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문제 정의
- 이에 본 연구는 침샘관암에서 HER2 발현과 PD-L1의 발현이 생존율에 미치는 영향을 분석하고 침샘관암 환자를 선별하기 위한 면역표지자로서 PD-L1의 효용성에 대해서 확인하고자 한다.
제안 방법
- <American Society of Clinical Oncology(ASCO)/College of American Pathologists (CAP) guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) testing>방법에 따라서 HER2 유전자 증폭을 확인하고 c-erbB2/ HER2 단백 발현을 0, +1, +2, +3 으로 구분하였다.
- 4-μm TMA 절편을 만들어 면역조직화학적 검사를 시행하였다(Ventana Bench Mark XT Autostainer; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA).
- 8) 또한 이를 위해 추가적으로 CD3 염색을 추가적으로 실시하였다. PD-L1 발현율이 5% 이상인 경우 양성으로 판정하였다.
- 종양세포군집에 침윤하는 종양침윤림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)의 양은 400x magnification highpower fields 하에서 대표적인 조직 부분 다섯곳을 확인하여 평가하였다. CD3와 CD8을 발현하는 림프구를 일일이 세어서 그 갯수를 평균하였다. 종양침윤림프구 비중의 중앙값을 기준으로 환자군을 low TIL abundance와 high TIL abundance 그룹으로 분류하였다(CD3 13/HPF, CD8 5/HPF).
- 임상병리적 특징에 대해서 Table 1에 제시하였다. Seventh American Joint Committee on Cancer TNM cancer classification system and the World Health Organization에 근거하여 종양 병기를 구분하였다. 추적관찰기간의 중앙값은 32개월이었고(range, 9 ~ 135 개월) 33명 환자 모두 anti HER2 치료나 androgen deprivation 치료를 시행받은 바 없었다.
- 2000년부터 2016년까지 총 36명의 환자가 침샘관암으로 진단되었고 조직표본이 이용 가능한 33명의 환자를 대상으로 연구를 진행하였다. 모든 케이스에서 외과적 절제술이 시행되었고 Archived formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) 표본을 확보하였다. 모든 사례의 외과적 절제술은 세브란스 병원에서 시행되었다.
- TMA(tissue microarray) 구성을 위해 종양 조직에서 1-3개의 대표적인 표본을 채취하였다. 조직채취를 위한 기구(trephine apparatus)를 이용하여 3mm 직경의 중심조직을 채취하여 TMA 블럭에 배치하였다. 4-μm TMA 절편을 만들어 면역조직화학적 검사를 시행하였다(Ventana Bench Mark XT Autostainer; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA).
- 종양세포군집에 침윤하는 종양침윤림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)의 양은 400x magnification highpower fields 하에서 대표적인 조직 부분 다섯곳을 확인하여 평가하였다. CD3와 CD8을 발현하는 림프구를 일일이 세어서 그 갯수를 평균하였다.
- CD3와 CD8을 발현하는 림프구를 일일이 세어서 그 갯수를 평균하였다. 종양침윤림프구 비중의 중앙값을 기준으로 환자군을 low TIL abundance와 high TIL abundance 그룹으로 분류하였다(CD3 13/HPF, CD8 5/HPF).
- 변수간 차이를 분석하기 위해 χ2, Fisher exact, linear-by-linear method를 사용하였다. 처음 진단된 날로부터 사망일 혹은 마지막 추적관찰일까지의 기간을 전체생존 기간(overall survival)으로 측정하였다. 생존률분석을 위해 Kaplan-Meier method를 사용하였고 log-rank test 방법을 적용하였다.
대상 데이터
- 2000년부터 2016년까지 총 36명의 환자가 침샘관암으로 진단되었고 조직표본이 이용 가능한 33명의 환자를 대상으로 연구를 진행하였다. 모든 케이스에서 외과적 절제술이 시행되었고 Archived formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) 표본을 확보하였다.
- TMA(tissue microarray) 구성을 위해 종양 조직에서 1-3개의 대표적인 표본을 채취하였다. 조직채취를 위한 기구(trephine apparatus)를 이용하여 3mm 직경의 중심조직을 채취하여 TMA 블럭에 배치하였다.
- 모든 케이스에서 외과적 절제술이 시행되었고 Archived formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) 표본을 확보하였다. 모든 사례의 외과적 절제술은 세브란스 병원에서 시행되었다. 임상병리적 특징에 대해서 Table 1에 제시하였다.
- 이전 연구의 방법을 이용하여 PD-L1 발현을 종양세포와 면역세포로 분리하여 확인하였으나 이전 연구와 마찬가지로 PD-L1 양성 종양세포는 매우 국한되어 있고 적으며 면역세포가 침윤된 기질에서 관찰되는 양상이었기 때문에 본 연구에서는 면역세포의 PD-L1 양성률만을 연구 대상으로 삼았다.8) 또한 이를 위해 추가적으로 CD3 염색을 추가적으로 실시하였다.
- 일차 항체로 HER-2/neu (RTU; clone 4B5; Ventana), PD-L1 (dilution 1:100; clone SP142; Ventana), CD3(dilution 1:200; LabVision, Fremont, CA, USA), CD8 (RTU; clone C8/144B; Dako, Glostrup, Denmark)을 사용하였다.
이론/모형
- 변수간 차이를 분석하기 위해 χ2, Fisher exact, linear-by-linear method를 사용하였다.
- 각각의 연구마다 PD-L1의 발현율과 생존율과의 연관성 분석에 차이가 있었는데 이에 대해서 PD-L1 양성 여부를 판정하는 기준과 종양세포, 면역세포를 분류해서 PD-L1 양성 여부를 판정하는 기준이 연구마다 차이가 있고 일관된 기준이 부재되어 있다는 점을 인지하고 있어야 한다. 본 연구에서는 Kim 등의 연구와 같이 5% 이상의 PD-L1 발현을 양성인 군으로 채택하였다.9) 침샘관 암 환자를 대상으로 한 Sato 등의 연구에서는 종양세포에서는 10% 이상을 high, 1%-9%를 low, 0%를 null의 세 그룹으로 나누는 기준을 사용하였고 면역세포에서는 10%이상을 IC3, 10% 미만 5% 이상을 IC2, 1%이상 5%미만을 IC1, 1%미만을 IC0으로 하여 4개의 군으로 분류하였다.
- 처음 진단된 날로부터 사망일 혹은 마지막 추적관찰일까지의 기간을 전체생존 기간(overall survival)으로 측정하였다. 생존률분석을 위해 Kaplan-Meier method를 사용하였고 log-rank test 방법을 적용하였다. Two-sided P values가 0.
성능/효과
- 33개의 사례 중 4개의 사례에서 PD-L1 발현이 관찰되었다. PD-L1 발현과 각각의 임상병리적 변수간에 유의한 연관성은 관찰되지 않았다(Table 2).
- 흡연과 음주에서 특이사항은 관찰되지 않았다. 33개의 사례 중 이하선 기원이 31 사례로 가장 높았다. 진단 당시 절반 이상의 환자에서 진행된 암 병기의 소견을 보였다(T stage 3-4:51%; N stage 1-2:51%; AJCC cancer stage III-IV: 81%)(Table 1).
- 6%) 관찰되었다. HER2 양성률(c-erbB2 3+ and/or HER2 gene amplification)은 전체의 63.6%(21/33)에서 관찰되었다. 그러나 HER2 양성여부와 환자의 생존률과의 유의한 연관성은 관찰되지 않았다(p=0.
- PD-L1 발현여부와 CD3+ 종양침윤림프구, CD8+종양침윤림프구의 비중 사이에 통계적으로 유의한 연관성은 발견되지 않았다(Table 2). HER2 양성여부와 CD3+종양침윤림프구의 비중(p= 0.157), CD8+ 종양침윤림프구의 비중(p=0.741) 간에도 통계적으로 유의한 연관성은 발견되지 않았다. 또한 CD3+종양침윤림프구의 비중과 생존률(p=0.
- PD-L1 발현여부와 CD3+ 종양침윤림프구, CD8+종양침윤림프구의 비중 사이에 통계적으로 유의한 연관성은 발견되지 않았다(Table 2). HER2 양성여부와 CD3+종양침윤림프구의 비중(p= 0.
- PD-L1 양성인 환자군에서 5년 생존율은 75%로 음성인군과 비교하여 현저히 높은 결과를 보였으며 전체 5년 생존율 30.3%와 비교하여도 현저히 높은 생존율을 보였다.
- PD-L1 양성인 환자에서의 평균 생존기간은 66.5개월이었으며 음성인 환자군에서는 70개월이었으나 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p=0.265). PD-L1 양성인 환자군에서 5년 생존율은 75%로 음성인군과 비교하여 현저히 높은 결과를 보였으며 전체 5년 생존율 30.
- c-erbB2/HER2 단백 발현이 2+이상인 경우는 33개 사례 중 24개의 사례에서(72.7%) 관찰되었고 HER2 유전자 증폭은 33 사례 중 21개의 사례에서(63.6%) 관찰되었다. HER2 양성률(c-erbB2 3+ and/or HER2 gene amplification)은 전체의 63.
- 최근 차세대 면역표지자로 주목받고 있는 PD-L1이 침 샘관암 환자의 생존률에 미치는 영향을 분석한 결과, 본 연구에서 통계적으로 유의한 결과는 발견되지 않았다. 그 러나 면역세포의 PD-L1 발현이 높은군에서 5년 생존률은 75%로, 발현이 낮은 군의 24%에 비해 양호한 경향을 보였다. 이는 두경부암 환자 402명을 대상으로 동일 기관에서 시행한 연구에서 종양침윤림프구의 PD-L1 발현이 높은 환자그룹이 높은 생존률을 보였다는 결과와 부합하는 소견이다.
- 본 연구에서 PD-L1 양성판정 기준을 1%로 낮춰 양성률을 높이면 통계적으로 유의한 결과가 도출될 수도 있으나 언급한 바와 같이 항체 제조사가 연구마다 다르고 판정의 기준도 다르기 때문에 PD-L1이 침샘관암의 경과에 미치는 일관된 영향을 비교하기에는 어려움이 있다. 그렇기 때문에 동일한 항체와 방법을 사용한 동일 기관의 결과와 비교하기 위해 본 연구는 5%의 기준을 양성 판정 기준으로 사용하였고 이를 통해 두경부암 전체 대상군에 비해서 침샘관암 환자에서 PD-L1의 양성률이 낮게 보고된다는 점을 확인할 수 있었다. 본 연구와 동일기관에서 두경부암 환자 전체를 대상으로 시행한 연구에서 면역세포의 PD-L1 양성률은 27%였으나 같은 방법을 사용한 본 연구에서의 양성률은 12%에 불과했다.
- 741) 간에도 통계적으로 유의한 연관성은 발견되지 않았다. 또한 CD3+종양침윤림프구의 비중과 생존률(p=0.568), CD8+ 종양침윤림프구의 비중과 생존률(p= 0.568)과의 유의한 연관성은 관찰되지 않았다.
- 그렇기 때문에 동일한 항체와 방법을 사용한 동일 기관의 결과와 비교하기 위해 본 연구는 5%의 기준을 양성 판정 기준으로 사용하였고 이를 통해 두경부암 전체 대상군에 비해서 침샘관암 환자에서 PD-L1의 양성률이 낮게 보고된다는 점을 확인할 수 있었다. 본 연구와 동일기관에서 두경부암 환자 전체를 대상으로 시행한 연구에서 면역세포의 PD-L1 양성률은 27%였으나 같은 방법을 사용한 본 연구에서의 양성률은 12%에 불과했다.9) 마찬가지로 동일한 방법을 사용한 연구 간에 비교를 통해서 침샘관암에서 PD-L1의 양성률을 다른 질환의 양성률과 비교해 볼 수 있다.
- 진단 당시 절반 이상의 환자에서 진행된 암 병기의 소견을 보였다(T stage 3-4:51%; N stage 1-2:51%; AJCC cancer stage III-IV: 81%)(Table 1). 전체 평균 생존 기간은 75.6개월, 전체 생존 중앙값은 62개월이었고 전체 5년 생존율은 30.3%였다.
- 최근 차세대 면역표지자로 주목받고 있는 PD-L1이 침 샘관암 환자의 생존률에 미치는 영향을 분석한 결과, 본 연구에서 통계적으로 유의한 결과는 발견되지 않았다. 그 러나 면역세포의 PD-L1 발현이 높은군에서 5년 생존률은 75%로, 발현이 낮은 군의 24%에 비해 양호한 경향을 보였다.
- Seventh American Joint Committee on Cancer TNM cancer classification system and the World Health Organization에 근거하여 종양 병기를 구분하였다. 추적관찰기간의 중앙값은 32개월이었고(range, 9 ~ 135 개월) 33명 환자 모두 anti HER2 치료나 androgen deprivation 치료를 시행받은 바 없었다. 이 연구는 Institutional Review Board of Severance Hospital(4-2016-1049)의 승인 하에 진행되었다.
후속연구
- 실제로 여러 연구에서 종양 세포와 면역세포에서의 PD-L1이 다른 경로를 통해서 발현이 된다고 보고하고 있으며, Kim의 연구에서는 종양세포와 면역세포에서 동시에 PD-L1이 발현되는 경우가 1%미만이라는 결과를 보고하기도 하였다.10) 이러한 점으로 미루어 볼 때 종양세포와 면역세포에서 PD-L1 발현을 세심하게 분류하여 생존률과의 연관성을 확인한다면 추후 일관된 결과가 도출될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 알려진 바와 같이 침샘관암은 매우 드문 질환이기 때문에 본 연구에서도 충분한 대상자를 확보하기 어려웠고 또한 PD-L1의 발현율이 낮아 통계적으로 유의한 결과를 도출해 내기에는 어려움이 있었다. 그러나 본 연구에서 PD-L1 양성 종양침윤림프구의 비중이 높은 환자군에서 5년 생존률이 현저히 높게 관찰된 점으로 미루어 침샘관암 환자에서 PD-1/PD-L1 경로를 이용한 치료방법에 대한 연구는 충분한 가치가 있을 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 PD-1/PD-L1이 임상적인 예후에 미치는 일관된 결과나 해석이 부재한 상태이며 침샘관암에서 PD-L1의 발현율이 낮게 관찰된다는 점을 고려할 때 현 단계에서 PD-1/PD-L1을 침샘관암 항암면역치료의 표지자로 이용하기에는 어려움이 있어 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 그러나 본 연구에서 PD-L1 양성 종양침윤림프구의 비중이 높은 환자군에서 5년 생존률이 현저히 높게 관찰된 점으로 미루어 침샘관암 환자에서 PD-1/PD-L1 경로를 이용한 치료방법에 대한 연구는 충분한 가치가 있을 것으로 생각된다. 그러나 아직까지 PD-1/PD-L1이 임상적인 예후에 미치는 일관된 결과나 해석이 부재한 상태이며 침샘관암에서 PD-L1의 발현율이 낮게 관찰된다는 점을 고려할 때 현 단계에서 PD-1/PD-L1을 침샘관암 항암면역치료의 표지자로 이용하기에는 어려움이 있어 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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