Propionibacterium acnes (P. acnes)는 모낭과 모공 속에 존재하며 세포 찌꺼기, 피지 및 주변 피부 조직의 대사 부산물을 에너지와 영양소로 사용한다. 과도한 피지생성과 모낭의 막힘으로 피지 생성이 증가하면 P. acnes의 증식 및 성장을 유발할 수 있다. 모낭에 있는 P. acnes의 급속한 성장은 염증을 일으킬 수 있는 세포 손상, 신진 대사 부산물을 생성한다. 본 연구는 S. iscoensis Hieron. (S. iscoensis) 추출물이 P. acnes에 의한 염증반응을 조절할 가능성이 있는지 확인하고, 그 신호 전달 기전을 밝히고자 하였다. S. iscoensis 추출물은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7에서 P. acne에 의해 유도되는 IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$, iNOS와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 매우 효과적으로 억제하였다. 이러한, 염증성 사이토카인의 발현 억제는 NF-${\kappa}B$와 NF-AT와 같은 전사 조절 인자의 활성화 저해를 통해 일어남을 확인하였다. 그러나, MAPK 신호 전달 기전과는 상관이 없음을 확인하였다. 이 연구는 S. iscoensis 추출물이 여드름의 치료제로 사용될 가능성이 있음을 최초로 제안한다.
Propionibacterium acnes (P. acnes)는 모낭과 모공 속에 존재하며 세포 찌꺼기, 피지 및 주변 피부 조직의 대사 부산물을 에너지와 영양소로 사용한다. 과도한 피지생성과 모낭의 막힘으로 피지 생성이 증가하면 P. acnes의 증식 및 성장을 유발할 수 있다. 모낭에 있는 P. acnes의 급속한 성장은 염증을 일으킬 수 있는 세포 손상, 신진 대사 부산물을 생성한다. 본 연구는 S. iscoensis Hieron. (S. iscoensis) 추출물이 P. acnes에 의한 염증반응을 조절할 가능성이 있는지 확인하고, 그 신호 전달 기전을 밝히고자 하였다. S. iscoensis 추출물은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7에서 P. acne에 의해 유도되는 IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$, iNOS와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 매우 효과적으로 억제하였다. 이러한, 염증성 사이토카인의 발현 억제는 NF-${\kappa}B$와 NF-AT와 같은 전사 조절 인자의 활성화 저해를 통해 일어남을 확인하였다. 그러나, MAPK 신호 전달 기전과는 상관이 없음을 확인하였다. 이 연구는 S. iscoensis 추출물이 여드름의 치료제로 사용될 가능성이 있음을 최초로 제안한다.
Propionibacterium acnes (P. acnes) lives in the hair follicles and pores, and it uses cell debris, sebum and metabolic byproducts of surrounding skin tissues as energy and nutrients. Increased production of sebum due to sebaceous hyperplasia or blockage of the follicle can cause growth and prolifera...
Propionibacterium acnes (P. acnes) lives in the hair follicles and pores, and it uses cell debris, sebum and metabolic byproducts of surrounding skin tissues as energy and nutrients. Increased production of sebum due to sebaceous hyperplasia or blockage of the follicle can cause growth and proliferation of P. acnes. The rapid growth of P. acnes in follicles produces cell damage, metabolic byproducts and bacterial chips, which can cause inflammation. In this study, we examined the possibility of Senecio iscoensis Hieron. (S. iscoensis) extract to regulate P. acnes-induced inflammatory signaling pathways. We observed that S. iscoensis extract effectively inhibited P. acnes-induced pro-inflammatory cytokine expressions such as IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$, and iNOS in mouse macrophage cell line Raw 264.7. The inhibitory effect of S. iscoensis in pro-inflammatory cytokine levels was accompanied by the inhibition of the transcription factors NF-${\kappa}B$ and NF-AT. However, S. iscoensis did not alter the P. acnes-induced MAPK signaling pathways. This study first suggests the potential of using S. iscoensis extract as an alternative agent for the treatment of acne.
Propionibacterium acnes (P. acnes) lives in the hair follicles and pores, and it uses cell debris, sebum and metabolic byproducts of surrounding skin tissues as energy and nutrients. Increased production of sebum due to sebaceous hyperplasia or blockage of the follicle can cause growth and proliferation of P. acnes. The rapid growth of P. acnes in follicles produces cell damage, metabolic byproducts and bacterial chips, which can cause inflammation. In this study, we examined the possibility of Senecio iscoensis Hieron. (S. iscoensis) extract to regulate P. acnes-induced inflammatory signaling pathways. We observed that S. iscoensis extract effectively inhibited P. acnes-induced pro-inflammatory cytokine expressions such as IL-$1{\beta}$, TNF-${\alpha}$, and iNOS in mouse macrophage cell line Raw 264.7. The inhibitory effect of S. iscoensis in pro-inflammatory cytokine levels was accompanied by the inhibition of the transcription factors NF-${\kappa}B$ and NF-AT. However, S. iscoensis did not alter the P. acnes-induced MAPK signaling pathways. This study first suggests the potential of using S. iscoensis extract as an alternative agent for the treatment of acne.
추출과정은 한국생명공학연구원 해외생물소재센터에서 수행하였고, 분양 받은 추출물을 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다(분양 번호 FBMI 138-051). DMSO를 처리한 군을 대조군으로 모든 실험을 수행하였다. 로 배양하였으며, FOCUS TM Membrane Proteins extraction kit (G Biosciences)를 사용하여 제조사에서 제공한 buffer와 manual에 따라 P.
RAW 264.7 세포주를 24시간 배양한 후 100 μg/ml 농도의 S. iscoensis 추출물을 처리하여 3, 6, 12, 24시간 배양하거나 25, 50, 100, 200 μg/ml 농도의 S. iscoensis 추출물을 처리하여 12시간 배양하였다.
RAW 264.7 세포주에 S. iscoensis 추출 물을 25 µg/ml과 100 µg/ml로 30분간 전처리 한 후 P. acnes의 membrane fraction을 200 µg/ml의 농도로 처리하였다.
S. iscoensis 추출물의 농도에 따른 세포독성을 확인하기 위해 25, 50, 100, 200 µg/ml의농도로 RAW 264.7 세포주에 처리하였다.
S. iscoensis가 P. acnes에 의해 증가된 염증성 사이토카인의 단백질 발현을 조절할 수 있는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포주에 S. iscoensis 추출물을 25 µg/ml과 100 µg/ml로 30분간 전처리 하였다.
iscoensis 추출물을 처리하여 12시간 배양하였다. Trypan blue dye (Sigma Aldrich)로 세포를 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 살아있는 세포의 수를 센 후 단위 부피당 세포의 수를 계산하였다.
MAPKs (mitogen activated protein kinases)에는 ERK, JNK, p38 MAPK가 포함되며 전사인자인 NF-κB, AP-1를 활성화 시켜 염증반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 다음으로 S.iscoensis가 MAPK의 활성을 조절하는지를 확인하였다(Fig. 5). 그 결과 P.
또한, IL-1β를포함한 많은 염증성 사이토카인의 발현을 조절하는 것으로 알려진 전사인자인 NF-κB와 STAT3의 활성화를 S. iscoensis가조절하는지 확인하였다.
또한, S. iscoensis 추출물의 시간에 따른 세포독성을 확인하기 위해 100 µg/ml의 농도로 처리하고 3, 6, 12시간 동안 배양하였다.
iscoensis 추출물이 억제 함으로써 나타난다는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 P. acnes 의 membrane fraction을 이용하여 염증반응을 유도하였다. P.
여드름 유발균은 reinforced clostridial medium (Merck Millipore)에서 37°C, 혐기 조건으로 배양하였으며, FOCUS TM Membrane Proteins extraction kit (G Biosciences)를 사용하여 제조사에서 제공한 buffer와 manual에 따라 P. acnes의 membrane fraction을 분리하였다.
염증반응 주요 조절 세포인 대식세포에 S. iscoensis 추출물이 독성을 나타내는 농도와 시간을 확인하기 위해 trypan blue 를 이용한 생존 세포수를 측정하였다. S.
이러한 결과를 바탕으로 이후의 모든 실험은 세포생존율을 70% 이상을 유지하는 25, 100 µg/ml의 농도로 6시간 이내의 처리 조건으로 실시하였다.
이후 P. acnes의 membrane fraction을 200 µg/ml의 농도로 처리하고 6시간 후 Western blot을 통해 IL-1β의 단백질 발현량을 확인하였다.
acnes의 membrane fraction을 200 µg/ml 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 lysis하여 luminometer를 이용해 luciferase activity를 측정하였다.
9% 메탄올로 상온에서 3일 동안 2시간 간격으로 15분씩 초음파 처리하였다. 추출물은 여과 후 회전증발기(N-1000S WD, EYELA)를이용하여 농축하였다. 농축된 시료는 건조기(Modulspin 40, Biotron Corporation, Modul spin 40)로 건조하였다.
대상 데이터
KCTC생물자원센터에서 여드름 유발균인 P. acnes (KCTC 3314)를 분양 받아 사용하였다. 여드름 유발균은 reinforced clostridial medium (Merck Millipore)에서 37°C, 혐기 조건으로 배양하였으며, FOCUS TM Membrane Proteins extraction kit (G Biosciences)를 사용하여 제조사에서 제공한 buffer와 manual에 따라 P.
RAW 264.7 세포주는 ATCC에서 구입하였고, DMEM (Gibco) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco), 1% penicillin 과 streptomycin (Gibco)을 첨가하여 37°C, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다.
농축된 시료는 건조기(Modulspin 40, Biotron Corporation, Modul spin 40)로 건조하였다. 추출과정은 한국생명공학연구원 해외생물소재센터에서 수행하였고, 분양 받은 추출물을 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다(분양 번호 FBMI 138-051). DMSO를 처리한 군을 대조군으로 모든 실험을 수행하였다.
데이터처리
모든 결과는 CFX ManagerTM software version 3.0 (Bio-Rad)을 이용하여 분석하였으며, β-actin을 이용하여 normalization 하였다.
모든 실험결과는 3회 반복 실험에 대한 평균(mean) ± 표준 편차(SD)로 표시하였고, unpaired student’s t-test를 시행하여 p < 0.05인 경우 유의적인 것으로 판정하였다.
이론/모형
cDNA는 Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (Promega)를 이용하여 합성하고 quantitative PCR을 수행한다. Quantitative PCR은 SYBR Green real-time PCR master mix (TOYOBO)를 사용하여 수행한다. 모든 결과는 CFX ManagerTM software version 3.
성능/효과
12시간 후 Trypan blue dye exclusion으로 확인한 결과 25 µg/ml의 농도에서 세포생존율은 93%, 50 µg/ml의 농도에서 94.4%, 100 µg/ml의농도에서 78.3%, 200 µg/ml의 농도에서 57.1%로 나타났다 (Fig. 1A).
S. iscoensis 추출물은 마우스 대식세포주인 Raw 264.7에서 P. acne에 의해 유도되는 IL-1β, TNF-α, iNOS와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 매우 효과적으로 억제하였다.
S. isoensis에 의한 basal 활성이 높아짐에도불구하고, 고농도에서는 P. acne에 의한 전반적인 IκB의 인산 화는 억제가 되었다.
그 결과 P. acnes에 의해 증가했던 IL-1β의 단백질 발현량이 S. iscoensis에 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 3A and B).
5). 그 결과 P. acnes에 의해 증가했던 p-ERK, p-JNK, p-p38의인산화는 S. iscoensis에 의해 감소하지 않는 것을 확인하였다 (Fig. 5A-D). 따라서, S.
그 결과 S. iscoensis 추출물을 100 µg/ml의 농도로 처리 후 3시간이 지났을 때 세포생존율은 95.4%, 6시간에서는 77.7%, 12시간에서는 70.9%로 나타났다(Fig. 1B).
그 결과, P. acnes에 의해 증가하였던 IL-1β, TNF-α, iNOS의 mRNA 발현량이 S. iscoensis에 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할수 있었다(Fig. 2A-C).
이러한, 염증성 사이토카인의 발현 억제는 NF-κB와 NF-AT와 같은 전사 조절 인자의 활성화 저해를 통해 일어남을 확인하였다. 그러나, MAPK 신호 전달 기전과는 상관이 없음을 확인하였다.
2A-C). 따라서, S. iscoensis 추출물이 염증성 사이토카인 유전자의 발현을 감소시킴으로써 P. acnes에 의해 유도되는 염증반응을 억제함을 확인하였다.
5A-D). 따라서, S. iscoensis에 의해 일어나는 면역 억제 기능에는 MAPK를 통한 신호 전달 경로를 경유하지 않음을 알 수 있었다.
acnes의 막에는 lipoteichoic acids (LTA), peptidoglycan (PG), lipoproteins 성분이 Toll Like Receptor 2 (TLR2)를 자극하여 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, lipopolysaccharide (LPS) 처리에 의한 염증반응 유도보다, 좀 더 acne에특이적인 염증을 유발할 수 있는 조건에서 실험을 수행할 수 있으며 또한 동물세포에 유발될 수 있는 bacterial contamination 도 예방할 수 있는 장점이 있다.
마찬가지로, P. acnes에 의해 증가했던 IκB와 STAT3의 인산화가 S. iscoensis에 의해 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 3A, C, and D).
본 연구에서는 여드름 원인균인 P. acnes의 membrane fraction 을 대식세포주인 Raw 264.7에 처리하였을 때 증가하는 IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토카인과 iNOS와 같은 면역반응관련 유전자의 발현이 S. iscoensis 추출물에 의해 억제될 수 있다는 것을 처음으로 확인하였다.
염증반응 최종 마커 사이토카인인 IL-1β의 발현 및 STAT 의 인산화는 S. iscoensis에 의해 농도 의존적으로 줄었으나, 그상위 경로인 IκB의 인산화는 S. iscoensis 단독처리에 의해서도 상당히 증가되는 현상이 있었다(Fig. 3).
이러한 면역억제 효과는 전사인자인 NF-κB와 NF-AT 활성을 S. iscoensis 추출물이 억제 함으로써 나타난다는 것을 확인하였다.
이러한 염증 매개 전사 인자의 활성화를 reporter analysis를 통해 분석한 결과에서도, S.iscoensis는 P. acnes에 의해 증가했던 NF-κB-luciferase와 NF-AT- luciferase reporter luciferase 활성을 크게 감소시킴을 확인하였다(Fig. 4A and B).
이러한, 염증성 사이토카인의 발현 억제는 NF-κB와 NF-AT와 같은 전사 조절 인자의 활성화 저해를 통해 일어남을 확인하였다.
이를 통해 S. iscoensis 추출물은 전사인자인 NF-κB와 NF-AT 활성을 억제함으로써 염증성 사이토카인의 단백질 발현량을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
여드름은 무엇인가?
, 2017). 여드름은 낭종, 면포, 농포, 구진을 나타내는 만성 염증성 피부질환이다. 여드름은 스트레스, 유전, 외부환경과 같은 여러 가지 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다(Park, 2018).
여드름은 어떤 요인으로 나타나는가?
여드름은 낭종, 면포, 농포, 구진을 나타내는 만성 염증성 피부질환이다. 여드름은 스트레스, 유전, 외부환경과 같은 여러 가지 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다(Park, 2018). 그람 양성 혐기성균인 Propionibacterium acnes (P.
Propionibacterium acnes은 단핵구에서 무엇을 생산하도록 유도하는가?
P. acnes는 인터루킨(interleukin)-1β와 IL-8, 종양괴사 인자(tumor necrosis factor)-α를 포함한 염증성 사이토카인을 단핵구에서 생산하도록 유도한다(Vowels et al., 1995; Chen et al.
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