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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 기존 임상에서 널리 쓰이고 있는 복합레진에 피톤치드를 적용하여 기계적인 물성에는 영향을 끼치지 않으면서 치아우식증의 원인균인 S. mutans에 항균 효과를 갖는 복합레진의 개발 가능성을 확인하고자 한다.
- 하지만, 피톤치드를 함유한 복합레진의 항균효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에, 본 연구의 목적은 항균효과가 있다고 알려진 피톤치드를 함유한 복합레진의 물성 및 치아우식증의 주원인균인 S. mutans 균에 대한 항균효과를 평가하고자 하는 데 있다.
제안 방법
- Broth Heart Infusion(BHI, Becton Dickinson and Co., Sparkd, MD, USA) broth를 이용해 Streptococcus mutans(S.mutans, ATCC 25175)균을 37℃에서 16시간 배양하여 활성화시켜 연속희석법을 이용하여 배양액의 균수가 1×108 /ml이 되도록 희석한 후, 100 ul를 BHI 고체배지에 도말한다.
- 광중합 후 재료를 몰드에서 분리하고 즉시 플라스틱 스파튤라를 이용하여 중합되지 않은 재료를 제거한 후 전자식 버니어캘리퍼스로 중합된 재료의 높이를 측정하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 각각 5회씩 반복하여 그 평균값을 산출하였다.
- Japan)를 사용하였고, 음성대조군은 멸균된 paper disk를 사용하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 항균력은 시편의 주변에 생기는 성장저해구역(zone of inhibition) 크기로 판별하였으며 성장저해구역의 크기가 클수록 항균력이 큰 것으로 간주하였다.
- 재료가 평탄하게 채워진 것을 확인한 후 상부에서 광조사면이 수직이 되도록 60초간 광조사하였다. 광중합 후 재료를 몰드에서 분리하고 즉시 플라스틱 스파튤라를 이용하여 중합되지 않은 재료를 제거한 후 전자식 버니어캘리퍼스로 중합된 재료의 높이를 측정하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 각각 5회씩 반복하여 그 평균값을 산출하였다.
- mutans, ATCC 25175)균을 37℃에서 16시간 배양하여 활성화시켜 연속희석법을 이용하여 배양액의 균수가 1×108 /ml이 되도록 희석한 후, 100 ul를 BHI 고체배지에 도말한다. 그 위에 양성대조군(PC), 음성대조군(NC), Control, 1.25% PTC, 2.5% PTC, 3.75% PTC, 5% PTC의 시편을 적당한 간격으로 고체배지 위에 올려 두어 37℃ incubator에서 24시간 배양시켰다. 이 때 양성대조군은 20 ul의 NaOCl을 적신 paper disk(Filter paper disc, Toyo Roshi Kaisha Ltd.
- 75, 5%를 함유하여 high-speed mixer(SpeedMixer, Hauschild, Hamm, Germany)를 사용하여 2,000 rpm으로 5분간 혼합 하여 시편을 준비하였다. 본 연구에서 피톤치드를 PTC라고 명명하였으며, 실험군은 피톤치드의 농도에 따라 Control(비함유), 1.25% PTC, 2.5% PTC, 3.75% PTC, 5% PTC군으로 선정하였다 [Table 1].
- 본 연구에서는 치과용 복합레진에 항균 물질로 피톤치드를 첨가하여 표면경도, 중합깊이, 굴곡강도, 항균실험을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 24시간 후, 시편을 새 BHI 액체 배지를 이용하여 2번 세척하고, 1 ml의 BHI 액체 배지에 넣어 초음파 세척하여 물리적으로 시편에 부착된 세균을 탈착하였다. 분리된 세균액 100 ul를 BHI 고체 배지에 떨어뜨려 도말하여 24시간 배양한 뒤 단위 당 군락 균 수(CFU)를 확인하여 평가하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하여 위 과정을 반복하고, 평균값과 표준편차를 구하였다.
- 09 MPa 하중을 20초간 적용하여 압흔을 만들었다. 시편에 형성된 다이아몬드형 압흔의 장축길이를 측정하여 표면 경도를 계산하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 각 시편 당 무작위로 각각 2 부위를 측정하여 평균값과 표준편차를 구하여 비교하였다.
- 시편을 장착하고 대면각 136°의 다이아몬드 피라미드 압입자로 0.09 MPa 하중을 20초간 적용하여 압흔을 만들었다.
- 75% PTC, 5% PTC의 시편을 적당한 간격으로 고체배지 위에 올려 두어 37℃ incubator에서 24시간 배양시켰다. 이 때 양성대조군은 20 ul의 NaOCl을 적신 paper disk(Filter paper disc, Toyo Roshi Kaisha Ltd. Japan)를 사용하였고, 음성대조군은 멸균된 paper disk를 사용하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 항균력은 시편의 주변에 생기는 성장저해구역(zone of inhibition) 크기로 판별하였으며 성장저해구역의 크기가 클수록 항균력이 큰 것으로 간주하였다.
- 이 때, 플라스틱 스파튤라를 이용하여 기포가 생기지 않도록 주의한다. 재료가 평탄하게 채워진 것을 확인한 후 상부에서 광조사면이 수직이 되도록 60초간 광조사하였다. 광중합 후 재료를 몰드에서 분리하고 즉시 플라스틱 스파튤라를 이용하여 중합되지 않은 재료를 제거한 후 전자식 버니어캘리퍼스로 중합된 재료의 높이를 측정하였다.
- 지름 10 mm, 두께 1 mm의 몰드에 제조된 수복재의 경도는 비커스 경도시험기(micro hardness tester, Dmh-2; Matuzawa Seiki, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다[2]. 시편을 장착하고 대면각 136°의 다이아몬드 피라미드 압입자로 0.
- 폭이 20 mm인 지지대 위에 시편을 놓고 만능시험기(Rheometer Compac-100Ⅱ, Sin Scientific CO., LTD, Tokyo, Japan)를 사용하여 (0.75±0.25) mm/min의 cross-head speed로 3점 굽힘시험을 시행하였다.
- Paul, MN, USA, 650 mW/cm2 )를 사용하였다. 피톤치드 성분이 함유된 복합레진을 제작하기 위해 복합레진에 각각의 농도에 따라 피톤치드 원액(㈜김민재편백, 성북구, 대한민국) 0, 1.25, 2.5, 3.75, 5%를 함유하여 high-speed mixer(SpeedMixer, Hauschild, Hamm, Germany)를 사용하여 2,000 rpm으로 5분간 혼합 하여 시편을 준비하였다. 본 연구에서 피톤치드를 PTC라고 명명하였으며, 실험군은 피톤치드의 농도에 따라 Control(비함유), 1.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 복합레진은시판 중인 레진(3M ESPE FiltekTMZ350XT, St. Paul, MN, USA)을 선택하였고, 제조사의 지시사항에 따라 작업하였으며 중합을 위해 광조사기(3M Elipar Free Light 2, St.Paul, MN, USA, 650 mW/cm2 )를 사용하였다. 피톤치드 성분이 함유된 복합레진을 제작하기 위해 복합레진에 각각의 농도에 따라 피톤치드 원액(㈜김민재편백, 성북구, 대한민국) 0, 1.
- 지름 10 mm, 두께 1 mm의 몰드를 이용하여 시편을 제작하였다. Broth Heart Infusion(BHI, Becton Dickinson and Co.
데이터처리
- 분리된 세균액 100 ul를 BHI 고체 배지에 떨어뜨려 도말하여 24시간 배양한 뒤 단위 당 군락 균 수(CFU)를 확인하여 평가하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하여 위 과정을 반복하고, 평균값과 표준편차를 구하였다.
- 시편에 형성된 다이아몬드형 압흔의 장축길이를 측정하여 표면 경도를 계산하였다. 각 군별로 5개의 시편을 제작하였으며, 각 시편 당 무작위로 각각 2 부위를 측정하여 평균값과 표준편차를 구하여 비교하였다.
- 각 실험군 사이의 유의성은 IBM SPSS Statistics 20 program(International Business Machines Corp, Newyork, NY, USA)을 이용하여 one-way ANOVA로 분석 후, 5%의 유의수준에서 Tukey Test를 통하여 검정하였다
이론/모형
- ISO 4049의 시험방법에 따라 길이 10 mm, 직경 4 mm의 원통형 모양의 테프론 몰드에 각각의 농도에 따른 피톤치드를 함유한 복합레진을 몰드 위로 약간의 과충전을 시킨 후, 폴리에스터 필름과 슬라이드 글라스로 압박하여 잉여분을 제거하였다[16]. 이 때, 플라스틱 스파튤라를 이용하여 기포가 생기지 않도록 주의한다.
- ISO 4049의 시험방법에 따라 레진을 (25±2) mm×(2.0±0.1) mm×(2.0±0.1) mm의 몰드를 이용하여 시편을 제작하였다[16].
- 피톤치드의 농도에 따른 S. mutans의 항균활성을 Inhibition zone test를 통해 실험하였고 그 결과를 [Fig 4]에 나타내었다. 배양 24시간 후 S.
- 항균력을 평가하기 위하여 첫 번째로 S. mutans의 inhibition zone test를 이용하였다. 이 방법은 재료에서 용출되는 항균 물질이 주변에 형성하는 성장저해구역을 측정하는 방법으로[7,11] 각 군의 시편들은 중합이 완료된 후 S.
성능/효과
- 1. 표면경도는 5% PTC군을 제외하고 Control, 1.25% PTC군, 2.5% PTC군, 3.75% PTC군 간의 유의한 차이가 없었다(p>0.05).
- 1.25% PTC(82±9), 2.5% PTC(80.3±1)군은 Control (84.5±5.9)과 유의한 차이가 없었고 (p>0.05), 3.75% PTC(68.8±5.9), 5% PTC(63.67.8)군은 Control에 비해 굴곡강도가 유의하게 감소하는 경향을 보였다(p<0.05).
- 1.25%PTC 군은 Control과 비슷한 양상을 보이며, 집락 수에 유의한 차이를 보이지 않았고(p>0.05), 2.5%PTC군부터는 관찰되는 집락 수의 유의한 감소를 보였다(p<0.05).
- mutans가 배양되어 있는 고체배지에 놓여졌다. 1.25%의 피톤치드가 함유된 군에서 는 Control과 Negative control과 성장저해구역의 유의한 차이가 없는 것을 확인할 수 있었으며, 2.5% 이상의 피톤치드가 함유된 군에서는 유의하게 확장된 성장저해구역을 확인할 수 있었다. 이를 통해 시편 주변으로 용출된 물질이 항균성을 갖고 있다고 판단된다[27].
- 2. 중합깊이는 Control, 1.25% PTC군, 2.5% PTC군은 유의한 차의가 없었고(p>0.05), 3.75% PTC, 5% PTC군 Control에 비해 유의한 감소를 보였다(p0.05), 3.75% PTC, 5% PTC군 Control에 비해 유의한 감소를 보였다(p0.05),
- 2.5% PTC군부터는 Control 값보다 유의하게 증가하였고, 2.5% PTC군보다 3.75% PTC, 5% PTC군은 더 증가하는 경향을 보였다(p<0.05)
- 3. 굴곡강도는 Control, 1.25% PTC군, 2.5% PTC군은 유의한 차의가 없었고(p>0.05), 3.75% PTC, 5% PTC군 Control에 비해 유의한 감소를 보였다(p<0.05).
- 3.75% PTC (68±5.9), 5% PTC (63.6±7.8)은 굴곡강도 값이 Control (84.5±5.9)에 비해 유의하게 낮았다(p<0.05).
- 4. Inhibition zone test 결과, 1.25% PTC군은 Control과 유의한 차이가 없었고(p>0.05), 5% PTC군, 3.75% PTC군, 2.5% PTC군 순으로 성장 저해구역이 증가되었다.
- 5. CFU 측정 결과, 1.25% PTC군은 Control과 유의한 차이가 없었고(p>0.05), 2.5% PTC군, 3.75% PTC 군, 5% PTC군 순으로 피톤치드의 농도가 증가할수록 집락수가 감소되었다.
- 05). ISO 4049에서 제시하는 복합레진의 최소 굴곡강도인 80 MPa과 비교하여 Control, 1.25% PTC, 2,5% PTC는 요구사항을 충족했다.
- 이를 통해 시편 주변으로 용출된 물질이 항균성을 갖고 있다고 판단된다[27]. 또한, CFU 평가 결과도 Inhibition zone test의 결과와 마찬가지로 2.5% 이상의 피톤치드가 함유된 군에서 S. mutans 세균의 수가 유의하게 감소됨을 관찰하며 피톤치드의 농도가 높아질수록 S. mutans의 성장을 억제하는 효과가 증가함을 알 수 있었다. 선행 연구에서는 피톤치드가 세포벽을 약하게 만들어 세포막의 파괴에 따른 세균의 자가분해를 야기하거나 세균의 호흡대사에 영향을 미침으로써 항균효과를 발휘하는 것이라고 추측하였다[14,15].
- 물리적 특성 평가 중 먼저 표면경도는 비파괴적인 방법으로 재료의 내마모성을 측정할 수 있는 값으로 [2], 측정 결과 3.75%의 피톤치드를 함유한 군까지는 Control과 유의한 차이가 없어 표면경도를 크게 떨어뜨리지 않는 것으로 확인되었다. 두 번째로 중합깊이를 측정하였는데, 2.
- 배양 24시간 후 S. mutans에 대한 항균력은 피톤치드의 농도가 높을수록 높게 측정되었으며, Negative control, Control, 1.25% PTC군은 성장저해구역의 크기에 유의한 차이가 없었다 (p>0.05).
- 선행 연구에서는 피톤치드가 세포벽을 약하게 만들어 세포막의 파괴에 따른 세균의 자가분해를 야기하거나 세균의 호흡대사에 영향을 미침으로써 항균효과를 발휘하는 것이라고 추측하였다[14,15]. 본 연구에서 사용한 세균인 S. mutans는 치아우식 발생에 있어 가장 중요한 원인균으로 이 세균에 대한 항균효과가 있다는 것은 임상적으로 매우 중요한 결과이다. 또한, 다른 수복물보다 복합레진 주위에 치태 및 세균의 축적 이 더 많이 일어난다고 보고된 바 있어 피톤치드를 함유한 복합레진이 S.
- 본 연구의 결과를 통해 피톤치드가 복합레진에 2.5% 포함되었을 경우 물리적 변화 없이 항균 효과를 나타냈음을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 이용하여 이차우식 억제를 위한 새로운 복합레진을 개발할 수 있을 것이라고 생각되며, 향후 천연물질이 함유된 복합레진 개발을 위한 기초 자료의 활용 가능성이 있다.
- 피톤치드를 첨가하지 않은 Control(3.4±0.1)과 피톤치드를 첨가한 1.25%(3.4±0.3), 2.5%(3.3±0.1)군을 비교했을 때 모두 3 mm 이상의 중합깊이로 유의한 차이가 없는 것으로 나타났지만(p>0.05) 3.75%(2.6±0.2),5%(2.4±0.1)군을 나머지 3군과 비교했을 때는 3 mm 이하의 중합깊이 값을 보이며 유의하게 감소하였다 (p<0.05).
- 피톤치드의 농도가 높아지면서 세균의 억제능력이 증가하는 추이를 보이며 피톤치드가 존재하는 집단과 존재하지 않는 집단 간의 유의성 있는 차이를 확인 할 수 있었다(p<0.05).
후속연구
- 75%의 피톤치드를 함유한 군까지는 Control과 유의한 차이가 없어 표면경도를 크게 떨어뜨리지 않는 것으로 확인되었다. 두 번째로 중합깊이를 측정하였는데, 2.5%의 피톤치드를 함유한 군까지는 광원도달에 큰 간섭을 하지 않았던 것으로 보이지만 그 이상의 군에서는 중합깊이의 감소에 영향을 미치며 복합레진에 적용되기 위해서는 개선이 필요할 것으로 생각된다[18,26]. 복합레진의 표면경도는 중 합정도와 상관관계가 있다고 보고되었고, 본 연구에서도 피톤치드의 함량이 높아질수록 중합깊이가 감소되면서 표면경도에까지 영향을 미치는 것으로 보인다[7].
- 본 실험에서 피톤치드을 함유한 복합레진은 적절한 물성과 항균특성을 가진 치과재료로서의 가능성을 도출하였지만 항균작용 기전을 밝히지 못하였고, 짧은 실험기간 등의 한계점들이 있다. 또한, 성분 비율을 섬세하게 구분하고 시간 경과에 따른 효과를 관찰할 수 있는 후속연구가 필요할 것이라 임상적용을 위하여 보다 명확한 항균작용 기전 및 장기적인 효과 등의 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 그러나, 이러한 피톤치드의 특성을 복합레진에 적용시켜 복합레진의 항균 효과를 높이고자하는 연구는 아직까지 미흡한 실정이다. 또한, 항균성 물질을 첨가한 재료의 경우에 재료의 물성이 감소할 수 있기 때문에 물성을 저하시키지 않는 범위의 항균제가 임상에서 활용 가능성이 있을 것이라고 생각된다. 하지만 선행연구들의 분석 결과 이와 관련 된 연구 또한 미비한 형편이다.
- 이 결과를 이용하여 이차우식 억제를 위한 새로운 복합레진을 개발할 수 있을 것이라고 생각되며, 향후 천연물질이 함유된 복합레진 개발을 위한 기초 자료의 활용 가능성이 있다. 본 실험에서 피톤치드을 함유한 복합레진은 적절한 물성과 항균특성을 가진 치과재료로서의 가능성을 도출하였지만 항균작용 기전을 밝히지 못하였고, 짧은 실험기간 등의 한계점들이 있다. 또한, 성분 비율을 섬세하게 구분하고 시간 경과에 따른 효과를 관찰할 수 있는 후속연구가 필요할 것이라 임상적용을 위하여 보다 명확한 항균작용 기전 및 장기적인 효과 등의 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 5% 포함되었을 경우 물리적 변화 없이 항균 효과를 나타냈음을 관찰할 수 있었다. 이 결과를 이용하여 이차우식 억제를 위한 새로운 복합레진을 개발할 수 있을 것이라고 생각되며, 향후 천연물질이 함유된 복합레진 개발을 위한 기초 자료의 활용 가능성이 있다. 본 실험에서 피톤치드을 함유한 복합레진은 적절한 물성과 항균특성을 가진 치과재료로서의 가능성을 도출하였지만 항균작용 기전을 밝히지 못하였고, 짧은 실험기간 등의 한계점들이 있다.
- 75% PTC 군, 5% PTC군 순으로 피톤치드의 농도가 증가할수록 집락수가 감소되었다. 이상의 연구 결과로 복합레진에 피톤치드를 첨가할 경우 물성을 해치지 않으며 항균력이 나타났기 때문에 피톤치드와 결합한 레진은 이차우식을 최소화할 수 있는 가능성이 있으며 더불어 임상적인 활용도를 결정하기 위해서는 보다 다양한 방법으로 보완 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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