[논문]형광 리포터를 활용한 효모 단백질 잡종 기법 개발

박성균; 서수련; 황병준

doi:10.7845/kjm.2019.9083

형광 리포터를 활용한 효모 단백질 잡종 기법 개발
Yeast two-hybrid assay with fluorescence reporter 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.55 no.3, 2019년, pp.199 - 205

박성균 (강원대학교 의생명과학대학 분자생명과학과) , 서수련 (강원대학교 의생명과학대학 분자생명과학과) , 황병준 (강원대학교 의생명과학대학 분자생명과학과)

초록
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Yeast two-hybrid는 특정 단백질에 대한 상호작용 파트너 단백질의 선별을 위한 방법으로 개발되었다. 하지만 대규모 단백질 상호작용체 분석을 수행하기에 요구되는 노동과 대량의 한천배지 사용에 따른 문제에 의해 널리 사용되지 못하고 있다. 따라서 본 연구에서는 새로운 리포터 시스템을 yeast two-hybrid 방법에 도입하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS) 또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 상호작용 파트너 단백질을 포함하는 효모 클론을 손쉽게 선별할 수 있도록 하였다. 새로운 리포터 시스템은 c-myc 항원 결정기가 총 10번 반복되는 형태로 효모 표면에 발현되도록 하였으며, p53과 SV40 T항원을 이용한 실험을 통하여 리포터 단백질의 정상적인 발현을 flow cytometry 분석을 통하여 확인하였다. 따라서, 새로운 리포터 시스템을 도입한 yeast two-hybrid 방법은 대규모 상호작용체 분석을 위해 필요한 노력을 현저히 줄일 수 있을 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Yeast two-hybrid (Y2H) technique has been used to study protein-protein interactions, but its application particularly to a large-scale analysis of protein interaction networks, is limited by the fact that the technique is labor-intensive, based on scoring colonies on plate. Here, we develop a new reporter for the measurement of the protein-protein interactions by flow cytometry. The yeast harboring interacting proteins can also be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or magnetic-activated cell sorting (MACS). When two interacting proteins are present in the same yeast cell, a reporter protein containing 10 tandem repeats of c-myc epitope becomes localized on the surface of the cell wall, without affecting cell growth. We successful measured the surface display of c-myc epitope upon interacting p53 with SV40 T antigen by flow cytometry. Thus, the newly developed Y2H assay based on the display of c-myc repeat on yeast cell wall could be used to the simultaneous analysis of multiple protein-protein interactions without laborious counting colonies on plate.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Nucleotide sequences of the primers used in this study
그림 Fig. 1. Vectors and reports used in this study.
그림 Fig. 2. Growth of the yeast expressing LEU2-TurboGFP.
그림 Fig. 3. Brighter fluorescence signal was detected by increasing the numbers of c-myc epitope on reporter.
그림 Fig. 4. The pGAL1-Agα1-myc10 reporter integrated into yeast genome was expressed by the physical interaction of p53 with SV40 T antigenproteins, but not with Lamin A.

AI 본문요약
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문제 정의

다음 TurboGFP 유전자와 연결되어 있는 LEU2 유전자가효모 내, plasmid 도입을 확인하기 위한 선발표지 유전자로 사용되기 때문에 LEU2-turboGFP 단백질이 효모 성장에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. 만약 융합된 turboGFP 단백질이LEU2 단백질 기능에 영향을 준다면 추후에 진행될 yeast twohybrid분석 결과에 영향을 줄 가능성이 존재하였다.
따라서 본 연구는 새로운 yeast two-hybrid 리포터 개발을 통해서 대규모 선별과정을 보다 효율적으로 수행할 수 있게 하였다. 새로운 리포터 유전자는 반복된 항원(c-myc epitope)을 효모 표면에 발현하고, 형광 또는 자성 물질이 표지된 항체의 염색을 통하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS)또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 손쉽게 리포터를 발현하는 효모 세포를 선별하였다.
선별에 사용되는 라이브러리의 다양성이 증가 할수록 양성 clone을 선별하기 위해 필요한 한천배지의 양이 지수적으로 증가하기 때문에 많은 시간과 비용 그리고 노동력이 뒷받침되어야 대규모 분석이 가능하다. 따라서 분석 과정을 효율적인 방향으로 발전시키기 위하여 새로운 형태의 리포터 시스템을 적용하는 것이 본 연구의 궁극적인 목표이다. 따라서 yeasttwo-hybrid assay의 한천배지 사용을 대체하기 위한 대안으로FACS를 사용하는 것이 대규모 분석에 매우 적합하다고 판단하였고 이를 이용하기 위한 리포터 시스템을 구축하였다(Fig.
본 연구에서는 slide glass를 이용한 효모의 형광을 확인하기 위하여 Leica DM2500 (upright microscope)를 사용해서GFP 및 RFP 형광을 관찰하였다. 한천배지 상의 효모 colony형광 관찰에는 Leica DM IL LED (inverted microscope)를 사용하였다.

제안 방법

1.0 × 107의 효모 세포(OD600 = 1.0)를 준비하여 WB buffer(1X PBS with 0.5% BSA, 2 mM EDTA)로 한 차례 washing을 한 후, WB buffer에 mouse α-c-myc 항체(9e10, 2 mg/ml)를 1:500비율로 희석하고 100 μl를 이용하여 효모 pellet을 현탁 후, 4℃에서 30분간 1차 항체 염색하였다.
2차 항체 염색은 WB buffer에 형광현미경을 이용한 분석은 goat α-mouse IgGAlexaFlour 568 항체(2 mg/ml)를 flow cytometer를 이용한 분석은 goat α-mouse IgG-Cy5 항체(2 mg/ml)를 1:500의 비율로 희석하고 100 μl를 이용하여 효모 pellet을 현탁 후 4℃에서 30분간 염색하였다. 1X PBS로 한차례 washing 후, 형광을 관찰하였다.
2차 항체 염색은 WB buffer에 형광현미경을 이용한 분석은 goat α-mouse IgGAlexaFlour 568 항체(2 mg/ml)를 flow cytometer를 이용한 분석은 goat α-mouse IgG-Cy5 항체(2 mg/ml)를 1:500의 비율로 희석하고 100 μl를 이용하여 효모 pellet을 현탁 후 4℃에서 30분간 염색하였다.
Agα1 (R) SacII primer를 이용하여 PCR 산물을 얻은 후 제한효소 SacII를 처리하여 pRS303 벡터에 재조합 하여 pRS-pGAL1-Agα1-myc10 벡터를 제작하였다.
Agα1 유전자는 EBY100 효모 균주의genomic DNA를 주형으로 Agα1 (F) BglII, AgαI (R) PmeIprimer를 이용하여 PCR 산물을 얻은 후 제한효소 BglII와PmeI 이용하여 pYD1 벡터에 재조합하여 pGAL1-Agα1 벡터의 구축하였다.
GFP 형광은 488 nm laser를 이용하여excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL1 detector(530/30 band pass filter)를 통하여 확인하였다. Cy5에 의한 형광은 633 nm laser를 이용하여 excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL10 detector (650/40 band pass filter)를 통하여 확인하였다. 데이터의 분석에는 Kaluza (Backman coulter)분석 프로그램을 사용하였다.
4). DBD와 AD plasmid를 갖는 형질전환 효모를 SD/-Leu, Trp 한천배지 상에서 배양 후, 10개 colony를 한곳에 모은 후, 형광 염료가표지된 항체 및 flow cytometry를 이용하여 리포터 발현 정도,즉 효모 표면에 발현되는 c-myc 항원 양을 측정하였다. 물리적결합이 검증된 p53과 SV40 T을 발현하는 plasmid를 함께 보유하는 형질전환 효모 경우, c-myc 항원이 표면에 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, SV40 T 대신에 p53과 물리적인 결합이 없는 lamin A 형질전환 효모 경우, 리포터가 전혀 발현되지 않았다(Fig.
Moflo XDP high speed cell sorter (Backman coulter)를 사용하여 형광을 분석하였다. GFP 형광은 488 nm laser를 이용하여excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL1 detector(530/30 band pass filter)를 통하여 확인하였다. Cy5에 의한 형광은 633 nm laser를 이용하여 excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL10 detector (650/40 band pass filter)를 통하여 확인하였다.
Homologous DNA recombination을 이용하여 효모 유전체integration을 유도하기 위하여 pRS303 (NEB) 벡터을 사용하였다. pGAL1-Agα1-myc10 벡터를 주형으로, Integ.
MFα1 (secretory signal peptide sequence)을 얻기 위해 pPICZαA(Invitrogen) 벡터를 주형으로 MFα1 (F) BglII, MFα1 (R) MluIprimer를 이용하여 PCR 산물을 얻은 후, c-myc_GS linker PCR산물과 함께 제한효소 MluI을 처리한 후 T4 DNA ligase를 처리하여 연결하고 Agα1 S.P 20 (R) MluI, Agα1 350 aa (F) XhoIprimer를 이용하여 PCR 산물을 얻은 후, 제한효소 MluI과 XhoI을 처리하여 pGAL1-Agα1 벡터에 재조합하여 pGAL1-Agα1-myc1 벡터를 제작하였다.
Moflo XDP high speed cell sorter (Backman coulter)를 사용하여 형광을 분석하였다. GFP 형광은 488 nm laser를 이용하여excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL1 detector(530/30 band pass filter)를 통하여 확인하였다.
Myc5 및 myc10 tandem repeat epitope은 pADH-Aga2-myc10(unpublished)을 주형으로 myc5는 Myc5, 10 (F) MluI, Myc5(R) HindIII, myc10은 Myc5, 10 (F) MluI, Myc10 (R) HindIIIprimer를 이용하여 PCR을 통하여 얻은 후 제한효소 MluI과HindIII를 처리하여 pGAL1-Agα1-myc1에 재조합하여 pGAL1-Agα1-myc5, pGAL1-Agα1-myc10 벡터를 제작하였다.
PCR 산물과 pYD1 벡터를 제한효소 HindIII를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여 연결하고 Myc1 (F) MluI, GS linker (R) XhoI primer를 이용한 PCR을 통해서 c-myc epitope의 3' 말단에 GS linker가 연결된 PCR 산물을 증폭하였다.
Plasmid를 보유하고 있는 효모 균주를 SD/-Trp 배지(6.7%Yeast nitrogen base w/o amino acid, 5% Casamino acid, 2%Glucose)에 접종하여 24시간 동안 배양(30℃, 200 rpm) 후, 700× g에서 5분간 원심분리를 통해서 배지를 제거하고, SG/-Trp배지(6.7% Yeast nitrogen base w/o amino acid, 5% Casaminoacid, 2% Galactose, 1% Raffinose)를 이용하여 2차례 washing하여 잔존하는 glucose를 제거하였으며, 최종 OD600값이 1.0이 되도록 SG/-Trp 배지에 접종하여 24시간 동안 배양(22℃,230 rpm)하였다.
pGADT7, pGADT7-T (Clontech)를 기반으로 Leu2 유전자의C-말단의 종결코돈을 제거하고 TurboGFP 유전자를 연결하여pGAD-tGFP, pGAD-T-tGFP 벡터를 구축하였다. TurboGFP유전자는 pGIPZ plasmid를 주형으로 TurboGFP (F) SacII,TurboGFP STOP (R) AscI primer를 이용하여 PCR 증폭하였고 벡터는 pGADT7과 pGADT7-T를 주형으로 pGADT7-Leu2-[turboGFP] (F) SacII, pGADT7-Leu2-[turboGFP] (R) Asc1primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. 얻어진 벡터와 TurboGFP유전자를 SacII와 AscI 제한효소 자리를 이용하여 재조합 하였다.
Yeast two-hybrid assay에 필요한 벡터인 pGADT7, pGADT7-T,pGBKT7, pGBKT7-p53, pGBKT7-Lam, PCL19 (Clontech)은Top10F에 저장하였으며, 진위 여부를 여러 제한효소를 처리하여 나타나는 절편의 크기를 통하여 확인하였다. 본 연구에서 사용된 primer의 서열 정보는 Table 1에 정리하였다.
c-myc epitope (EQKLISEEDL)은 pHAB006 (unpublished)를 주형으로 Myc1 (F) MluI, Myc1 (R) HindIII primer를 이용하여 PCR 산물을 증폭하였다. PCR 산물과 pYD1 벡터를 제한효소 HindIII를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여 연결하고 Myc1 (F) MluI, GS linker (R) XhoI primer를 이용한 PCR을 통해서 c-myc epitope의 3' 말단에 GS linker가 연결된 PCR 산물을 증폭하였다.
pGAD-tGFP plasmid가 효모 안으로 도입되었을 때 LEU2-turboGFP 단백질이 정상적으로 발현되는지 확인하기 위하여JC993 효모균주에 pGADT7 또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하고 있는 형질전환체에서 GFP 형광 발현을 관찰하였다(Fig. 2A). pGAD-tGFP plasmid를 보유하고 있는 형질전환 효모에서만 GFP 형광이 발현되는 것으로 보아 LEU2-turboGFP가 정상적으로 발현되고 있는 것을 확인하였다.
pGADT7, pGADT7-T (Clontech)를 기반으로 Leu2 유전자의C-말단의 종결코돈을 제거하고 TurboGFP 유전자를 연결하여pGAD-tGFP, pGAD-T-tGFP 벡터를 구축하였다. TurboGFP유전자는 pGIPZ plasmid를 주형으로 TurboGFP (F) SacII,TurboGFP STOP (R) AscI primer를 이용하여 PCR 증폭하였고 벡터는 pGADT7과 pGADT7-T를 주형으로 pGADT7-Leu2-[turboGFP] (F) SacII, pGADT7-Leu2-[turboGFP] (R) Asc1primer를 이용하여 PCR 증폭하였다.
만약 융합된 turboGFP 단백질이LEU2 단백질 기능에 영향을 준다면 추후에 진행될 yeast twohybrid분석 결과에 영향을 줄 가능성이 존재하였다. pGADT7또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하는 형질전환 효모의 성장을 비교하여 LEU2-turboGFP 단백질이 효모 성장에 미치는영향을 확인하였다. 한천 배지 또는 액체 배지 배양 상에서 진행된 두 실험에서 pGADT7 또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하고 있는 형질전환 효모들의 성장이 거의 차이가 없는 것을확인하였다(Fig.
제작된 plasmid는 EBY100 (Invitrogen) 효모 균주에 형질전환 하였다. 각 형질전환체에서 galactose를 이용하여 발현을 유도한 후, 효모 표면에 발현된 c-myc 항원을 형광 염료가 표지된 항체를 이용하여 염색한 후 형광 현미경과 flow cytometry를 이용하여 c-myc항원의 발현 정도를 관찰하였다(Fig. 3). 온전한 Agα1을 발현하였을 때에 효모 표면에 항체가 염색되지 않는 것과 비교하여 c-myc 항원을 표면에 발현하는 형질전환 효모의 경우 표면에 결합한 항체에 의한 형광을 확인할 수 있었으며, 형광은 항원의 수가 증가할수록 더 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
이 plasmid는 FACS를 이용하여 양성clone을 선별함에 있어서, 본 plasmid를 보유하고 있는 형질전환 clone을 GFP 형광 발현을 이용해서 선별하기 위하여 도입하였다. 둘째, 효모의 표면에 총 10개의 c-myc epitope이 발현되는 리포터 시스템을 효모 유전체 상에 구축하였다. 반복되는 myc epitope이 효모 표면 발현 단백질인 Agα1 (SAG1) 단백질의 C말단 약 300개 아미노산 부분과 fusion 형태로 효모표면에 발현될 수 있도록 하였다.
따라서 분석 과정을 효율적인 방향으로 발전시키기 위하여 새로운 형태의 리포터 시스템을 적용하는 것이 본 연구의 궁극적인 목표이다. 따라서 yeasttwo-hybrid assay의 한천배지 사용을 대체하기 위한 대안으로FACS를 사용하는 것이 대규모 분석에 매우 적합하다고 판단하였고 이를 이용하기 위한 리포터 시스템을 구축하였다(Fig. 1).
하지만 대규모단백질 상호작용체 분석을 수행하기에 요구되는 노동과 대량의 한천배지 사용에 따른 문제에 의해 널리 사용되지 못하고 있다. 따라서 본 연구에서는 새로운 리포터 시스템을 yeasttwo-hybrid 방법에 도입하여 fluorescence-activated cell sorting(FACS) 또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 상호작용 파트너 단백질을 포함하는 효모 클론을 손쉽게 선별할 수 있도록 하였다. 새로운 리포터 시스템은 c-myc 항원결정기가 총 10번 반복되는 형태로 효모 표면에 발현되도록 하였으며, p53과 SV40 T항원을 이용한 실험을 통하여 리포터단백질의 정상적인 발현을 flow cytometry 분석을 통하여 확인하였다.
먼저 효모 표면에 항원이 발현될 수 있도록 하기 위하여 효모의 표면에 위치하는 단백질인 Agα1 (SAG1)을 이용하여 항원이 효모 표면에 발현되도록 하였다.
반복되는 myc epitope이 효모 표면 발현 단백질인 Agα1 (SAG1) 단백질의 C말단 약 300개 아미노산 부분과 fusion 형태로 효모표면에 발현될 수 있도록 하였다.
본 연구를 통하여 새롭게 개발된 리포터를 효모의 유전체에 삽입하기 위하여 pRS303 (YIP) plasmid에 pGAL1-Agα1-myc10리포터 카세트를 cloning하여 pRS-pGAL1-Agα1-myc10 plasmid를 제작하고, HIS3 ORF를 이용한 homologous DNA recombination을 통하여 효모의 유전체 상에 리포터 카세트가 삽입된 SK10효모균주를 확보하였다.
Myc5 및 myc10 tandem repeat epitope은 pADH-Aga2-myc10(unpublished)을 주형으로 myc5는 Myc5, 10 (F) MluI, Myc5(R) HindIII, myc10은 Myc5, 10 (F) MluI, Myc10 (R) HindIIIprimer를 이용하여 PCR을 통하여 얻은 후 제한효소 MluI과HindIII를 처리하여 pGAL1-Agα1-myc1에 재조합하여 pGAL1-Agα1-myc5, pGAL1-Agα1-myc10 벡터를 제작하였다. 본 연구를 통하여 제작된 모든 벡터는 sanger sequencing을 통하여 정확한 염기서열을 검증하였다.
따라서 본 연구에서는 새로운 리포터 시스템을 yeasttwo-hybrid 방법에 도입하여 fluorescence-activated cell sorting(FACS) 또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 상호작용 파트너 단백질을 포함하는 효모 클론을 손쉽게 선별할 수 있도록 하였다. 새로운 리포터 시스템은 c-myc 항원결정기가 총 10번 반복되는 형태로 효모 표면에 발현되도록 하였으며, p53과 SV40 T항원을 이용한 실험을 통하여 리포터단백질의 정상적인 발현을 flow cytometry 분석을 통하여 확인하였다. 따라서, 새로운 리포터 시스템을 도입한 yeast twohybrid방법은 대규모 상호작용체 분석을 위해 필요한 노력을 현저히 줄일 수 있을 것으로 기대한다.
따라서 본 연구는 새로운 yeast two-hybrid 리포터 개발을 통해서 대규모 선별과정을 보다 효율적으로 수행할 수 있게 하였다. 새로운 리포터 유전자는 반복된 항원(c-myc epitope)을 효모 표면에 발현하고, 형광 또는 자성 물질이 표지된 항체의 염색을 통하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS)또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 손쉽게 리포터를 발현하는 효모 세포를 선별하였다. 결과적으로 새로운 리포터 유전자의 도입에 따라 기존 분석방법의 한천배지 사용을 제거함으로써 분석 비용과 시간, 노동력을 현저히 낮출 수 있고, 높은 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 이용한 대규모 단백질 결합 분석을 쉽게 수행할 수 있을 것으로 기대한다.
TurboGFP유전자는 pGIPZ plasmid를 주형으로 TurboGFP (F) SacII,TurboGFP STOP (R) AscI primer를 이용하여 PCR 증폭하였고 벡터는 pGADT7과 pGADT7-T를 주형으로 pGADT7-Leu2-[turboGFP] (F) SacII, pGADT7-Leu2-[turboGFP] (R) Asc1primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. 얻어진 벡터와 TurboGFP유전자를 SacII와 AscI 제한효소 자리를 이용하여 재조합 하였다.
1A). 이 plasmid는 FACS를 이용하여 양성clone을 선별함에 있어서, 본 plasmid를 보유하고 있는 형질전환 clone을 GFP 형광 발현을 이용해서 선별하기 위하여 도입하였다. 둘째, 효모의 표면에 총 10개의 c-myc epitope이 발현되는 리포터 시스템을 효모 유전체 상에 구축하였다.
본 연구를 통하여 새롭게 개발된 리포터를 효모의 유전체에 삽입하기 위하여 pRS303 (YIP) plasmid에 pGAL1-Agα1-myc10리포터 카세트를 cloning하여 pRS-pGAL1-Agα1-myc10 plasmid를 제작하고, HIS3 ORF를 이용한 homologous DNA recombination을 통하여 효모의 유전체 상에 리포터 카세트가 삽입된 SK10효모균주를 확보하였다. 이 균주에서 이미 물리적 결합이 확인된 p53과 SV40 large T 항원을 이용하여 SK10 효모균주에서 myc10 리포터의 정상적인 발현을 확인하였다(Fig. 4). DBD와 AD plasmid를 갖는 형질전환 효모를 SD/-Leu, Trp 한천배지 상에서 배양 후, 10개 colony를 한곳에 모은 후, 형광 염료가표지된 항체 및 flow cytometry를 이용하여 리포터 발현 정도,즉 효모 표면에 발현되는 c-myc 항원 양을 측정하였다.
특정집단을 선택적으로 선별할 수 있는 FACS 기술에 사용될 수 있는 형태의 리포터가 대규모 단백질 상호작용체 분석에 적합하다고 판단하였다. 이를 위해서 효모 표면에 특정 항원을 발현하는 리포터를 제작, 분석하였다. 먼저 효모 표면에 항원이 발현될 수 있도록 하기 위하여 효모의 표면에 위치하는 단백질인 Agα1 (SAG1)을 이용하여 항원이 효모 표면에 발현되도록 하였다.
3A). 제작된 plasmid는 EBY100 (Invitrogen) 효모 균주에 형질전환 하였다. 각 형질전환체에서 galactose를 이용하여 발현을 유도한 후, 효모 표면에 발현된 c-myc 항원을 형광 염료가 표지된 항체를 이용하여 염색한 후 형광 현미경과 flow cytometry를 이용하여 c-myc항원의 발현 정도를 관찰하였다(Fig.
첫째, pGADT7 (전사 활성 도메인 융합 단백질을 발현하는plasmid)의 LEU2 유전자에 TurboGFP 유전자를 결합하여LEU2-GFP 융합단백질이 발현되는 pGAD-tGFP plasmid를 제작하였다(Fig. 1A). 이 plasmid는 FACS를 이용하여 양성clone을 선별함에 있어서, 본 plasmid를 보유하고 있는 형질전환 clone을 GFP 형광 발현을 이용해서 선별하기 위하여 도입하였다.
필요에 따라서 ampicillin (100 μg/ml), tetracycline(12.5 μg/ml) 또는 kanamycin (25 μg/ml)을 첨가하여 재조합벡터를 포함하고 있는 대장균을 선별하였다.
반복되는 myc epitope이 효모 표면 발현 단백질인 Agα1 (SAG1) 단백질의 C말단 약 300개 아미노산 부분과 fusion 형태로 효모표면에 발현될 수 있도록 하였다. 형광 단백질을 사용하지 않고 효모 표면에 발현되는 myc epitope 항원을 리포터로 사용함으로써 응용범위를 넓혔다. 즉, 항원을 사용했을 때 형광염료가 표지된 항체 염색을 통하여 FACS 선별도 가능하고, 항체가 표면에 부착된 자성 bead를 이용한 MACS 선별을 수행할 수 있다.
효모 표면 mycepitope 발현 벡터는 pYD1 (Invitrogen)를 기반으로 제작하였다. Agα1 유전자는 EBY100 효모 균주의genomic DNA를 주형으로 Agα1 (F) BglII, AgαI (R) PmeIprimer를 이용하여 PCR 산물을 얻은 후 제한효소 BglII와PmeI 이용하여 pYD1 벡터에 재조합하여 pGAL1-Agα1 벡터의 구축하였다.

대상 데이터

6Rcan1 GAL, Invitrogen) 효모 균주를 사용하였다. Yeast two-hybrid분석은 JC993 (MATa gal4 gal80 trp1-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3 URA3::GAL1-LacZ, ATCC 204097) 균주를 사용하였다. 효모 균주 배양은 완전배지 YPD (1% Yeast extract, 2%Peptone, 2% Glucose)와 최소배지 SDCAA (6.
리포터 유전자의 발현수준은 EBY100 (MATa GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2Δ1 his3Δ200 pep4::HIS2 prb1Δ1.6Rcan1 GAL, Invitrogen) 효모 균주를 사용하였다.
본 연구에서 사용된 대장균주는 Escherichia coli Top10F'(F'{lacIq Tn10(TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galUgalK rpsL endA1 nupG, Invitrogen)이며, 재조합 벡터의 수용, 보존, 증폭 및 회수에 이용하였다.
항원으로는 c-myc epitope (EQKLISEEDL)을 사용하였고, 항원 수에 따른 리포터의 효용성 차이가 있을것으로 예상되어 항원 수를 1개(pGAL1-Agα1-myc1), 5개(pGAL1-Agα1-myc5), 10개(pGAL1-Agα1-myc10)를 포함하는 발현 plasmid를 제작하였다(Fig. 3A).
Yeast two-hybrid분석은 JC993 (MATa gal4 gal80 trp1-901 ura3-52 leu2-3 leu2-112 his3 URA3::GAL1-LacZ, ATCC 204097) 균주를 사용하였다. 효모 균주 배양은 완전배지 YPD (1% Yeast extract, 2%Peptone, 2% Glucose)와 최소배지 SDCAA (6.7% Yeast nitrogenbase, Amino acid drop out mixture, 2% Glucose, 형질전환체선별 및 유지에 사용), SGCAA (6.7% Yeast nitrogen base,Amino acid drop out mixture, 2% Galactose, 1% Raffinose, 리포터 유전자의 발현유도에 사용)를 사용하였다. 한천배지에는 1.

데이터처리

한천배지 상의 효모 colony형광 관찰에는 Leica DM IL LED (inverted microscope)를 사용하였다. 현미경 이미지는 MetaMorph (Molecular Devices)software를 이용해서 분석하였다.

이론/모형

Cy5에 의한 형광은 633 nm laser를 이용하여 excitation을 유도하였고, 이를 통한 emission은 FL10 detector (650/40 band pass filter)를 통하여 확인하였다. 데이터의 분석에는 Kaluza (Backman coulter)분석 프로그램을 사용하였다.
본 연구에서는 slide glass를 이용한 효모의 형광을 확인하기 위하여 Leica DM2500 (upright microscope)를 사용해서GFP 및 RFP 형광을 관찰하였다. 한천배지 상의 효모 colony형광 관찰에는 Leica DM IL LED (inverted microscope)를 사용하였다. 현미경 이미지는 MetaMorph (Molecular Devices)software를 이용해서 분석하였다.

성능/효과

2A). pGAD-tGFP plasmid를 보유하고 있는 형질전환 효모에서만 GFP 형광이 발현되는 것으로 보아 LEU2-turboGFP가 정상적으로 발현되고 있는 것을 확인하였다.
이를 통하여 제작된 리포터 발현 카세트가 정상적으로 제작되었음을 확인하였다. 동시에 yeast two-hybrid 분석에 리포터로써 항원 수가 가장 많은 10개의 항원으로 구성된 리포터가 분석에 가장 유리할 것이라고 판단하였다. 그 이유는 단백질 간의 약한 물리적 결합이 발생할 경우, 리포터 발현 수준이 상대적으로 낮을 것으로 예측할 수 있고, 이 경우 항원 수가 적은 리포터를 사용하였을 때 선별이 되지 않을 가능성이 높기 때문에 가급적 항원 수가 많은 리포터를 적용하여 상대적으로 약한 물리적 결합까지 측정하기 위함이다.
4). 또한 pGAD-tGFP plasmid 경우,GFP 형광을 보유하고 있는 효모에서만 리포터 유전자의 발현이 확인되는 것으로 보아 LEU2-GFP 발현에 따른 형질전환체 선별이 효과적으로 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
DBD와 AD plasmid를 갖는 형질전환 효모를 SD/-Leu, Trp 한천배지 상에서 배양 후, 10개 colony를 한곳에 모은 후, 형광 염료가표지된 항체 및 flow cytometry를 이용하여 리포터 발현 정도,즉 효모 표면에 발현되는 c-myc 항원 양을 측정하였다. 물리적결합이 검증된 p53과 SV40 T을 발현하는 plasmid를 함께 보유하는 형질전환 효모 경우, c-myc 항원이 표면에 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, SV40 T 대신에 p53과 물리적인 결합이 없는 lamin A 형질전환 효모 경우, 리포터가 전혀 발현되지 않았다(Fig. 4). 또한 pGAD-tGFP plasmid 경우,GFP 형광을 보유하고 있는 효모에서만 리포터 유전자의 발현이 확인되는 것으로 보아 LEU2-GFP 발현에 따른 형질전환체 선별이 효과적으로 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig.
온전한 Agα1을 발현하였을 때에 효모 표면에 항체가 염색되지 않는 것과 비교하여 c-myc 항원을 표면에 발현하는 형질전환 효모의 경우 표면에 결합한 항체에 의한 형광을 확인할 수 있었으며, 형광은 항원의 수가 증가할수록 더 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
3). 이를 통하여 제작된 리포터 발현 카세트가 정상적으로 제작되었음을 확인하였다. 동시에 yeast two-hybrid 분석에 리포터로써 항원 수가 가장 많은 10개의 항원으로 구성된 리포터가 분석에 가장 유리할 것이라고 판단하였다.
특정집단을 선택적으로 선별할 수 있는 FACS 기술에 사용될 수 있는 형태의 리포터가 대규모 단백질 상호작용체 분석에 적합하다고 판단하였다. 이를 위해서 효모 표면에 특정 항원을 발현하는 리포터를 제작, 분석하였다.
pGADT7또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하는 형질전환 효모의 성장을 비교하여 LEU2-turboGFP 단백질이 효모 성장에 미치는영향을 확인하였다. 한천 배지 또는 액체 배지 배양 상에서 진행된 두 실험에서 pGADT7 또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하고 있는 형질전환 효모들의 성장이 거의 차이가 없는 것을확인하였다(Fig. 2B and C).

후속연구

새로운 리포터 유전자는 반복된 항원(c-myc epitope)을 효모 표면에 발현하고, 형광 또는 자성 물질이 표지된 항체의 염색을 통하여 fluorescence-activated cell sorting (FACS)또는 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용하여 손쉽게 리포터를 발현하는 효모 세포를 선별하였다. 결과적으로 새로운 리포터 유전자의 도입에 따라 기존 분석방법의 한천배지 사용을 제거함으로써 분석 비용과 시간, 노동력을 현저히 낮출 수 있고, 높은 수준의 다양성을 갖는 라이브러리를 이용한 대규모 단백질 결합 분석을 쉽게 수행할 수 있을 것으로 기대한다.
새로운 리포터 시스템은 c-myc 항원결정기가 총 10번 반복되는 형태로 효모 표면에 발현되도록 하였으며, p53과 SV40 T항원을 이용한 실험을 통하여 리포터단백질의 정상적인 발현을 flow cytometry 분석을 통하여 확인하였다. 따라서, 새로운 리포터 시스템을 도입한 yeast twohybrid방법은 대규모 상호작용체 분석을 위해 필요한 노력을 현저히 줄일 수 있을 것으로 기대한다.
다음 TurboGFP 유전자와 연결되어 있는 LEU2 유전자가효모 내, plasmid 도입을 확인하기 위한 선발표지 유전자로 사용되기 때문에 LEU2-turboGFP 단백질이 효모 성장에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. 만약 융합된 turboGFP 단백질이LEU2 단백질 기능에 영향을 준다면 추후에 진행될 yeast twohybrid분석 결과에 영향을 줄 가능성이 존재하였다. pGADT7또는 pGAD-tGFP plasmid를 보유하는 형질전환 효모의 성장을 비교하여 LEU2-turboGFP 단백질이 효모 성장에 미치는영향을 확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	yeast two-hybrid assay는 무엇을 선별하는 방법인가?	그 중에서도 yeast two-hybrid assay는 효모 세포 내에서 특정 단백질에 물리적으로 결합하는 상호작용 파트너 단백질을 선별하기 위하여 고안된 방법이다. 그 원리는 전사인자의 DNA결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 서로 다른 plasmid에서특정 단백질과 융합된 형태로 발현하였을 때, 각 도메인에 융합된 단백질 간의 물리적 결합으로 하나의 복합체(complex)를 이루게 되면서 리포터 유전자의 발현을 유도하고, 이들 근거로 단백질 간의 물리적 결합 유무를 판별한다.
	yeast two-hybrid assay에서 사용하는 리포터 유전자로 무엇이 있는가?	일반적으로DNA 결합 도메인에는 연구대상 단백질을 융합하고 전사 활성 도메인에는 라이브러리를 구성하여 특정 단백질에 결합하는 파트너 단백질을 선별하는 형식이 가장 널리 사용되고 있다. 대표적인 리포터는 LacZ, MEL1의 효모 colony의 색상변화를 유도하는 유전자와 HIS3, ADE2, URA3의 특정 아미노산이나 핵산의 합성에 관련된 유전자들이 알려져 있다(Fieldsand Song, 1989; Fields and Sternglanz, 1994; Van Criekingeand Beyaert, 1999; Sambrook and Russell, 2006; Bruckner etal., 2009).
	최근 사용되고 있는 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법은 무엇이 있는가?	생화학(biochemistry), 단백질체학(proteomics), 분자 동력학(molecular dynamics), 신호 전달(signal transduction) 등의다양한 학문에서 단백질 간의 상호작용을 밝히기 위한 노력이현재까지 지속되고 있다. 최근 사용되고 있는 단백질 간의 상호작용을 분석하는 방법들은 co-immunoprecipitation (co-IP),fluorescence resonance energy transfer (FRET), yeast twohybridassay 및 bimolecular fluorescence complementation(BiFC) 등이 잘 알려져 있다(Rual et al., 2005; Berggard et al.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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