선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에, 사람의 각질형성세포인 HaCaT 세포를 활용하여 scratch wound healing assay를 실시하고 각질형성세포의 증식능을 BrdU assay로 평가하였다. 또한 각질형성세포의 세포주기의 변화에 주는 영향을 평가하여 유의적인 결과를 얻었기에 논문으로 발표하는 바이다.
- 본 연구에서는 ATO-ALL의 피부재생 효과를 확인하기 위해 인간유래 피부 각질형성세포인 HaCaT 세포에 대한 세포의 증식능을 측정하였다. 그 결과, HaCaT 세포에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였으며, 농도의존적으로 세포 증식을 촉진하여 피부재생 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
- ), 매실 (Prunus mume), 마치현 (Portulaca oleracea), 인삼 (Panax ginseng)으로 구성된 천연추출물 소재다. 본 연구에서는 ATO-ALL이 나타내는 피부재생 효능을 검증하고자 하였다. 이에, 사람의 각질형성세포인 HaCaT 세포를 활용하여 scratch wound healing assay를 실시하고 각질형성세포의 증식능을 BrdU assay로 평가하였다.
제안 방법
- 0.7, 7, 70 ppm 농도의 ATO-ALL과 양성 대조군인 epidermal growth factor (EGF, Sigma Aldrich, USA)를 세포에 처리하고 각 well에 10X BrdU solution을 10 μl 씩 넣어준 후, 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다.
- HaCaT 세포를 1×105cells/ml로 60 mm에 3 ml 씩 분주하고 24시간 동안 안정화시켰다. ATO-ALL을 0.7, 7, 70 ppm의 농도로 처리하고 24시간 동안 CO2incubator에서 배양한 후, cell scraper를 이용하여 세포를 수거하였다. PBS로 세포를 수세한 뒤 차가운 75% 에탄올로 세포를 풀어주고 –20℃ 냉동실에 24시간 동안 넣어두어 세포를 고정하였다.
- ATO-ALL의 세포재생에 대한 효과를 알아보고자 HaCaT 세포를 사용하여 scratch wound healing assay를 통해 그 효능을 관찰하였다. 대조군 (DMSO 1%)의 경우 48시간에는 26.
- ATO-ALL이 각질형성세포의 세포주기의 변화를 유도하여 세포재생 효능을 나타내는지 확인하고자 PI staining assay를 실시하고 flow cytometry로 측정하였다. 그 결과, 대조군의 G1/G0, S, G2/M phase에서 각각 43.
- ATO-ALL이 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 통해 세포독성을 관찰하였다. ATO-ALL을 HaCaT 세포에 0.
- FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교체한 후 각 well에 200 μl tip을 이용하여 스크래치를 내고 0.7, 7, 70 ppm 농도의 ATO-ALL과 양성 대조군인 ascorbic acid (Sigma Aldrich, USA)를 처리한 후 48시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다.
- 에탄올 추출액 형태로 제공받은 ATO-ALL을 rotary evaporator (Buchi, Switzerland)로 50℃에서 감압 농축하였다. 농축된 ATO-ALL을 액체 질소에 담가 완전히 얼린 뒤 동결 건조 (Hanil science medical, Daejeon, Korea)를 7일간 수행하여 액상상태의 시료를 확보하였다. 시료는 -80℃에 보관하였고 필요 시 phosphate buffered saline (PBS)에 희석하여 사용하였다.
- 낮은 농도의 ATO-ALL은 통계적인 유의성을 나타내지는 않았으나 세포의 생장을 촉진하는 것으로 나타났다. 따라서 ATO-ALL은 70 ppm 이내의 농도에서는 각질형성세포에 대한 세포독성이 없음을 확인하였으며, 이후 실험에서는 70 ppm 이내의 농도에서 실험을 실시하였다.
- 30분간 37℃에서 MTT formazan을 완전히 용해한 후 570 nm 파장에서 micro spectrophotometer (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 상대적 세포생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군의 생존율을 100%로 설정하고 흡광도의 상대적인 값을 비교하여 구하였다.
- 상온에서 30분 방치한 후 stop solution을 100 μl 씩 넣고 450 nm의 파장에서 micro spectrophotometer (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하여 세포의 증식능을 평가하였다.
- 7, 7, 70 ppm 농도의 ATO-ALL과 양성 대조군인 epidermal growth factor (EGF, Sigma Aldrich, USA)를 세포에 처리하고 각 well에 10X BrdU solution을 10 μl 씩 넣어준 후, 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 세포의 증식능은 BrdU Cell Proliferation Assay Kit (Cell Signaling Technology, USA) 를 이용하여 제품 제조사의 메뉴얼에 따라 수행하였다. 세포 배양액을 제거한 후, Fixing/Denaturing Solution을 100 μl 씩 넣어주고 30분 동안 상온에서 방치하였다.
- 7, 7, 70 ppm 농도의 ATO-ALL과 양성 대조군인 ascorbic acid (Sigma Aldrich, USA)를 처리한 후 48시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 시료 처리 후 0시간, 48시간대에 현미경을 이용하여 각 well의 중앙 부위에 위치하는 세포를 찍었으며, Image J 프로그램(ver1.46, NIH, USA)을 이용하여 0시간 대비 48시간에 세포가 증식된 면적을 계산하여 closure rate (%)를 구하였다.
- 에탄올을 제거한 후 PBS로 세포를 2회 수세하여 ethanol을 완전히 제거한 뒤 PI (20 μg/ml)/RNase (100 μg/ml) 1 ml을 30분 동안 처리하였다. 이후 flow cytometry (Becton Dickinson, USA)로 분석하였다.
대상 데이터
- ATO-ALL은 GL biotech (Daejeon, Korea) 에서 공급받아 사용하였다. 에탄올 추출액 형태로 제공받은 ATO-ALL을 rotary evaporator (Buchi, Switzerland)로 50℃에서 감압 농축하였다.
- 본 실험에 사용된 인간유래 피부 각질형성세포 (keratinocyte)인 HaCaT 세포는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS)과 100 U/ml penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, WELGENE Inc, Korea) 배지를 사용하여 37℃로 유지되는 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±SD (standard deviation)으로 표기하였다.
- 통계처리는 IBM SPSS Statistics 25 프로그램을 사용하였고, 일원배치 분산분석 (one way ANOVA) 시스템을 사용하여 Tukey’s HSD test로 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- The cells were treated with ATO-ALL as indicated concentrations or EGF (10 ng/ml) for 24 hr. The cell proliferation was measured by BrdU assay. (Nor; normal)
- 5-70 ppm for 24 hr. The cell viability was measured by MTT assay. Data are presented as mean±SD from three independent experiments.
- 본 연구에서는 ATO-ALL이 나타내는 피부재생 효능을 검증하고자 하였다. 이에, 사람의 각질형성세포인 HaCaT 세포를 활용하여 scratch wound healing assay를 실시하고 각질형성세포의 증식능을 BrdU assay로 평가하였다. 또한 각질형성세포의 세포주기의 변화에 주는 영향을 평가하여 유의적인 결과를 얻었기에 논문으로 발표하는 바이다.
성능/효과
- ATO-ALL을 HaCaT 세포에 48시간 처리한 결과 0.7 ppm에서는 closure rate이 21.8±1.4%로 나타나 저농도에서는 피부재생 효능이 거의 나타나지 않았다.
- ATO-ALL의 HaCaT 세포 증식에 미치는 효과를 보기 위해 BrdU assay를 실시한 결과, 대조군의 흡광도 값이 1.87±0.12였으나 ATO-ALL을 처리한 세포에서는 흡광도 값이 각각 0.7 ppm에서 2.13±0.13, 7 ppm에서 2.18±0.14, 70 ppm에서 2.32±0.18을 나타내어 ATO-ALL에 의하여 세포의 증식이 농도의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 ATO-ALL이 각질형성세포의 손상에 긍정적인 영향을 주는 것으로 나타났다. Scratch wound healing assay는 본 시료가 각질형성세포의 상처 치유에 효과적인 것을 보여주었다. 본 연구에서는 유의적인 변화를 나타낸 농도가 7 ppm으로 나타났다.
- 본 연구에서는 ATO-ALL의 피부재생 효과를 확인하기 위해 인간유래 피부 각질형성세포인 HaCaT 세포에 대한 세포의 증식능을 측정하였다. 그 결과, HaCaT 세포에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였으며, 농도의존적으로 세포 증식을 촉진하여 피부재생 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
- ATO-ALL이 각질형성세포의 세포주기의 변화를 유도하여 세포재생 효능을 나타내는지 확인하고자 PI staining assay를 실시하고 flow cytometry로 측정하였다. 그 결과, 대조군의 G1/G0, S, G2/M phase에서 각각 43.5%, 28.6%, 15.7%의 분포를 나타내었을 때, ATO-ALL을 0.7 ppm을 처리한 세포는 G1/G0, S, G2/M phase의 비율이 43.5%, 25.1%3.87%로 나타났으며, 7 ppm은 각각 49.4%, 26.0%, 3.40%이었고 70 ppm의 ATO-ALL을 처리한 세포들은 53.8%, 20.6%, 4.85%로 나타났다(Fig. 4). 따라서 ATO-ALL은 농도의존적으로 G1/G0 phase의 비율이 대조군에 비해 농도의존적으로 증가하고 있는 반면, S phase의 비율과 G2/M의 비율은 대조군에 비해 감소하는 것으로 보아 ATO-ALL은 피부세포의 세포주기의 변화에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
- 4). 따라서 ATO-ALL은 농도의존적으로 G1/G0 phase의 비율이 대조군에 비해 농도의존적으로 증가하고 있는 반면, S phase의 비율과 G2/M의 비율은 대조군에 비해 감소하는 것으로 보아 ATO-ALL은 피부세포의 세포주기의 변화에 영향을 주는 것으로 여겨진다.
- 09의 흡광도 값을 나타내었다. 따라서, ATO-ALL이 피부세포의 증식을 촉진하여 피부재생 효능을 나타내는 것으로 사료되며, 그 효과는 EGF보다 뛰어났다(Fig. 3).
- 비록 BrdU assay를 통해서 ATO-ALL이 세포의 증식을 유도한 것으로 나타났으나 통계적으로 유의적이지 않았다. 또한 세포주기를 관찰한 결과에서도 세포의 증식과 관련된 G2/S Phase의 세포수가 ATO-ALL에 의해 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 이는 ATO-ALL이 피부재생 과정에서 세포의 증식을 일정 수준까지 유도한 뒤 세포의 분화를 촉진하기 때문으로 여겨진다.
- 본 연구 결과 ATO-ALL은 각질형성세포의 피부재생 능력을 증진시키는 것을 보여진다. 이러한 과정은 세포의 증식을 유도하여 나타나는 것으로 보이나 세포증식에 대한 효능은 제한적으로 보여지는 것으로 여겨진다.
- 본 연구에서는 ATO-ALL이 각질형성세포의 손상에 긍정적인 영향을 주는 것으로 나타났다. Scratch wound healing assay는 본 시료가 각질형성세포의 상처 치유에 효과적인 것을 보여주었다.
- Scratch wound healing assay는 본 시료가 각질형성세포의 상처 치유에 효과적인 것을 보여주었다. 본 연구에서는 유의적인 변화를 나타낸 농도가 7 ppm으로 나타났다. 가장 높은 농도인 70 ppm에서는 오히려 7 ppm 보다 낮은 wound healing의 결과를 나타내었는데 이는 ATO-ALL에 포함된 기타 성분들 때문으로 여겨진다.
- 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid는 55.1±3.7%의 closure rate를 나타내어 대조군에 비해 피부재생 효능이 있음을 확인하였다.
- 4%의 closure rate를 나타내어 피부재생 효능이 있음을 알 수 있었다. 특히 7 ppm에서 가장 강한 피부재생 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
후속연구
- 이렇게 ATO-ALL이 각질형성세포의 피부재생에 나타내는 효능은 피부장벽이 손상된 아토피 피부염과 같은 피부질환에 본 추출물이 유효할 수 있음을 제시한다. 그러나 피부질환의 개선에 대한 ATO-ALL의 정확한 생리학적 기작과 함께 유효한 성분에 대한 연구는 향후 밝혀야 할 부분으로 남아있다.
- 따라서 ATO-ALL은 세포의 증식을 일정 수준까지만 유도한 뒤 각질형성세포의 분화를 이끄는 것으로 보인다. 향후 ATO-ALL이 각질형성 세포의 분화에 나타내는 효능에 대한 연구는 향후 진행해야 할 것으로 보인다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.