Objectives The object of this study was to assess the effect of Gyejibokryunghwan (GBH) on anti-oxidant and anti-inflammatory activities in RAW 264.7 cells and on factors associated with fracture union in tibia-fractured rats. Methods The 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging acti...
Objectives The object of this study was to assess the effect of Gyejibokryunghwan (GBH) on anti-oxidant and anti-inflammatory activities in RAW 264.7 cells and on factors associated with fracture union in tibia-fractured rats. Methods The 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity was measured to assess anti-oxidant activity. The production of nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), interleukin-$1{\beta}$ ($IL-1{\beta}$) and tumor necrosis factor-${\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$) in the RAW 264.7 cells were measured to assess anti-inflammatory activity. The production of osteocalcin, calcitonin, carboxy-terminal telepeptides of type II collagen (CTXII), transforming growth factor-${\beta}$ ($TGF-{\beta}$), bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in serum of tibia-fractured rats were measured to assess the effects of fracture union. X-rays were taken every two weeks from 0 to 4th week to assess fracture union effect. Results DPPH radical scavenging activity of GBH was increased according to concentration of GBH in RAW 264.7 cell. NO, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$), IL-6, $IL-1{\beta}$ and $TNF-{\alpha}$ were significantly decreased, indicating anti-inflammatory effect. Osteocalcin, calcitonin, $TGF-{\beta}$ were significantly increased in the experimental groups. CTXII was significantly decreased in the experimental groups. BMP-2 was not significantly changed in the experimental groups. The X-ray showed that the experimental group has better healing effects on tibia-fractured rats than control group. Conclusions From above result, GBH has an effect on anti-oxidant, anti-inflammatory activities in RAW 264.7 cells. GBH showed significant results in factors related with fracture union and radiologic examination. In conclusion, GBH can help fracture union and it well be expected to be used actively in clinics.
Objectives The object of this study was to assess the effect of Gyejibokryunghwan (GBH) on anti-oxidant and anti-inflammatory activities in RAW 264.7 cells and on factors associated with fracture union in tibia-fractured rats. Methods The 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging activity was measured to assess anti-oxidant activity. The production of nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6), interleukin-$1{\beta}$ ($IL-1{\beta}$) and tumor necrosis factor-${\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$) in the RAW 264.7 cells were measured to assess anti-inflammatory activity. The production of osteocalcin, calcitonin, carboxy-terminal telepeptides of type II collagen (CTXII), transforming growth factor-${\beta}$ ($TGF-{\beta}$), bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) in serum of tibia-fractured rats were measured to assess the effects of fracture union. X-rays were taken every two weeks from 0 to 4th week to assess fracture union effect. Results DPPH radical scavenging activity of GBH was increased according to concentration of GBH in RAW 264.7 cell. NO, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$), IL-6, $IL-1{\beta}$ and $TNF-{\alpha}$ were significantly decreased, indicating anti-inflammatory effect. Osteocalcin, calcitonin, $TGF-{\beta}$ were significantly increased in the experimental groups. CTXII was significantly decreased in the experimental groups. BMP-2 was not significantly changed in the experimental groups. The X-ray showed that the experimental group has better healing effects on tibia-fractured rats than control group. Conclusions From above result, GBH has an effect on anti-oxidant, anti-inflammatory activities in RAW 264.7 cells. GBH showed significant results in factors related with fracture union and radiologic examination. In conclusion, GBH can help fracture union and it well be expected to be used actively in clinics.
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문제 정의
7 cell에서 계지복령환의 항산화 및 항염 효과를 살펴보았다. 또한 경골 골절을 유발시킨 Sprague Dawley rat (SD rat)에 계지복령환을 투여한 후 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사를 시행하여 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 계지복령환이 瘀血에 의한 골절 초기 치료에 미치는 영향을 확인하고자 RAW 264.7 cell에서 계지복령환의 항산화 및 항염 효과를 살펴보았다. 또한 경골 골절을 유발시킨 Sprague Dawley rat (SD rat)에 계지복령환을 투여한 후 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사를 시행하여 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
GBH 투여군의 CTXⅡ 생성량은 1주차부터 4주차까지 대조군에 비해 감소되었으며, 특히 실험 3주차에서 대조군에 비해 유의한 감소를 보였다. CTXⅡ 생성량의 감소는 GBH가 골흡수를 억제하는 것으로 생각된다.
제안 방법
GBH 투여가 경골의 골절유합에 미치는 영향을 확인 하고자 경골 골절을 유발한 날부터 4주까지 2주 간격으로 대조군 및 GBH 투여군 각각 3마리씩 경골 X-ray 촬영을 하였다. 대조군 3마리 모두 0주차부터 4주차까지 골절이 유발된 부위의 경계선이 관찰되었고 유합이 아직 많이 이루어지지 않았다(Fig.
GBH 투여가 골절유합에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험 시작일로부터 4주차까지 2주 간격으로 대조 군과 실험군 각각 3마리씩 경골 골절 부위 x-ray를 촬영 하였다. 그 결과, 대조군에서는 4주차에 아직 유합이 이 루어지지 않아 골절 부위의 경계선이 뚜렷하게 관찰되 었고, GBH 투여군은 점차 골절 부위의 경계선이 옅어 지면서 4주차에는 골의 윤곽이 드러나 유합이 진행되고 있는 것이 육안적으로 관찰되었다.
계지복령환이 골절유합에 미치는 영향을 살펴보기 위 하여 RAW 264.7 cell로 항산화 및 항염증에 관한 효능을 평가하였으며, 경골 골절을 유발한 SD rat을 이용하여 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
7 cell을 이용하여 항산화 및 항염증의 효능을 측정하였다. 또한, 경골 골절을 유발한 SD rat을 이용하여 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사를 시행하였다.
실험 0, 1, 2, 3, 4주차에 ethyl ether로 마취한 뒤 심장천자 채혈의 방법으로 혈액을 채취하였고, 15분간 3,000 rpm 의 속도로 원심 분리하여 골절유합 관련인자들을 측정 하였다.
실험은 경골 골절을 유발하지 않은 정상군, 경골 골절 유발 후 증류수를 투여하는 대조군, 경골 골절 유발 후 GBH를 200 mg/kg의 농도로 투여하는 실험군 등 모두 3개의 그룹으로 나누었으며, 각 그룹당 12마리씩 배정하여 실험을 시행하였다. 실험 2주차, 3주차, 4주차에 각 그룹당 3마리씩 치사하였다.
이에 저자는 계지복령환이 골절유합에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 RAW 264.7 cell을 이용하여 항산화 및 항염증의 효능을 측정하였다. 또한, 경골 골절을 유발한 SD rat을 이용하여 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사를 시행하였다.
대상 데이터
RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입 후 사용하였다.
본 실험에 사용한 계지복령환(Gyejibokryunghwan, GBH)은 ㈜옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하였고, 처방의 구성은 ≪東醫寶鑑≫16)에 근거하였다. 구성 약재와 분량 (1첩)은 Table I과 같다.
실험동물로 5주령의 수컷 SD rat (120~130 g)을 샘타 코 BIO KOREA (Osan, Korea)로부터 공급받은 후 실험 당일까지 고형사료(Purina, Seongnam, Korea)와 물을 충 분히 공급하며 온도는 22±2℃로 습도는 55±15%로 유 지하여, 12시간-12시간(light-dark cycle) 환경에서 2주 간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 적응 후 실험 시작일에 재측정한 SD rat의 체중은 162~172 g이었다.
데이터처리
SPSS 18.0 통계프로그램(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하여 결과는 평균 ± 표준편차(mean±standard deviation)로 표시하고 one-way repeated analysis of variance, post-hoc Duncan을 이용하여 p<0.05, p<0.01, p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
Osteocalcin은 osteocalcin ELISA kit의 측정방법을 이용하여 측정하였다. 각 well에 biotinylated osteocalcin을 100 μL씩 분주하여 30분간 plate mixing시켜 코팅을 진행하였다.
성능/효과
2. NO 및 PGE2의 생성량은 GBH 200 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소하였다.
4. TNF-α의 생성량은 GBH 200 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소하였다.
7. TGF-β 생성량은 GBH 투여군에서 실험 3주차에 유의하게 증가하였다.
8. BMP-2의 생성량은 GBH 투여군이 대조군보다 적었지만 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
GBH 투여가 BMP-2 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 경골 골절을 유발한 0주차부터 4주차까지 1주 간격으로 혈청을 채취해 측정한 결과, 대조군과 GBH 투여군은 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Table Ⅻ).
계지복령환은 항산화 및 항염 작용이 있었고, 골절유합 관련 인자 및 방사선 검사상 골절유합에 유의한 효과가 있음을 확인하였다.
본 연구에서는 골절 시 발생되는 염증반응에 대한 GBH의 항염증 효과를 알아보고자 RAW 264.7 cell에서 cytokine 중 IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성량을 측정하였는 데 IL-1β와 IL-6은 대조군에 비하여 GBH 100㎍/mL와 200 ㎍/mL의 농도에서 유의한 감소를 보였고, TNF-α 는 대조군에 비하여 GBH 200 ㎍/mL의 농도에서 유의한 감소를 보였다.
위의 결과로 볼 때 GBH가 염증 관련 인자들인 NO, PGE2, IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성량을 유의하게 감소시켜 골절 후 초기 염증 반응을 감소시키고 조골세포의 증식을 유도하며 골흡수를 억제시켜 염증기의 기간을 단축해 골 절유합을 촉진할 수 있을 것으로 생각된다.
이상의 연구 결과를 종합하면, 계지복령환은 in vitro 실험에서 DPPH radical 소거능을 농도 의존적으로 증가시켜 항산화 작용이 있음이 밝혀졌고 염증 관련 물질인 NO, PGE2, IL-1β, TNF-α, IL-6의 생성량을 유의하게 감소시켜 항염 작용에도 효과가 있었다. In vivo 실험에 서는 골형성을 나타내는 물질인 osteocalcin, TGF-β의 생성량을 유의하게 증가시켰고 골흡수 지표인 CTXⅡ 생성량은 유의하게 감소시켰다.
후속연구
본 연구는 세포 및 동물 실험을 통해 계지복령환이 골절 치유에 효과가 있음을 객관적으로 규명한 것으로 앞으로 임상에서 어혈로 인한 골절 초기 치료에 적극적인 활용이 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골절은 무엇인가?
골절은 뼈에 가해지는 과도한 힘으로 인하여 뼈의 연속성이 일부 혹은 전체에서 상실된 것을 말하며 대개 주위의 연부조직 손상을 동반한다1). 골절이 발생하면 보통 통증과 압통, 종창, 기능장애 등의 국소증상이 나타나며 심할 경우 호흡곤란, 쇼크 등의 전신증상이 나 타날 수 있다2).
골절이 동반하는 증상은 무엇이 있는가?
골절은 뼈에 가해지는 과도한 힘으로 인하여 뼈의 연속성이 일부 혹은 전체에서 상실된 것을 말하며 대개 주위의 연부조직 손상을 동반한다1). 골절이 발생하면 보통 통증과 압통, 종창, 기능장애 등의 국소증상이 나타나며 심할 경우 호흡곤란, 쇼크 등의 전신증상이 나 타날 수 있다2).
골절의 치유 과정은 어떤 단계들을 거쳐 이루어지는가?
골절의 치유 과정은 조직학적으로 편의상 세 단계로 나뉘는데 이는 염증기, 복원기, 재형성기이다1). 염증기 는 골절이 발생한 직후부터 시작되는데 연관된 혈관이 파열되고 혈종이 발생하면서 염증세포 및 섬유세포가 동원된다19). 이어서 혈소판과 염증세포는 염증성 cytokine 을 분비하고, 혈종은 점차 육아 조직으로 대치된다19). 섬유모세포는 새로운 기질을 만들기 시작하고 파골세포가 출현하기 시작하여 골흡수를 시작한다1). 복원기에는 조골세포, 연골모세포 등의 세포들이 증식되면서 혈종이 있던 부위에는 섬유성 조직과 초자연골 및 미성숙 골로 이루어진 가골이 형성된다3). 이어서 섬유성 조직과 초자연골도 미성숙 골로 치환된다3). 재형성기에는 불필요하고 과잉 형성된 가골이 파골세포에 의해 흡수 되고 조골세포에 의해 성숙한 골이 만들어지면서 골절 이 임상적 그리고 방사선적으로 유합되어 모든 골의 상태가 정상으로 되돌아간다3).
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