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문제 정의
- 본 실험은 대장암 세포인 HT-29, 위암세포 AGS, 흑색 종세포 A375SM에 각 농도별로 aloin을 처리했을 때, 각 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보았다. 또한 aloin이 대장암세포에서 세포자멸사를 유도하는 많은 경로 중 MAPK pathway를 통해 세포자멸사를 유도하는지 확인하였다.
제안 방법
- 75-cm2 flask에 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양시킨 HT-29 cell에 aloin 0, 200, 400 μM의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다.
- MTT assay 결과에 따라 세포 생존율이 유의하게 감소한 대장암 세포 HT-29 세포에 aloin 0, 200, 400 μM의 농도로 향후 실험을 진행하였다. Aloin 처리에 의한 세포 생존율 감소가 세포자멸사에 의한 것인지 확인하기 위해 DAPI staining과 flow cytometry를 실시하였다. HT-29에서 0, 200, 400 μM의 농도로 aloin을 처리한 후 DAPI staining을 진행하였을 때, 대조군에서는 apoptotic body가 보이지 않았지만 aloin 200, 400 μM에서 apoptotic body가 증가하는 것이 관찰되었고(Fig.
- MAPK 중 ERK1/2는 광범위하게 발현되며 세포의 분열, 유사 분열 등 조절에 관여하고, p38은 많은 사이토카인의 발현을 조절하고 호르몬 및 삼투압 쇼크 같은 스트레스를 비롯한 많은 다른 자극에 의해 활성화된다24). Aloin으로 인해 유도된 세포자멸사의 기전을 알아보기 위해 MAPK pathway에 속한 ERK1/2, p-38의 발현정도를 관찰하였다. MAPK pathway에서 p-ERK1/2는 대조군과 비교하였을 때 감소하였고, p-p38은 유의적으로 증가하였다(Fig.
- Aloin이 대장암 세포 HT-29, 흑색종 세포 A375SM, 위암 세포 AGS의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 각각 0, 100, 200, 300, 400 μM의 농도로 72시간 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다.
- Aloin이 세포사멸 관련 단백질에 미치는 영향을 확인하기 위해 HT-29에 aloin 0, 200, 400 μM을 72시간동안 처리한 후 western blot을 진행하였다.
- Cell pellet을 얻은 후 1X annexin buffer를 이용해 희석하여 HT-29 cell을 1×106 cells/mL로 현탁하였다. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin-V와 phycoerythrin (PE)-conjugated propidium iodide (PI)를 첨가시켜 15분간 반응시킨 후 유세포분석을 통해 측정하였다.
- HT-29 cell을 25-cm2 flask에 배양하여 24시간동안 배양한 후 aloin을 0, 200, 400 μM의 농도로 처리하여 CO2 incubator에 배양하였다.
- HT-29, A375SM, AGS에서의 aloin에 의한 세포 성장 억제를 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 96-well plate에 HT-29, A375SM, AGS를 2×104 cells/mL로 분주한 후 24시간동안 배양하였다.
- MTT assay 결과에 따라 세포 생존율이 유의하게 감소한 대장암 세포 HT-29 세포에 aloin 0, 200, 400 μM의 농도로 향후 실험을 진행하였다.
- Membrane은 5% skim milk로 2시간동안 blocking 후 anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p-ERK1/ 2, anti-ERK1/2, anti-p-p38, anti-p38, anti-β-actin을 첨가하여 4oC에서 overnight하였다. 그 후 TBS-T로 세척하고 antirabbit IgG를 첨가하여 2시간동안 반응시킨 후 ECL detection reagents (Promega, Madison, WI, USA)를 이용해 실험 결과를 보았다.
- 그 후 aloin을 0, 100, 200, 300, 400 μM의 농도로 각각 처리하여 72시간동안 배양하였다.
- 그 후 세포에 aloin을 0, 200, 400 μM의 농도로 처리하여 72시간동안 CO2 incubator에 배양하였다.
- 본 실험은 대장암 세포인 HT-29, 위암세포 AGS, 흑색 종세포 A375SM에 각 농도별로 aloin을 처리했을 때, 각 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보았다. 또한 aloin이 대장암세포에서 세포자멸사를 유도하는 많은 경로 중 MAPK pathway를 통해 세포자멸사를 유도하는지 확인하였다.
- 각 세포는 37oC, 5% CO2가 유지되는 incubator에서 배양하였고, flask에서 80-90%가 되었을 때 계대배양하였다. 배지 교체는 2-3일 간격으로 진행하였다.
- 그 후 paraformaldehyde를 제거하고 남아있는 고정액을 제거하기 위해 PBS로 세척하였다. 세척 후 DAPI solution을 2 mL씩 처리하여 형광현미경(Zeiss fluorescence microscope, Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA)으로 200배 시야에서 관찰하고 DAPI-positive cells을 정량화하여 분석하였다.
- 세포자멸사를 확인하기 위해 annexin-V staining kit (BD PharmingenTM , San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. HT-29 cell을 25-cm2 flask에 배양하여 24시간동안 배양한 후 aloin을 0, 200, 400 μM의 농도로 처리하여 CO2 incubator에 배양하였다.
- 세포자멸사의 특이적으로 나타나는 핵의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 DAPI staining을 진행하였다. HT-29세포를 60-dish에 3×105cells/mL로 분주하고 24시간동안 배양하였다.
대상 데이터
- 대장암 세포 HT-29, 위암 세포 AGS는 5% FBS, 1% streptomycin/penicillin이 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하고, 흑색종 세포 A375SM은 DMEM 배지를 사용하였다. 각 세포는 37oC, 5% CO2가 유지되는 incubator에서 배양하였고, flask에서 80-90%가 되었을 때 계대배양하였다.
- 본 실험에 사용된 aloin과 일반적인 시약들은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였고, anti-rabbit IgG, anti-caspase-3, anti-caspase-8, antiBcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-p-p38, anti-p38, anti-β-actin는 Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 대장암 세포 HT-29, 흑색종 세포 A375SM, 위암 세포 AGS는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)은 Welgene (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였으며, streptomycin/penicillin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
- 세포배양에 사용한 RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)은 Welgene (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였으며, streptomycin/penicillin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻은 실험결과는 3회 반복하였으며 모든 실험 결과는 평균치와 표준오차를 사용하여 나타내고 oneway ANOVA에 이은 각 군간 비교는 Dunnett’s t-test 분석을 실시하였다.
이론/모형
- Aloin에 의한 세포자멸 관련 단백질의 발현량을 보기 위해 western blot을 수행하였다. 75-cm2 flask에 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양시킨 HT-29 cell에 aloin 0, 200, 400 μM의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다.
- 그 후 13000rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 얻은 상등액을 cell lysate로 사용하였다. 추출한 단백질의 농도는 Bradford protein assay를 이용하여 정량하였다. 단백질을 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 크기별로 분리 후 nitrocellulose membrane (Bio-Rad)으로 이동시켰다.
성능/효과
- HT-29에서 0, 200, 400 μM의 농도로 aloin을 처리한 후 DAPI staining을 진행하였을 때, 대조군에서는 apoptotic body가 보이지 않았지만 aloin 200, 400 μM에서 apoptotic body가 증가하는 것이 관찰되었고(Fig. 3A, B), 또한 DAPI staining과 마찬가지로 HT-29에 aloin을 농도별(0, 200, 400 μM)로 처리하고 flow cytometry로 세포자멸사를 측정한 결과, 대조군과 비교했을 때 aloin 400 μM을 처리한 세포에서 유의적으로 apoptotic cell이 증가하였다(Fig. 4A, B).
- HT-29에서 세포 생존율은 200 μM에서 64.6%, 300 μM에서 49.9%, 400 μM에서 41.1%로 농도 의존적으로 감소하는 경향을 볼 수 있으나(Fig. 2A) A375SM과 AGS는 aloin 처리군과 처리하지 않은 대조군을 비교하였을 때 세포 생존율에서 유의적인 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B, C).
- 이는 같은 위암세포라도 돌연변이가 발생하는 위치가 다르기 때문에 나타난 결과라고 생각된다. 결과적으로 aloin은 대장암세포 HT-29에서 농도에 따라 유의적으로 세포 증식에 영향을 미치는 것을 확인하였는데 이는 A375SM, AGS와 HT-29의 돌연변이가 일어난 위치의 차이에 따른 결과라고 생각한다.
- 또한, Zhang 등23)의 연구에 따르면 폐암 세포 A549에 다양한 농도의 aloin (0, 50, 100 μM)으로 처리하였을 때, caspase-3, -8의 발현을 증가시켰는데 이와 유사하게 본 연구에서 대장암세포 HT-29에 aloin을 처리하였을 때, 내인성 경로의 대표적인 단백질 Bax와 외인성 경로의 caspase-8 그리고 cleaved-PARP, caspase-3이 증가하는 것으로 보아 aloin은 세포 사멸의 내인성 및 외인성 경로를 통해 세포 사멸을 유도하는 것으로 생각된다. 따라서aloin은 대장암 세포 HT-29에서 Bax, PARP, caspase cascade를 조절하여 세포자멸사를 유도하는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 aloin 0, 200, 400 μM을 대장암세포 HT-29에 72시간동안 처리하였을 때, DAPI를 통해 apoptotic body가 관찰되었으며, flow cytometry를 이용하여 annexin-V, PI를 측정하였을 때 농도 의존적으로 apoptotic cell이 증가하였는데 이 결과는 Lee 등8)의 연구와 Wang 등20)의 연구 결과와 유사한 결과를 보였다.
- 세포자멸사의 핵심 단백질인 caspase-3, -8은 증가하였고, DNA 수리에 관여하는 cleaved-PARP은 증가하였다(Fig. 5A).
- 의 연구 결과와 유사한 결과를 보였다. 이것은 다양한 암세포에서 aloin에 의한 항암효과가 세포자멸사에 의한 것으로 여겨지고 본 실험에서 적용한 대장암세포 HT-29에서도 세포자멸에 의한 항암효과가 있는 것으로 나타났으며, 이는 aloin이 여러 암에서 항암 효과를 나타낼 수 있는 천연 물질로서의 가능성을 제시하였다. 따라서 aloin이 대장암세포 HT-29에서 세포사멸을 유도하는 것으로 사료된다.
- 이와 반대로, Zhang 등23)의 연구에 따르면, A549 cell에 다양한 농도의 aloin(0, 50, 100 μM)으로 처리하였을 때 p-p38의 발현은 감소하였고, p38의 하위 인자인 pCdc25B, p-Hsp 27의 발현도 감소하여 본 논문과 p-p38의결과가 다른데 Wang 등20)이 연구한 위암세포 MKN-28, HGC-27과 Wan 등22)이 연구한 폐암세포 A549 cell에서 pp38이 증가한 것으로 보아, 이는 암세포 종이 달라 다른 결과가 나타난 것으로 생각된다. 종합하였을 때, Aloin은 세포 자멸사 경로 중 p38 MAPK 경로를 통해 세포 자멸사를 유도하는 것으로 사료된다.
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