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문제 정의
- 본 연구에서는 DNA 바코드 정보 분석을 이용하여 육안구별이 어려운 문어 및 오징어 제품의 원재료 종판별 연구를 수행하였다. 이를 위해 국내에 유통 중인 28개 문어 및 오징어 가공제품에서 추출한 DNA 대상으로 16SrRNA 및 COI 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석하였다.
제안 방법
- DNA의 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 전처리된 가식부위를 대상으로 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
- 반응액 조성은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1 µL, 10 ng/µL 농도의 주형 DNA 1 µL를 첨가하였으며, 총 반응액이 부피가 20 µL가 되도록 멸균증류수를 첨가하였다. PCR 후 증폭산물은 Accuprep PCR Purification Kit (Bioneer)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 정제하였다. 정제 후 염기서열의 분석은 ㈜바이오니아에 의뢰하여 수행하였다.
- . Table 2에 요약된 각 프라이머 세트를 이용하여 Table 3에 요약된 증폭 조건에 따라 Thermal Cycler C1000 Touch (Bio-Rad, USA) 장비를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 반응액 조성은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1 µL, 10 ng/µL 농도의 주형 DNA 1 µL를 첨가하였으며, 총 반응액이 부피가 20 µL가 되도록 멸균증류수를 첨가하였다.
- 전체 28개 중 1차 가공제품(조미, 건조 등 단순가공)은 7개, 2차 가공제품(튀김, 젓갈, 양념 첨가 등 조리가공)은 21개였으며, 이들 제품에 관련된 정보 (원재료명, 원산지, 가공유형 등)는 Table 1에 요약하였다. 검체의 가식 부위 25 mg을 DNA 추출에 이용하였으며 가공과정 중 가식 부위에 붙어있는 PCR 저해인자를 제거하기 위하여 70% Ethanol과 증류수를 이용하여 양념 및 부산물을 제거하였다. DNA의 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 전처리된 가식부위를 대상으로 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.
- 반응액 조성은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Korea)를 이용하여 10 μM의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1 µL, 10 ng/µL 농도의 주형 DNA 1 µL를 첨가하였으며, 총 반응액이 부피가 20 µL가 되도록 멸균증류수를 첨가하였다.
- 이를 위해 국내에 유통 중인 28개 문어 및 오징어 가공제품에서 추출한 DNA 대상으로 16SrRNA 및 COI 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 미국국립보건원(NCBI) GenBank 데이터베이스에 등록되어 있는 생물종의 염기서열과 비교함으로써 사용 원재료의 모니터링을 실시하였다.
- 선정된 두 개의 프라이머 세트를 이용하여 얻은 PCR 증폭산물을 ‘DNA 바코드 PCR 및 염기서열 분석’ 항목에서 제시된 방법에 따라 정제 후 염기서열을 분석하였다.
- 수산물의 종판별에 널리 활용되는 4개의 프라이머 세트를 선정한 후 표준시료를 사용하여 각 프라이머 세트별 최적의 증폭조건을 확립하였다(Table 3). 최적의 PCR 증폭조건 확립 후 문어 및 오징어 제품에 사용된 원재료의 종판별을 위한 DNA 바코드 마커의 증폭효율을 비교하였다.
- 질적 점수 기준 ‘20’을 적용하여 증폭된 염기서열의 양 말단을 포함하는 불확실 염기서열들을 편집한 후 미국국립보건원 GenBank 데이터베이스에 등록되어 있는 염기서열들과 비교·분석하였다. 유사도(identity, %)와 매칭 점수 (match score)를 기준으로 PCR 증폭산물의 종을 판별하였다. 제품에 표시된 원재료명(문어, 오징어, 대왕오징어 등)과 염기서열 분석으로 동정된 학명의 일치 여부는 식품의 기준 및 규격(제2018-74호) 중『(별표 1) 사용할 수 있는 원료 목록』에 제시된 학명을 기준으로 판단하였다.
- 본 연구에서는 DNA 바코드 정보 분석을 이용하여 육안구별이 어려운 문어 및 오징어 제품의 원재료 종판별 연구를 수행하였다. 이를 위해 국내에 유통 중인 28개 문어 및 오징어 가공제품에서 추출한 DNA 대상으로 16SrRNA 및 COI 유전자를 증폭하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열을 미국국립보건원(NCBI) GenBank 데이터베이스에 등록되어 있는 생물종의 염기서열과 비교함으로써 사용 원재료의 모니터링을 실시하였다.
- PCR 후 증폭산물은 Accuprep PCR Purification Kit (Bioneer)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 정제하였다. 정제 후 염기서열의 분석은 ㈜바이오니아에 의뢰하여 수행하였다.
- 질적 점수 기준 ‘20’을 적용하여 증폭된 염기서열의 양 말단을 포함하는 불확실 염기서열들을 편집한 후 미국국립보건원 GenBank 데이터베이스에 등록되어 있는 염기서열들과 비교·분석하였다.
- 수산물의 종판별에 널리 활용되는 4개의 프라이머 세트를 선정한 후 표준시료를 사용하여 각 프라이머 세트별 최적의 증폭조건을 확립하였다(Table 3). 최적의 PCR 증폭조건 확립 후 문어 및 오징어 제품에 사용된 원재료의 종판별을 위한 DNA 바코드 마커의 증폭효율을 비교하였다. Fig.
- DNA의 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 전처리된 가식부위를 대상으로 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 추출된 DNA의 농도 및 순도는 NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, USA)을 사용하여 확인하였다.
- 5, USA) 프로그램을 이용하여 질적 점수(quality score)를 확인하였으며 질적 점수 20 이하의 염기서열은 분석에서 제외하였다11). 편집된 바코드 마커의 염기서열 정보는 미국국립보건원에서 제공하는 검색기능(BLAST Search)을 사용하여 분석하였으며, 98% 이상의 유사도 (identity)를 보이는 종을 분석 검체에 사용한 원재료의 종으로 최종 판별하였다12).
대상 데이터
- 두족류의 종판별을 위해 선행 연구를 참고하여 16S rRNA 및 COI 유전자를 목적 유전자로 선정하였으며, 바코드 마커의 증폭에 필요한 프라이머 세트 정보는 Table 2에 제시하였다6,11,12). Table 2에 요약된 각 프라이머 세트를 이용하여 Table 3에 요약된 증폭 조건에 따라 Thermal Cycler C1000 Touch (Bio-Rad, USA) 장비를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
- 문어(Octopus vulgaris) 및 오징어(Todarodes pacificus)종이 확인된 표준시료(certified reference)는 식품의약품안전처로부터 제공받았으며 DNA 바코드 마커 증폭을 위한 PCR 조건 확립 및 DNA 바코드 정보를 이용한 종판별의 양성대조군으로 사용하였다. 본 연구에서는 오징어와 문어를 원재료로 사용한 다양한 유형의 가공제품을 분석대상으로 사용하였다.
- 문어(Octopus vulgaris) 및 오징어(Todarodes pacificus)종이 확인된 표준시료(certified reference)는 식품의약품안전처로부터 제공받았으며 DNA 바코드 마커 증폭을 위한 PCR 조건 확립 및 DNA 바코드 정보를 이용한 종판별의 양성대조군으로 사용하였다. 본 연구에서는 오징어와 문어를 원재료로 사용한 다양한 유형의 가공제품을 분석대상으로 사용하였다. 전체 28개 중 1차 가공제품(조미, 건조 등 단순가공)은 7개, 2차 가공제품(튀김, 젓갈, 양념 첨가 등 조리가공)은 21개였으며, 이들 제품에 관련된 정보 (원재료명, 원산지, 가공유형 등)는 Table 1에 요약하였다.
데이터처리
- 분석된 바코드 마커의 염기서열(약 700 bp)은 BioEdit (version 7.0.5, USA) 프로그램을 이용하여 질적 점수(quality score)를 확인하였으며 질적 점수 20 이하의 염기서열은 분석에서 제외하였다11). 편집된 바코드 마커의 염기서열 정보는 미국국립보건원에서 제공하는 검색기능(BLAST Search)을 사용하여 분석하였으며, 98% 이상의 유사도 (identity)를 보이는 종을 분석 검체에 사용한 원재료의 종으로 최종 판별하였다12).
성능/효과
- 따라서 본 연구에서 선정한 ‘16Sar-L/16Sbr-H’ 및 ‘LCO1490/HCO2198’ 프라이머 세트의 조합은 오징어 및 문어 제품에 사용된 원재료의 종판별에 있어 적합한 것으로 확인되었다.
- taiwanicus, 약 10,000원/kg)를 낙지, 주꾸미, 문어 등으로 판매하는 사례, 대왕오징어를 가공하여 ‘가문어’라는 이름으로 판매하는 사례 등 경제적 이득을 목적으로 저가의 수입 원재료를 고가의 두족류 원재료로 표시하는 사례가 보고되고 있다4,14,15). 본 연구의 모니터링 결과 대만주머니낙지 및 하이야주꾸미는 육안으로 원재료의 진위 여부를 판별하기 어려운 다코야키, 문어초밥 등의 가공식품에서 동정되었다. 따라서 이러한 제품들은 문어(약 25,000원/kg)와의 가격차이 및 육안구별의 어려움 등을 이용하여 원재료명을 의도적으로 속인 것으로 판단된다.
- 표준시료로 사용한 문어 및 오징어는 Octopus vulgaris 및 Todarodes pacificus 종과 각각 100% 유사도를 나타내었다. 오징어를 원재료로 사용했다고 표시한 12개 제품의 경우 DNA 바코드 마커 분석결과 아메리카대왕오징어(D. gigas, n=3) 및 살오징어(T. pacificus, n=9) 종으로 동정되었다. 원재료를 문어(O.
- pacificus, n=9) 종으로 동정되었다. 원재료를 문어(O. vulgaris, E.dofleini)로 표기한 16개 제품의 경우 10개 제품에서는 문어(O. vulgaris, E. dofleini) 종으로 동정된 반면, 6개 제품의 원재료는 대만주머니낙지(C. taiwanicus, n=1), 하이야주꾸미(A. marginatus, n=1), S. unicirrhus (n=1), 아메리카대왕오징어(D. gigas, n=3)로 동정되어 37.5%의 불일치율을 보였다. 또한 이 중 3건은 알레르기를 유발할 수 있는 오징어를 원재료로 사용한 것으로 분석되었다.
- 생물의 종판별을 위해서는 DNA 바코드 분석 방법이 널리 활용되고 있다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 16S ribosomal RNA (16S rRNA), cytochrome c oxidase subunit Ⅰ(COI), cytochrome b (cytb) 등의 표준화된 유전자의 염기서열(600-700 bp)을 분석하고, 염기서열 정보를 비교하여 생물종을 확인할 수 있다. 분석에 이용되는 미토콘드리아 DNA는 염기 복제 수 및 염기 치환이 매우 높고, 염기서열 구성에 관한 방대한 정보가 밝혀져 있어 동물성 종판별에 활용되고 있다6).
- DNA 바코드 마커 정보를 이용한 원재료의 종판별 결과는 Table 4에 정리하였다. 표준시료로 사용한 문어 및 오징어는 Octopus vulgaris 및 Todarodes pacificus 종과 각각 100% 유사도를 나타내었다. 오징어를 원재료로 사용했다고 표시한 12개 제품의 경우 DNA 바코드 마커 분석결과 아메리카대왕오징어(D.
후속연구
- 또한 의도적으로 오징어를 사용한 문어 제품의 경우 소비자에게 금전적 손해뿐만 아니라 알레르기를 유발하여 건강상의 문제를 초래할 수 있다. 따라서 소비자의 알 권리 강화 및 건전한 유통 문화 정착을 위해 알레르기 유발 원재료 표시에 대한 주기적인 모니터링 연구가 필요하며, 본 연구결과는 향후 모니터링 연구 및 관련 정책 지원을 위한 기초자료로 그 활용도가 높을 것으로 판단된다.
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