 이상을 사용하였다.
세포내 단백질 발현을 확인하기 위해서 현미경Image는 TE 2000 (Nikon, http://www.nikon.com) inverted microscope를 사용하여 촬영하였다. GFP촬영은 488-nm line argon laser (National Laser Company, http://www.
com) inverted microscope를 사용하여 촬영하였다. GFP촬영은 488-nm line argon laser (National Laser Company, http://www.nationallaser.com)가 사용되었고 형광 빛은 500와 540 nm였다. 광학현미경 해상도를 위해서 대물 렌즈를 40배로 하여 총 400배율을 사용하였다.
식물의 binary vector 인 pCAMBIA 1302 vector에 BamHI/XbaI의 제한 효소를 이용하여 TgMTP1 유전자를 재조합하였다 [ 4 ]. 이렇게 재조합 된 vector를 애기장대 식물에 Agrobacterium tumefaciens EHA105를 사용하여 형질 전환시켰다(Fig.
세척된 종자는 MS (Murashige and Skoog) 기본배지에 발아가 잘 유도 되도록 형광 빛에서 16시간 암 8시간의 광주기의 단일식물의 조건을 맞추어, 25°C의 조건으로 발아시키고 1주일 자란 식물체를 plate assay로 사용되었고 토양으로 이식된 후 6주 된 식물체를 형질전환 재료로 사용하였다.

이론/모형

1A), 또한 대조구로 이용하기 위하여 vector pCAMBIA 1302 벡터만 도입된 Agrobacterium도 준비하였다. floral dipping 방법을 사용하여 애기장대에 형질전환을 시도하였다[ 14 ]. T0 종자는 glyphosate ammonium (Pestanal; Sigma-Aldrich)를 처리하여서 저항성 있는 T1를 종자를 선별하였다.
1B),. 시료는 배양기에서 생육중인 식물체의 잎으로부터의 RNA 분리방법에 따라 수행하였다.

성능/효과

1A). 형질 전환된 식물의 잎을 따서 RNA를 추출하고 RT-PCR 분석을 통하여 발현 정도를 분석하였고 형질전환 식물체에서는 항상 발현되어 있다는 사실을 확인하였다(Fig.1B).
효과적인 중금속 내성의 원인을 탐구하기 위하여 원형질막에 위치하거나, tonoplast(액포)막에 위치하거나, 이 두 가지 발현 위치를 알아보았다. 그 결과 잎 뒷면, 꽃잎, 특별히 root에서 유도된 Callus 세포에도 발현 되었다. 잎 뒷면, 꽃잎은 원형질막과 액포막에 발현되는 것으로 보여진다.
3, 4). Tg MTP₁ 과발현 식물체는 4종류의 중금속에서 저항성을 나타내었으며, 뿌리 생장과 측근의 수에서(Fig. 4) 더 잘 자랐다. 크기성장을 비교하면 작은 차이를 보이며 Ni plate에서는 형질 전환체가 크기가 작아지는 경향이다.
4). 이 결과들은 중금속의 스트레스로 잘 자라지 못하는 야생형 Col-0 애기장대 식물에 비해서 저항성이 있음을 입증한다.
또한 이 식물에 여러 중금속을 처리하여서 저항성을 확인하였다. 이 식물체는 액포에 중금속을 축적하는 MTP₁ 유전자가 발현되고 원형질막에 동시에 발현되는 양상이어서 미래에 활용할 수 있는 식물정화공정 식물체일수 있고 내성이 증가하는 식물체로도 사용 가능함을 보여준다.

후속연구

유사유전자를 다른 종에 발현시켜서 잘못된 위치에 발현되었거나 조직의 특수성에 의해서 발현양상이 달라진 것인지, 또는 중금속의 환경에 달라지는 것인지는 확실하지 않다. 하지만 앞으로 원형질막과 액포막을 분리한 후 막 생리적 실험을 통하여 적절한 생리적 현상을 규명할 예정이다. 그리고 Callus를 이용한 여러 중금속 배출과 축적연구를 수행한 후 구체적으로 논의할 것이다.
하지만 앞으로 원형질막과 액포막을 분리한 후 막 생리적 실험을 통하여 적절한 생리적 현상을 규명할 예정이다. 그리고 Callus를 이용한 여러 중금속 배출과 축적연구를 수행한 후 구체적으로 논의할 것이다.
즉, MTP family 유전자의 특성에 따른 형질 전환체를 만들어 식물정화공정을 효율화시켜 토양오염을 방지할 가능성이 있다. 이 유전자들을 활용하는 식물정화공정 기술은 토양환경을 정화하여 건강한 환경을 보존하기 위한 유용한 유전자원과 식물 형질전환 식물체가 미래에 중요한 관련 기술로써 그리고 향후 분석 노하우로 축적되어 다양한 방식으로 활용이 가능하여 실제 오염 정화에 활용가치가 있다고 사료 된다. 그리고 부가적으로 발생하는 유전자 효과로 유용한 미량원소를 효율적으로 흡수하는 식물을 만들어 필수 원소 결핍을 해결하는 방법으로 활용하면 인류 건강증진에 기여할 수도 있을 것이다.
이 유전자들을 활용하는 식물정화공정 기술은 토양환경을 정화하여 건강한 환경을 보존하기 위한 유용한 유전자원과 식물 형질전환 식물체가 미래에 중요한 관련 기술로써 그리고 향후 분석 노하우로 축적되어 다양한 방식으로 활용이 가능하여 실제 오염 정화에 활용가치가 있다고 사료 된다. 그리고 부가적으로 발생하는 유전자 효과로 유용한 미량원소를 효율적으로 흡수하는 식물을 만들어 필수 원소 결핍을 해결하는 방법으로 활용하면 인류 건강증진에 기여할 수도 있을 것이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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