[논문]렌즈콩(Lens culinaris) 추출물이 HepG2 인간 간암 세포에서 Proteasome 활성과 Nuclear Factor κB 활성화에 미치는 영향

민수영; 윤현근

doi:10.9799/ksfan.2019.32.5.565

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Proteasome inhibitors can improve the efficiency of cancer treatments by inhibiting nuclear factor ${\kappa}B$($NF-{\kappa}B$) activation in cancer cells. Lentils are a type of beans of which consumption of such beans is increasing. The purpose of this study was to investigate ...

Proteasome inhibitors can improve the efficiency of cancer treatments by inhibiting nuclear factor ${\kappa}B$($NF-{\kappa}B$) activation in cancer cells. Lentils are a type of beans of which consumption of such beans is increasing. The purpose of this study was to investigate the effects of lentils extract (LE) on the proteasomal activities, $NF-{\kappa}B$ activation, and cell cycle in HepG2 human liver cancer cells. LE treatments inhibited proteasomal activities at concentrations of 10, 50, and $100{\mu}g/mL$ respectively, and repressed $NF-{\kappa}B$ activation at concentrations of 1, 10, and $100{\mu}g/mL$ respectively, in HepG2 cells. LE treatments at concentrations of 1, 10, and $100{\mu}g/mL$ respectively, increased sub-G1 cell population in HepG2 cells, which may be the result of apoptosis. The results suggest that LE inhibited $NF-{\kappa}B$ activation partially with its proteasome inhibitory activities, and the increase of sub-G1 cell population was induced partially, by inhibition of $NF-{\kappa}B$ activation in HepG2 cells.

주제어

표/그림 (3)

그림 Fig. 1. Cytotoxicity(A) and proteasome inhibitory activity(PIA)(B) of lentils extract(LE). Cytotoxicity of LE and proteasome activities of HepG2 cell extracts with LE were measured. Bars with different letters indicate significant differences (p<0.05).
그림 Fig. 2. Effects of lentils extract(LE) on TNF-α-induced NF-κB activation in HepG2 cells. HepG2 cells were treated with LE for 24 h and NF-κB activation was induced by the treatment of TNF-α at a concentration of 10 ng/mL for 1 h. Nucleolins were used as loading controls. Bars with different letters indicate significant differences (p<0.05).
그림 Fig. 3. Flow cytometric analysis of HepG2 cells treated with lentils extract(LE). HepG2 cells were treated with LE for 48 h. (A) Flow cytometry. (B) Cell populations analysis. An asterisk(*) indicates a significant difference compared with the same cell phase population of the negative control (p<0.05).

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문제 정의

Preteasome 억제제는 암세포에서 NF-κB 활성화를 저해하여 항암 치료의 효율을 향상시킨다. 본 연구의 목적은 HepG2 인간 간암 세포에서 LE가 proteasome 활성, NF-κB 활성화, cell cycle에 미치는 영향을 밝히는 것이다. LE는 10, 50, 100 μg/mL 농도에서 proteasome 활성을 억제하였고, 1, 10, 100 μ g/mL 농도에서 NF-κB 활성화를 저해하였다.
렌즈콩이 항산화, 항암성 등의 기능성 등을 보유하고 있다는 연구결과는 보고된 바 있으나, proteasome 활성에 미치는 영향은 보고되지 않았다. 본 연구의 목적은 렌즈콩 추출물이 HepG2 세포의 proteasome 활성, NF-κB 활성화, cell cycle에 미치는 영향을 연구하여 proteasome 활성 억제 물질 보유 가능성을 확인하는 것이다.

제안 방법

HepG2 세포 추출물에 LE를 첨가하고 proteasome 활성을 측정하여 LE가 proteasome 활성에 미치는 영향을 정량하였다. LE는 10, 50, 100 μg/mL 농도에서 HepG2 세포의 proteasome 활성을 유의하게 억제하였다(p<0.
HepG2 세포를 LE로 24 h 동안 처리하고, TNF-α를 이용해서 NF-κB 활성화를 유도하여 LE가 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 측정하였다. LE는 1, 10, 100 μg/mL 농도에서 TNF-α 에 의하여 유도되는 NF-κB 활성화를 유의하게 억제하였다 (p<0.

대상 데이터

HepG2 세포(human hapatocarcinoma cell line)는 한국 세포주 은행(Seoul, Korea)에서 분양 받았다. HepG2 세포는 MEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics(penicillin-streptomycin)를 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기(371, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.
렌즈콩은 2016년 수유시장(Seoul, Korea)에서 구매하여 추출물을 제조하기 전까지 －80℃에서 보관하였다. 렌즈콩 추출물(lentils extract(LE)) 제조는 선행연구 방법을 참고하여 실행하였다(Yoon & Liu 2007).

데이터처리

실험결과는 SPSS(ver. 22, IBM, Armonk, NY, USA) 프로그램으로 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 통계적 유의성을 확인하였고, p<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후 분석을 수행하였다. 두 평균의 paired test는 p<0.
05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후 분석을 수행하였다. 두 평균의 paired test는 p<0.05 수준에서 Student’s t-test를 이용하여 실시하였다

이론/모형

LE가 HepG2 세포의 cell cycle에 미치는 영향 분석은 cell cycle analysis protocol을 참고하여 실행하였다(Darzynkiewicz & Juan 2001). HepG2 세포를 1×10⁶ cell/well 농도로 6-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24 h 동안 배양하였다.
LE가 NF-κB 활성화에 미치는 영향 측정은 선행연구 방법을 참고하여 실행하였다(Yoon & Liu 2007). HepG2 세포를 1×10⁶ cell/well 농도로 6-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24 h 동안 배양하였다.
LE의 proteasome 억제 활성(proteasome inhibitory activity (PIA))은 선행한 연구 방법을 참고하여 수행하였다(Yoon & Liu 2007). HepG2 세포를 8×10⁴ cell/well 농도로 6-well plate에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24 h 동안 배양하였다.
렌즈콩은 2016년 수유시장(Seoul, Korea)에서 구매하여 추출물을 제조하기 전까지 －80℃에서 보관하였다. 렌즈콩 추출물(lentils extract(LE)) 제조는 선행연구 방법을 참고하여 실행하였다(Yoon & Liu 2007). 렌즈콩 25 g을 증류수 200 mL 에 넣고 4℃에서 24 h 동안 보관한 뒤 회수하여 80%(v/v) acetone 200 mL에 넣고 5 min 동안 마쇄한 후 homogenizer (Tops, Daeil lab service, Seoul, Korea)로 3 min 동안 균질화 시켰다.
시료의 세포 독성은 선행연구 방법을 참고하여 실행하였다(Yoon & Lee 2010). HepG2 세포를 96-well plate에 5.

성능/효과

암세포에 생장을 억제하는 자극이 주어지면 암세포에서는 이에 대한 저항으로서 NF-κB가 활성화되어 암세포가 계속 생장하기에 유리한 환경이 조성된다(Manasanch & Orlowski 2017). 따라서, 암세포에서 proteasome의 활성이 억제되어 NF-κB의 활성화가 제한되면 항암 치료에 대한 암세포 저항성이 감소하여 항암 치료 효율이 개선될 수 있다. 암세포의 항암 치료에 대한 저항성을 억제할 수 있는 proteasome 활성 억제제에 대한 연구가 진행되어 왔고 proteasome 활성 억제제인 bortezomib과 ixazomib은 미국 FDA에 의하여 암치료제로 승인되었다(Manasanch & Orlowski 2017).
LE는 1, 10, 100 μg/mL 농도에서 HepG2 세포의 sub-G1 cell population 증가를 유도하였다. 본 연구의 결과는 LE가 proteasome 억제 활성을 통하여 부분적으로 NF-κB 활성화를 저해하였고, sub-G1 cell population 증가는 부분적으로 NF-κB 활성화 저해에 의하여 유도되었음을 제시하고 있다.
항암 치료 과정에서 암세포는 NF-κB 활성화에 의하여 항암 치료에 대한 저항성을 나타내므로 NF-κB의 활성화를 억제하는 proteasome 저해제는 항암 치료의 효율을 높이는 역할을 한다. 본 연구의 결과는 LE가 proteasome 활성을 억제하여 HepG2 세포에서 NF-κB 활성화를 저해하고, 이에 따라 sub-G1기의 cell population을 증가시켰을 가능성을 제시한다. LE의 성분 중에서 proteasome 억제 활성을 보유한 생리활성물질을 분리하여 동정하고, proteasome 억제 생리 활성물질의 활성 증대 방법을 제시하는 추가 연구가 필요하다.

후속연구

LE의 생리활성 성분을 동정하고 proteasome 활성 억제제로 개발하는 추가 연구가 필요하다.
본 연구의 결과는 LE가 proteasome 활성을 억제하여 HepG2 세포에서 NF-κB 활성화를 저해하고, 이에 따라 sub-G1기의 cell population을 증가시켰을 가능성을 제시한다. LE의 성분 중에서 proteasome 억제 활성을 보유한 생리활성물질을 분리하여 동정하고, proteasome 억제 생리 활성물질의 활성 증대 방법을 제시하는 추가 연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	NF-κB의 특징은 무엇인가?	NF-κB는 동물세포에 존재하는 전사인자로서 세포증식, 면역 반응, 염증 반응 등을 조절하는 역할을 한다(Cusack 등 2001; Hideshima 등 2002). NF-κB는 세포에서 저해 단백질인 IκB-α와 결합하여 불활성화 상태로 세포질에 존재하다가 염증성 cytokine, 세포 성장 인자, 산화스트레스 등의 자극이 주어지면 IκB-α가 인산화된 후 ubiquitin-proteasome system (UPS)에 의하여 분해되어서 IκB-α로부터 NF-κB가 분리된다. 분리된 NF-κB는 세포핵 내부로 이동하여 목표 유전자의 발현을 촉진한다(Ludwig 등 2005; Flankland-Searby & Bhaumik 2012). NF-κB가 활성화되어 목표 유전자가 발현하면 그 결과로 세포에서는 apoptosis가 억제되고, 세포 증식이 촉진된다.
	렌즈콩(Lens culinaris)의 함량이 높은 것은 무엇인가?	두류는 다양한 영양소와 식물생리활성물질을 포함하고 있고, 여러 가지 식품 형태로 소비되고 있다(Song 등 2010; Lee 등 2013; Lee 2015; Im 등 2016). 렌즈콩(Lens culinaris)은 두류의 한 종류로서 소비량이 증가하고 있는 추세에 있으며, 단백질, 탄수화물, 식이섬유, 비타민, 미네랄 등의 함량이 높고, 다른 두류와 비교하여 지방 함량이 낮은 특징이 있다(Jameel 등 2015). 렌즈콩에는 phytosterols, squalene, tocopherols, saponins, flavonoids, tannins, phytic acid, oligosaccharides 등의 식물생리활성물질이 포함되어 있으며, 렌즈콩은 항당뇨, 항산화, 항비만, 항균, 항암 효과 등을 나타낸다고 알려져 있다(Jameel 등 2015; Ganesan & Xu 2017).
	렌즈콩 속 다양한 영양소와 식물생리활성물질의 효과는 무엇인가?	렌즈콩(Lens culinaris)은 두류의 한 종류로서 소비량이 증가하고 있는 추세에 있으며, 단백질, 탄수화물, 식이섬유, 비타민, 미네랄 등의 함량이 높고, 다른 두류와 비교하여 지방 함량이 낮은 특징이 있다(Jameel 등 2015). 렌즈콩에는 phytosterols, squalene, tocopherols, saponins, flavonoids, tannins, phytic acid, oligosaccharides 등의 식물생리활성물질이 포함되어 있으며, 렌즈콩은 항당뇨, 항산화, 항비만, 항균, 항암 효과 등을 나타낸다고 알려져 있다(Jameel 등 2015; Ganesan & Xu 2017). 렌즈콩이 항산화, 항암성 등의 기능성 등을 보유하고 있다는 연구결과는 보고된 바 있으나, proteasome 활성에 미치는 영향은 보고되지 않았다.

참고문헌 (17)

Cusack JC, Liu R, Houston M, Abendroth K, Elliott PJ, Adams J, Baldwin AS. 2001. Enhanced chemosensitivity to CPT-11 with proteasome inhibitor PS-341: Implications for systemic nuclear factor- ${\kappa}B$ inhibition. Cancer Res 61:3535-3540

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Darzynkiewicz Z, Juan G. 2001. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom Chapter 1:7.5.1-7.5.24
De Bettignies G, Coux O. 2010. Proteasome inhibitors: Dozens of molecules and still counting. Biochimie 92:1530-1545

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Flankland-Searby S, Bhaumik SR. 2012. The 26S proteasome complex: An attractive target for cancer therapy. Biochim Biophys Acta 1825:64-76
Ganesan K, Xu B. 2017. Polyphenol-rich lentils and their health promoting effects. Int J Mol Sci 18:1-23
Hideshima T, Chauhan D, Richardson P, Mitsiades C, Mitsiades N, Hayashi T, Munshi N, Dang L, Castro A, Palombella V, Adams J, Anderson KC. 2002. NF- ${\kappa}B$ as a therapeutic target in multiple myeloma. J Biol Chem 277:16639-16647

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Im JY, Kim SC, Kim S, Choi Y, Yang MR, Cho IH, Kim HR. 2016. Protein and amino-acid contents in Backtae, Seoritae, Huktae, and Seomoktae soybeans with different cooking methods. Korea J Food Cookery Sci 32:567-574

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Jameel M, Ali A, Ali M. 2015. Isolation of antioxidant phytoconstituents from the seeds of Lens culinaris Medik. Food Chem 175:358-365

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Lee KH. 2015. Antioxidant component and sensory evaluation of mixed cereals. Korean J Food Nutr 28:196-201

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Lee S, Lee YB, Kim HS. 2013. Analysis of the general and functional components of various soybeans. J Korean Soc Food Sci Nutr 42:1255-1262

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Liu M, Li XQ, Weber C, Lee CY, Brown J, Liu RH. 2002. Antioxidant and antiproliferative activities of raspberries. J Agric Food Chem 50:2926-2930

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Ludwig H, Khayat D, Gaccone G, Facon T. 2005. Proteasome inhibition and its clinical prospects in the treatment of hematologic and solid malignancies. Cancer 104:1794-1807

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Manasanch EE, Orlowski RZ. 2017. Proteasome inhibitors in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol 14:417-433

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Richardson PG, Kumar S, Laubach JP, Paba-Prada C, Gupta N, Berg D, van de Velde H, Moreau P. 2017. New developments in the management of relapsed/refractory multiple myeloma - the role of ixazomib. J Blood Med 8:107-121

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Song JE, Song JH, Cho SM, Min GH, Lee JS. 2010. Nutritional characteristics and physiological functionality of antidementia acetylcholinesterase inhibitor-containing methanol extract from Sorghum bicolor. Korean J Food Nutr 23:226-232

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Yoon H, Lee CY. 2010. Effect of selected phytochemicals on cell proliferation in A549 lung cancer cells. Food Sci Biotechnol 19:1063-1068

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Yoon H, Liu RH. 2007. Effect of selected phytochemicals and apple extracts on NF-kappaB activation in human breast cancer MCF-7 cells. J Agric Food Chem 55:3167-3173

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