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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양과 뿌리로부터 인산 가용화능, 질소 고정능, IAA 생성능, siderophore 생성능 및 ACC deaminase 생성능을 갖는 미생물을 분리하고, 생리학적 특성 분석을 통해 식물이 생장함에 있어 환경 스트레스로부터 식물을 보호하고 식물 생장촉진 및 생물학적 방제 활성을 갖는 새로운 미생물을 탐색하고자 하였다.
- 특히, Pseudomonas 속에 의해 생성되는 siderophore의 경우에는 직접적으로 식물 생장에 도움을 줄 뿐만 아니라 근권의 식물뿌리 표면에서 PGPR의 군집을 이루어 살면서 Fe3+ 흡수의 경쟁에서 우위를 선점함으로써 식물병원성 곰팡이의 생육을 억제한다[30]. 따라서, 분리주의 siderophore 생성능을 확인하고자 하였으며, siderophore 생성능 확인 결과는 Fig. 2에 나타내었다. ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 분리주는 모두 1 cm 이상의 orange halo zone이 형성되는 것을 확인하였으며, 이는 분리주를 이용하 여 식물 생장촉진 및 식물병 방제예방을 위한 목적의 미생물제제에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 난용성 인은 인산 가용화능을 갖는 미생물에 의해 분비된 유기산과 무기산의 작용으로 가용화되며, 이 작용은 산의 hydroxyl group 및 carboxyl group이 Al, Fe, Ca와 같은 양이온을 킬레이트화하여 토양의 pH를 낮추는 것으로 알려져 있다[13]. 따라서, 토양 내 인산을 가용화하여 식물 생장을 촉진시키는 미생물을 탐색하기 위해서 토양으로부터 순수 분리한 분리주를 PVK 고체배지를 이용하여 인산 가용화능을 확인하였다. 본 연구 결과 clear zone의 지름이 0.
- 이전 연구들에 의하면, PGPR 분리주에 의해 생성되는 ACC deaminase는 에틸렌의 전구체인 ACC를 ammonia와 αketobutyrate로 분해하여 에틸렌의 수준을 낮춰 스트레스를 완화시켜주며, 식물이 염분에 대한 내성을 갖게 되어 가뭄에 따른 스트레스를 감소시켜 식물의 생장과 발달을 촉진시킨다[11, 12]. 따라서, 환경 스트레스와 관련된 ACC deaminase의 활성을 측정하여 환경 스트레스로부터 식물의 생장과 발달에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. ACC deaminase생성은 질소원으로 ACC만을 첨가한 배지에서 분리주의 생육 여부로 활성을 판단하였으며, 결과적으로 ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 모두에서 ACC 만을 질소원으로 한 DF salt 배지에서 생장을 확인하였다(Table 1).
- 그러나 ANG14, ANG28 및 ANG35에서는 세포외 효소활성을 확인할 수 없었다. 또한 선정된 균주들의 혼합배양을 통해 세포외 효소활성 시너지 효과를 확인하고자 하였다. ANG14와 ANG34를 혼합배양 했을 때 amylase 활성이 약 5.
- 본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키거나 방제 역할을 하는 균주를 선별하고자 하였다. 연구 결과, 균주 대부분 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 나타내었다.
- 본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 미생물을 이용하여 식물 생장 촉진활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 확인하고자 하였으며, 분리주 간에 비교우위를 통해 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 최종 선정하였다. 이들은 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 모두 가지며, 일부 식물병원성 곰팡이에 대해 길항능을 가지는 것을 확인하였다.
- 식물은 다양한 생물적과 비생물적 스트레스 요인에 영향을 받으며, 저온, 토양의 수분 부족, 높은 염분 농도, 가뭄, 고 온과 같은 스트레스 조건에 의해서 생장과 발달이 저해된다[24]. 이에 환경스트레스와 관련된 ACC deaminase와 IAA생성에 의해 다양한 환경조건하에서 생장이 가능한지 확인 하고자 최종 선발된 분리주들에 대하여 다양한 환경 조건하 에서 생육 여부를 조사하였다. 먼저, 온도 조건에서 20℃에 서는 모든 분리주가 생장하였으며, 40℃ 이상에서 ANG4, ANG14, ANG28, ANG34, ANG35 등 5종의 분리주가 생육 하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 환경적 스트레스 감소에 영향을 주는 미생물 결정 인자인 IAA 생성 유무를 알아보기 위하여 King’s B 배지를 이용하였다.
- 16S rRNA 유전자 구간을 증폭시키기 위해서 universal primer인 27F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)를 사용하여 PCR로 30 cycles (94.0℃-5분, 55.0℃-30초, 72.0℃-1분)을 실행하였다(TP600, Takara Bio Inc., Japan).
- 세포외 효소활성을 측정하기 위해서 각 starch, carboxymethyl cellulose (CMC), skim milk, xylan이 들어 있는 nutrient broth에 균주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양 하였다. Amylase 활성은 Miller [18]의 방법을 일부 변형하여 시험을 진행하였으며, 배양 상등액과 1% starch solution (50 mM sodium phosphate buffer)을 1:1로 혼합하여 반응시켰다. 반응시킨 후 color reagent solution과 혼합하여 100℃에서 열처리 후 얼음에 냉각시킨 다음 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
- 식물병원균의 길항 기작 중의 하나인 siderophore 생성능 여부를 확인하기 위해 siderophore 생성 분리주 감별 배지인 chrome azurole S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다[17]. CAS 평판 배지에 접종하여 30℃에서 4일 간 배양한 후 orange halo zone 형성 유무를 관찰하였다.
- 흡광도는 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. Protease는 Oh 등[20]의 방법을 일부 변형하여 시험을 진행하였으며, 원심분리한 상등액은 0.65% casein (50 mM sodium phosphate buffer)를 혼합한 뒤 37℃에서 10분간 반응시켰 다. 그 후 0.
- Serial dilution으로 희석한 용액을 6가지 평판 배지인 Bennet agar (BA, 1% glucose, 0.2% peptone, 0.1% beef extract, 0.1% yeast extract), glucose minimal salts agar (GMSA, 0.2% glucose, 1% yeast extract, 0.2% KH2PO4, 0.3% K2HPO4, 0.01% MgSO4·7H2O, 0.0002% MnSO4), potato dextrose agar (PDA, DifcoTM), tryptic soy agar (TSA, DifcoTM) plate, actinomycetes isolation agar (AIA, 0.2% sodium caseinate, 0.01% L-asparagine, 0.4% C3H5O2Na, 0.05% K2HPO4, 0.01% MgSO4, 0.0001% FeSO4, 1.5% agar), humic-vitamin agar (HV, 0.1% humic acid, 0.05% KCl, 0.05% Na2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.002% CaCO3, 0.002% FeSO4, 0.1% VB stock solution, 1.5% agar)에 도말한 후 30℃에서 2일간 배양하였다.
- 5% calcium phosphate (10CaO·3P2O5·H2O)가 첨가된 Pikovskaya (PVK) agar 배지를 이용하였다[16]. 고체배지 중앙에 cork borer를 이용하여 잘라낸 뒤 순수 분리된 전배양 분리주를 접종 후 30℃에서 4일간 배양하면서 균체주위의 clear zone 형성 유무를 조사하여 난용성 인산 가용화능을 측정하였다.
- 난용성 인산염의 분해능을 조사하기 위해 0.5% calcium phosphate (10CaO·3P2O5·H2O)가 첨가된 Pikovskaya (PVK) agar 배지를 이용하였다[16].
- 3)로 두 차례 세척하고 질소원으로 3 mM ACC가 첨가된 DF salt 배지에 접종하여 30℃에서 2일간 배양하였다. 대조구로는 질소원으로 아무것도 첨가하지 않은 배지를 이용하였으며, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 ACC의 이용에 따른 균체의 증가를 통해 ACC deaminase의 생성을 확인하였다.
- 진균 외벽 가수분해효소는 식물병원성 곰팡이의 세포벽을 분해시키는 용균작용(degradative parasitism)을 수행한다고 보고되고 있으며, 여러 종류의 세포외 효소들에 의한 식물병원성 곰팡이 생장을 저해하는 방법이 널리 사용되고 있다[31]. 따라서, 본 시험에서는 분리 균주를 대상으로 amylase, cellulase, protease 및 xylanase 생성능을 조사하였으며, 그 결과를 Table 5에 나타내었다. ANG34에서 amylase와 protease, xylanase 활성을 확인할 수 있었다.
- 먼저, 질소는 대기 중의 가장 많이 존재함에도 불구하고, 대부분 기체형의 N2로 존재하기 때문에 화학적으로 매우 안정하여 살아있는 생물체가 스스로 이용할 수 없으므로, 질소 고정세균을 이용하여 대기 중에 존재하는 N2를 생물체가 이용할 수 있는 질산염 형태로 질소원을 제공한다[6]. 따라서, 질소 고정능을 가지는 분리주를 분리하기 위해서 NFB 배지를 이용하였으며, NFB 배지가 푸른색으로 변화되거나 분리주의 성장을 통해 양성 판정을 하였다. 본 연구 결과, 분리주 모두 NFB 배지에서 성장하여, 배지 색이 푸른색으로 변화된 것을 확인할 수 있었다(Table 2).
- 3). 또한 분리주들에 대해서 형태학적 특성을 분석하기 위해서 SEM을 이용하여 균주의 형태를 관찰하였으며, 단간 균형태를 나타내는 ANG35를 제외한 ANG14, ANG28, ANG34에서는 간균의 형태를 관찰할 수 있었다(Fig. 4).
- 0, MEGA software)을 이용하여 계통도를 작성하였다. 또한 분리주를 형태학적으로 조사하기 위하여 주사전자현미경(SEM, scanning electron microscope)을 이용하여 관찰하였다.
- 또한 생리학적 특성을 분석하기 위해서 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 이용하여 분석하였으며 제조사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
- 5% agar)에 도말한 후 30℃에서 2일간 배양하였다. 또한 채집한 식물 뿌리로부터 내생진균류의 분리를 위해 계면활성제(Tween 80)와 표백제(1.0% perchloric acid)로 살균 처리하여 멸균수로 세척한 후 sonication 하였다. Sonication 처리된 뿌리를 각 6가지 평판 배지에 올려서 30℃에서 2일간 배양하였다.
- 이에 환경스트레스와 관련된 ACC deaminase와 IAA생성에 의해 다양한 환경조건하에서 생장이 가능한지 확인 하고자 최종 선발된 분리주들에 대하여 다양한 환경 조건하 에서 생육 여부를 조사하였다. 먼저, 온도 조건에서 20℃에 서는 모든 분리주가 생장하였으며, 40℃ 이상에서 ANG4, ANG14, ANG28, ANG34, ANG35 등 5종의 분리주가 생육 하였다. 50℃ 이상에서는 ANG14만 성장을 확인할 수 있었으며, 이는 온도 조건하에서는 ANG14가 가장 넓은 온도 범위에서 성장함을 확인할 수 있었다.
- Sonication 처리된 뿌리를 각 6가지 평판 배지에 올려서 30℃에서 2일간 배양하였다. 미생물이 자란 배지상에서 형태나 색깔이 다른 colony를 계대 배양법을 통하여 순수 분리하였다.
- 5 M FeCl3 1 ml)과 1:2 (v/v)의 비율로 혼합한 다음, 분홍색이 발색되는 동안 상온에서 30분간 정치하였다. 발색되는 정도를 분광광도계(Spectrophotometer, Multiskan GO, Thermo Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 530 nm에서 측정하였다. 표준물질로 IAA를 이용하여, 위와 같은 동일한 방법으로 검량선을 작성하여 시료의 농도를 환산하였다[14].
- 분리주들에 대한 기후 및 토양 환경에 대한 적용성과 적응능을 알아보기 위하여 다양한 온도(10−50℃), pH (pH 4−12) 및 염농도(NaCl 0−10%)에서 균체의 생육능을 확인하였다. 배양된 분리주의 생장은 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 4배로 시너지 효과를 확인할 수 있었다. 분리 균주의 생리학적 특성을 분석하기 위하여 API ZYM kit를 사용하여 효소 활성을 측정하였다(Table 6). 그 결과, 공통적으로 esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 활성이 모든 균주에서 보였으며, ANG14에서는 alkaline phosphatase, valine arylamidase에서도 활성을 보였다.
- 분리주들에 대한 기후 및 토양 환경에 대한 적용성과 적응능을 알아보기 위하여 다양한 온도(10−50℃), pH (pH 4−12) 및 염농도(NaCl 0−10%)에서 균체의 생육능을 확인하였다.
- 유용 미생물을 선발하기 위하여 부산 일대의 신라대학교 인근 야산, 대저 토마토 밭, 기장군 배 밭, 창원 인근 야산 및 텃밭, 제주시 노리매 공원 및 인근 해변을 포함한 7곳으로부터 순수 분리하여 colony 형태학적으로 서로 다른 특징을 갖는 66종을 분리하였다. 분리주들의 식물 생장촉진 활성능을 확인하기 위해 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 확인하였으며, 활성이 높은 7종의 분리주를 최종 선발하였다.
- 분리주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다. 분리주의 동정을 위하여 균체를 TSB에 접종하여 30℃에서 2일간 배양 후 회수하였다.
- 분리주의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 식물병원성 곰팡이 7종을 이용하여 진행하였으며, 생장 저해 활성은 PDA 배지에 대치배양을 통해 생육 저지대를 측정하여 활성 여부를 판단하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 조사에 잿빛 곰팡이를 유발하는 Botrytis cinerea, 탄저병을 유발하는 Colletotrichum acutatum, 잎 마름병을 유발하는 Corynespora cassiicola, 시듦병을 유발하는 Fusarium 속, 고추역병을 유발하는 Phytophthora capsici, 뿌리 썩음병을 유발하는 Rhizoctonia solani, 균핵병을 유발하는 Sclerotinia sclerotiorum를 이용하였다.
- 세포외 효소활성을 측정하기 위해서 각 starch, carboxymethyl cellulose (CMC), skim milk, xylan이 들어 있는 nutrient broth에 균주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양 하였다. Amylase 활성은 Miller [18]의 방법을 일부 변형하여 시험을 진행하였으며, 배양 상등액과 1% starch solution (50 mM sodium phosphate buffer)을 1:1로 혼합하여 반응시켰다.
- 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 PDA를 이용한 well diffusion법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 분리주를 접종하여 검정 분리주와 25℃에서 대치배양하였다. 식물병원성 곰팡이와 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다.
- 식물성 호르몬인 IAA 생성능을 평가하기 위해 0.1%의 tryptophane이 첨가된 King’s B (2% proteose peptone, 0.25% K2HPO4, 0.6% MgSO4, 1.5% glycerol) 배지에 분리주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양하였다.
- Ltd.에 의뢰하였으며, 염기서열은 NCBI의 BLASTN에서 분석하였다. 분석결과를 MEGA 프로그램(version 7.
- 유용 미생물의 식물 생장촉진 활성을 측정하기 위해서 질소 고정능과 인산 가용화능을 확인하였다. 먼저, 질소는 대기 중의 가장 많이 존재함에도 불구하고, 대부분 기체형의 N2로 존재하기 때문에 화학적으로 매우 안정하여 살아있는 생물체가 스스로 이용할 수 없으므로, 질소 고정세균을 이용하여 대기 중에 존재하는 N2를 생물체가 이용할 수 있는 질산염 형태로 질소원을 제공한다[6].
- 3412, NucleoGen, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 1% agarose gel을 이용하여 확인하였다. 염기서열 분석은 Solgent Co.
- , Japan). 증폭된 PCR 산물은 PCR/Gel combo kit (Cat. No. 3412, NucleoGen, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 1% agarose gel을 이용하여 확인하였다.
- 본 연구에서 사용한 근권 토양과 뿌리는 부산 일대의 신라대학교 인근 야산, 대저 토마토 밭, 기장군 배 밭, 창원 인근 야산 및 텃밭, 제주시 노리매 공원 및 인근 해변을 포함한 7곳으로부터 채취하였다. 채집된 토양과 뿌리를 음지에서 2일간 풍건하였으며, 각 시료 1 g을 9 ml의 멸균된 생리 식염수에 현탁하였다. Serial dilution으로 희석한 용액을 6가지 평판 배지인 Bennet agar (BA, 1% glucose, 0.
- 선별된 분리주로부터 16S rRNA 염기서열을 확인하고자 하였으며, NCBI의 BLASTN을 이용하여 염기서열을 분석한 결과를 Table 4에 나타내었다. 최종적으로 식물 생장촉진 활 성, 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 등 분리주의 비교우위 에 따라 최종 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 최종 선별 하였으며, 분리주들의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하 여 16S rRNA 염기서열을 분석하여 계통도를 나타내었다(Fig. 3). 또한 분리주들에 대해서 형태학적 특성을 분석하기 위해서 SEM을 이용하여 균주의 형태를 관찰하였으며, 단간 균형태를 나타내는 ANG35를 제외한 ANG14, ANG28, ANG34에서는 간균의 형태를 관찰할 수 있었다(Fig.
- 발색되는 정도를 분광광도계(Spectrophotometer, Multiskan GO, Thermo Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 530 nm에서 측정하였다. 표준물질로 IAA를 이용하여, 위와 같은 동일한 방법으로 검량선을 작성하여 시료의 농도를 환산하였다[14].
- 회수한 균체는 DF salt 배지(0.4% KH2PO4, 0.6% Na2HPO4, 0.02% MgSO4· 7H2O, 0.0001% FeSO4, 0.000001% H3BO3, 0.00001% MnSO4· H2O, 0.000007% ZnSO4, 0.000005% CuSO4, 0.000001% MoO3, 0.2% glucose, 0.2% C6H12O7, 0.2% C6H8O7, pH 7.3)로 두 차례 세척하고 질소원으로 3 mM ACC가 첨가된 DF salt 배지에 접종하여 30℃에서 2일간 배양하였다.
- 회수한 균체의 DNA는 Wizard® Genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 추출하였다.
대상 데이터
- 분리주들의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 조사하기 위하여 Botrytis cinerea KACC 40574, Colletotrichum acutatum KACC 40801, Corynespora cassiicola KACC 44719, Fusarium sp. KACC 40241, Phytophthora capsici KACC 40180, Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124, Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457 등으로 총 7종을 대상으로 검정하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 PDA를 이용한 well diffusion법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 분리주를 접종하여 검정 분리주와 25℃에서 대치배양하였다.
- 따라서, 토양 내 인산을 가용화하여 식물 생장을 촉진시키는 미생물을 탐색하기 위해서 토양으로부터 순수 분리한 분리주를 PVK 고체배지를 이용하여 인산 가용화능을 확인하였다. 본 연구 결과 clear zone의 지름이 0.5 cm 이상 나타낸 분리주를 확보하였다(Table 2). 분리주 모두 인산 가용화능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 ANG14, ANG16, ANG25, ANG34, ANG35 분리주 가 1.
- 본 연구에서 사용한 근권 토양과 뿌리는 부산 일대의 신라대학교 인근 야산, 대저 토마토 밭, 기장군 배 밭, 창원 인근 야산 및 텃밭, 제주시 노리매 공원 및 인근 해변을 포함한 7곳으로부터 채취하였다. 채집된 토양과 뿌리를 음지에서 2일간 풍건하였으며, 각 시료 1 g을 9 ml의 멸균된 생리 식염수에 현탁하였다.
- 8) 배지를 이용하였다. 분리용 NFB 배지는 무기염과 탄소원만 들어 있고 질소원이 결핍된 배지로서 대기 중의 질소를 고정할 능력이 있는 분리주만이 생장할 수 있는 선택배지를 이용하였다[15]. Test tube에 NFB 배지를 넣고 전배양된 분리주를 loop로 접종하여 30℃에서 4일간 배양하면서 배지 색이 푸른색으로 변할 경우 양성으로 판단하였다.
- 분리주의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 식물병원성 곰팡이 7종을 이용하여 진행하였으며, 생장 저해 활성은 PDA 배지에 대치배양을 통해 생육 저지대를 측정하여 활성 여부를 판단하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 조사에 잿빛 곰팡이를 유발하는 Botrytis cinerea, 탄저병을 유발하는 Colletotrichum acutatum, 잎 마름병을 유발하는 Corynespora cassiicola, 시듦병을 유발하는 Fusarium 속, 고추역병을 유발하는 Phytophthora capsici, 뿌리 썩음병을 유발하는 Rhizoctonia solani, 균핵병을 유발하는 Sclerotinia sclerotiorum를 이용하였다. 선별된 분리주는 식물병원성 곰팡이에 대하여 일부 길항능을 나타내었다(Table 3).
- 유용 미생물을 선발하기 위하여 부산 일대의 신라대학교 인근 야산, 대저 토마토 밭, 기장군 배 밭, 창원 인근 야산 및 텃밭, 제주시 노리매 공원 및 인근 해변을 포함한 7곳으로부터 순수 분리하여 colony 형태학적으로 서로 다른 특징을 갖는 66종을 분리하였다. 분리주들의 식물 생장촉진 활성능을 확인하기 위해 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 확인하였으며, 활성이 높은 7종의 분리주를 최종 선발하였다.
- 질소 고정세균 분리용 nitrogen free bromothymol blue (NFB, 0.5% (HO2CCH2CH(OH)CO2H, 0.05% K2HPO4, 0.001% MgSO4 · 7H2O, 0.002% NaCl, 0.005% FeSO4 · 7H2O, 0.0002% Na2MoO4, 0.001% MnSO4· 7H2O, 0.001% CaCl2, 0.4% KOH, 0.2% bromothymol blue (in 0.5% alcohol), 0.175% agar, pH 6.8) 배지를 이용하였다.
데이터처리
- Means with the different letters (a-b) indicated significant differences among samples at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.
- Means with the different letters (a-d) indicated significant differences among samples at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 모든 분석은 3회 이상 수행하였으며, 평균±표준편차(Mean ± SD)로 표현하였다.
- 에 의뢰하였으며, 염기서열은 NCBI의 BLASTN에서 분석하였다. 분석결과를 MEGA 프로그램(version 7.0, MEGA software)을 이용하여 계통도를 작성하였다. 또한 분리주를 형태학적으로 조사하기 위하여 주사전자현미경(SEM, scanning electron microscope)을 이용하여 관찰하였다.
- 평균값의 유의한 차이는 SPSS (version 20.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용한 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)의 Duncan’s multiple range test를 사용하였다.
이론/모형
- 반응시킨 후 color reagent solution과 혼합하여 100℃에서 열처리 후 얼음에 냉각시킨 다음 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. Cellulase와 xylanase 활성을 Shin과 Cho [19]의 방법을 이용하여 시험을 진행하였다. 원심분리한 상등액은 각 1% CMC solution (50 mM sodium phosphate buffer)과 1% xylan solution (50 mM sodium phosphate buffer)을 혼합하여 50℃에서 10분간 반응시켰다.
- 건조, 염, 온도 등 환경스트레스에 대한 저항성 기작의 주요지표인 ACC deaminase 활성은 Barnawal 등[11]의 방법을 통해 평가하였다. Test tube에 TSB를 넣고 선별된 분리주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양한 뒤 원심 분리하여 균체를 회수하였다.
- 식물병원균의 길항 기작 중의 하나인 siderophore 생성능 여부를 확인하기 위해 siderophore 생성 분리주 감별 배지인 chrome azurole S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다[17]. CAS 평판 배지에 접종하여 30℃에서 4일 간 배양한 후 orange halo zone 형성 유무를 관찰하였다.
- KACC 40241, Phytophthora capsici KACC 40180, Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124, Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457 등으로 총 7종을 대상으로 검정하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 PDA를 이용한 well diffusion법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 분리주를 접종하여 검정 분리주와 25℃에서 대치배양하였다. 식물병원성 곰팡이와 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다.
성능/효과
- 먼저, 온도 조건에서 20℃에 서는 모든 분리주가 생장하였으며, 40℃ 이상에서 ANG4, ANG14, ANG28, ANG34, ANG35 등 5종의 분리주가 생육 하였다. 50℃ 이상에서는 ANG14만 성장을 확인할 수 있었으며, 이는 온도 조건하에서는 ANG14가 가장 넓은 온도 범위에서 성장함을 확인할 수 있었다. 또한 pH 조건에서는 대부분의 분리주에서 pH 5.
- 따라서, 환경 스트레스와 관련된 ACC deaminase의 활성을 측정하여 환경 스트레스로부터 식물의 생장과 발달에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. ACC deaminase생성은 질소원으로 ACC만을 첨가한 배지에서 분리주의 생육 여부로 활성을 판단하였으며, 결과적으로 ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 모두에서 ACC 만을 질소원으로 한 DF salt 배지에서 생장을 확인하였다(Table 1). 이는 Arshad 등[21]의 연구에서 ACC deaminase를 생성하는 Pseudomonas 속이 염이나 건조 조건하에서 작물 열매의 성숙을 촉진시키며 수확량을 증가시킨다는 보고를 통해 분리주가 생성하는 ACC deaminase는 식물뿌리 내의 에틸렌의 전구체인 ACC 농도를 감소시켜 결과적으로 에틸렌의 합성을 줄이며, 따라서 염분, 가뭄, 온도와 같은 환경 스트레스에 내성을 가져 식물의 생장을 촉진시키는 작용을 할 것으로 판단된다[10].
- 또한 선정된 균주들의 혼합배양을 통해 세포외 효소활성 시너지 효과를 확인하고자 하였다. ANG14와 ANG34를 혼합배양 했을 때 amylase 활성이 약 5.1배, xylanase 활성이 약 2.3배 증가하는 것을 확인하였으며, ANG14, ANG28 및 ANG34를 혼합배양 했을 때는 amylase 활성이 약 6.1배, xylanase 활성이 약 3.7배 증가하였다(Fig. 5). ANG14, ANG34 및 ANG35를 혼합 배양 했을 때는 amylase 활성이 약 7.
- ANG4와 ANG14의 경우에는 0−10% 농도에서 생육하며 분리들 중에서 가장 넓은 범위에서 생육이 가능한 것을 확인할 수 있었다(Table 1).
- 분리 균주의 생리학적 특성을 분석하기 위하여 API ZYM kit를 사용하여 효소 활성을 측정하였다(Table 6). 그 결과, 공통적으로 esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 활성이 모든 균주에서 보였으며, ANG14에서는 alkaline phosphatase, valine arylamidase에서도 활성을 보였다. ANG28에서는 trypsin, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase 및 α-mannosidase 등 다양한 효소활성을 나타내었다.
- cassiicola, Fusarium sp. 등 식물병원성 곰팡이의 대해 길항능을 가지 는 것을 확인하였으며, 그 외에 ANG35는 B. cinerea, P. capsici, R. solani에서도 길항능을 확인할 수 있었다. 또한 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 외에도 ANG35는 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes에 대해서도 항균활성을 가지는 것으로 확인이 되었다(data not shown.
- ). 따라서, 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 siderophore 활성 및 다양한 항생물질 등에 의해 방제효과가 나타나는 것으로 사료된다.
- 또한 ANG16과 ANG28의 경우에는 0−6% 농도에서 생육하는 것을 확인할 수 있었다.
- 이는 직접적으로는 인산의 가용화, 질소 고정화를 통해 필요한 영양분 흡수를 촉진하여 식물 생장에 도움을 줄 것으로 기대된다. 또한 IAA 생성능 및 ACC deaminase 활성을 통 해서 환경 스트레스로부터 식물을 보호하여 식물 생장에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되며, 선별한 균주 대부분 온도, 염, pH와 같은 다양한 환경 조건하에서 생존하는 것을 확인할 수 있었다. Siderophore의 경우에는 직접적으로는 불용성 Fe(OH)3의 화합물을 Fe3+의 이온 형태로 변화시켜 식물 생장에 도움을 주며, 간접적으로 근권 주위의 Fe3+의 흡 수의 경쟁에서 우위를 선점함으로써 식물병원성 곰팡이에 대하여 방제효과를 나타낼 것으로 기대된다.
- 또한 pH 조건에서는 대부분의 분리주에서 pH 5.0−9.0 범위에서 생육하는 것을 알 수 있었으며, ANG4의 경우에는 pH 4.0−10.0, ANG14와 ANG16의 경우에는 pH 5.0−10.0 범위에서 생육하여 상대적으로 다른 분리주에 비해서 넓은 범위에서 생육하는 것을 확 인하였다.
- 9배 증가하였다. 또한 최종 선별된 4균주를 모두 혼합배양했을 때 amylase 활성이 약 7.8배, xylanase 활성이 약 4.4배로 시너지 효과를 확인할 수 있었다. 분리 균주의 생리학적 특성을 분석하기 위하여 API ZYM kit를 사용하여 효소 활성을 측정하였다(Table 6).
- 또한 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 외에도 ANG35는 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes에 대해서도 항균활성을 가지는 것으로 확인이 되었다(data not shown.).
- 특히 ANG35의 경우에는 7가지 식물병원성 곰팡이 중 6가지에 대해 비교적 높은 억제율을 나타내어 식물 생장 촉진뿐만 아니라 방제활성을 가지므로 식물이 생장하는 데 도움을 줄 것으로 기대된다. 또한, 4균주 간의 세포외 효소활성 synergy effect를 확인한 결과 단독배양을 했을 때보다 혼합배양 시 세포외 효소활성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 식물 생장촉진 활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 결과를 통해 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
- 따라서, 질소 고정능을 가지는 분리주를 분리하기 위해서 NFB 배지를 이용하였으며, NFB 배지가 푸른색으로 변화되거나 분리주의 성장을 통해 양성 판정을 하였다. 본 연구 결과, 분리주 모두 NFB 배지에서 성장하여, 배지 색이 푸른색으로 변화된 것을 확인할 수 있었다(Table 2). 또한 인은 식물의 생장 및 발달에 필요한 영양분 중 가장 중요한 요소로 토양 중에 약 0.
- 5 cm 이상 나타낸 분리주를 확보하였다(Table 2). 분리주 모두 인산 가용화능을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 ANG14, ANG16, ANG25, ANG34, ANG35 분리주 가 1.0 cm 이상의 활성을 나타내었다. 따라서, 질소 고정능, 인산 가용화능을 가진 분리주를 통하여 대기 중의 존재하는 질소(N2)를 질산염의 형태로 질소원을 제공함과 동시에 난용성 인을 이용 가능한 영양분을 만들어줌으로써 식물 생장에 도움을 줄 것으로 기대된다[26].
- 본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키거나 방제 역할을 하는 균주를 선별하고자 하였다. 연구 결과, 균주 대부분 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 나타내었다. 이는 직접적으로는 인산의 가용화, 질소 고정화를 통해 필요한 영양분 흡수를 촉진하여 식물 생장에 도움을 줄 것으로 기대된다.
- 염의 조건하에서는 ANG25가 0−3% 농도에서 생육하며, ANG34와 ANG35의 경우에는 0−4% 농도에서 생육 하는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 미생물을 이용하여 식물 생장 촉진활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 확인하고자 하였으며, 분리주 간에 비교우위를 통해 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 최종 선정하였다. 이들은 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 모두 가지며, 일부 식물병원성 곰팡이에 대해 길항능을 가지는 것을 확인하였다. 특히 ANG35의 경우에는 7가지 식물병원성 곰팡이 중 6가지에 대해 비교적 높은 억제율을 나타내어 식물 생장 촉진뿐만 아니라 방제활성을 가지므로 식물이 생장하는 데 도움을 줄 것으로 기대된다.
후속연구
- 2에 나타내었다. ANG4, ANG14, ANG16, ANG25, ANG28, ANG34, ANG35 분리주는 모두 1 cm 이상의 orange halo zone이 형성되는 것을 확인하였으며, 이는 분리주를 이용하 여 식물 생장촉진 및 식물병 방제예방을 위한 목적의 미생물제제에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
- Siderophore의 경우에는 직접적으로는 불용성 Fe(OH)3의 화합물을 Fe3+의 이온 형태로 변화시켜 식물 생장에 도움을 주며, 간접적으로 근권 주위의 Fe3+의 흡 수의 경쟁에서 우위를 선점함으로써 식물병원성 곰팡이에 대하여 방제효과를 나타낼 것으로 기대된다. 그 외에도 세포 외 효소활성 및 항진균 활성을 통하여 식물 생장촉진 활성 외에 식물병원성 곰팡이 방제제로서의 이용 가능성을 제시 한다. 따라서, 식물 생장촉진 활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능에 따른 비교우위를 통해 최종 선별된 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 이용하여 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시하며, 앞으로 선별된 유용미생물의 제형 연구 및 최적화, 보존 기간 연구, 작물 재배시험을 통해서 새로운 생물학적 제제로서 효과를 입증할 수 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 leucine arylamidase와 valine arylamidase은 단백질 합성에 영향을 미치며, 그 외 효소인 fucosidase, galactosidase, glucosidase, glucuronidase 및 mannosidase 등은 carbohydrate의 형성을 저해시키고 에너지 섭취에 부정적인 영향을 미친다[32]. 따라서, 4가지 균주 모두 식물병원성 곰팡이에 대한 진균 외벽 가수분해 효소를 지닌 균주로 방제효과에 영향을 나타낼 것으로 기대된다.
- 또한, 4균주 간의 세포외 효소활성 synergy effect를 확인한 결과 단독배양을 했을 때보다 혼합배양 시 세포외 효소활성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 식물 생장촉진 활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 결과를 통해 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시한다.
- 그 외에도 세포 외 효소활성 및 항진균 활성을 통하여 식물 생장촉진 활성 외에 식물병원성 곰팡이 방제제로서의 이용 가능성을 제시 한다. 따라서, 식물 생장촉진 활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능에 따른 비교우위를 통해 최종 선별된 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 이용하여 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시하며, 앞으로 선별된 유용미생물의 제형 연구 및 최적화, 보존 기간 연구, 작물 재배시험을 통해서 새로운 생물학적 제제로서 효과를 입증할 수 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 0 cm 이상의 활성을 나타내었다. 따라서, 질소 고정능, 인산 가용화능을 가진 분리주를 통하여 대기 중의 존재하는 질소(N2)를 질산염의 형태로 질소원을 제공함과 동시에 난용성 인을 이용 가능한 영양분을 만들어줌으로써 식물 생장에 도움을 줄 것으로 기대된다[26].
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