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문제 정의
- 더불어 스테로이드 생합성에 관여하는 steroidogenic acute regulatory-related lipid transfer (START) domain-containing 6(StarD6)가 정상 정세관의 정자발생 세포에 주로 발현되지만, 주산기 갑상샘기능저하증 새끼에서는 사이질세포에서 발현됨을 보고하여 갑상샘호르몬이 고환세포의 발생에 영향을 준다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구에서 임신 중인 흰쥐에 PTU를 이용하여 주산기 갑상샘기능저하증을 유도한 후 생식샘기능저하증 모델을 정립할 수 있는 근거를 생식샘호르몬 측정을 통해 제시하고자 하였다.
- 이 연구에서 정립되어 있는 주산기 갑상샘기능저하증 모델을 대상으로 생식샘기능저하증이 유발되는지 확인하였다. PTU를 중단하고 약 2주간 남성호르몬이 감소된 상태가 유지 되었으므로 갑상샘기능저하증에 의한 생식샘기능저하증 모델을 대상으로 한 실험을 계획할 때는 이 기간을 염두에 두어야할 것으로 생각하였다.
가설 설정
- 4,5) 갑상샘호르몬은 버팀세포 (supporting cell, Sertoli cell)의 증식을 억제하고,6) 분화를 촉진하며,7) 버팀세포와 정조세포(spermatogonia) 사이의 치밀이음 (tight junction) 합성을 억제한다.8) 사춘기 이후 버팀세포는 증식을 멈추고 분화를 시작한다. 이때 triiodothyronine (T3)이 버팀세포의 수를 결정하는데, 이는 성인의 고환 용적 및 정자 수와 비례한다고 보고되었다.
제안 방법
- 22) 각 시료의 방사선 양은 Packard Tri-Carb 1500 liquid scintilla tion analyzer를 사용하여 측정하였으며, 스테로이드 농도는 SecuRIA program (Packard)에 의해 결정하였다.
- 05% PTU (Antiroid TM , 부광약품, 대한민국)를 음용 수에 적용하여 임신 15일째부터 출생 후 49일까지 경구로 투여하였다. PTU를 투여하지 않은 군 (PTU ( - ))을 정상대조군 으로 삼았다. 출생 후 28일에 수컷 새끼를 다시 PTU를 지속적으로 투여한 군 (PTU (+))과 PTU를 중단한 군 (PTU (+/ - )) 으로 구분하였다.
- 각 군의 새끼 (n=9)는 출생 후 28일부터 매주 체중의 변화를 측정하였다. 군을 구분한 후 각각 2주, 3주째 되는 날각 개체는 마취상태에서 혈액을 채취하여 혈청 DHT 및 테스토스테론 농도를 측정하였다.
- 각 군의 새끼 (n=9)는 출생 후 28일부터 매주 체중의 변화를 측정하였다. 군을 구분한 후 각각 2주, 3주째 되는 날각 개체는 마취상태에서 혈액을 채취하여 혈청 DHT 및 테스토스테론 농도를 측정하였다. 혈청 내 스테로이드의 측정은 메탄올로 추출하고 이를 모두 증발시킨 시험관에 gelatin phosphate-bufferd saline (GPBS, NaH2PO4/L; 2.
- 등을 이용하여 유도되었다. 시기적으로 갑상샘기능저하증이 생식샘의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 출생 직후14,19) 또는 임신 중기부터 말기 15,16,18) 에 갑상샘기능저하증을 유도하였고, 출생 후 30일부터 90일까지 관찰하였다. 임신 중인 태아부터 갑상샘기능저하증을 유도한 모델에서 부고환 중량이 감소하고, 정자의 운동성이 감소하며, 생물학적 활성을 지닌 남성호르몬(테스토스테론, DHT, 17β-estradiol)과 그 수용체의 활성이 감소하였다.
- 임신 9일 Sprague-Dawley 흰쥐를 다물사이언스(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 12시간 주기로 명암을 조절한 환경에서 물과 음식을 자유롭게 먹을 수 있게 하였다. 동물 실험에 대한 모든 과정은 제주대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받았다(2010-0037).
- 의 방법을 따랐다. 즉, 0.05% PTU (Antiroid TM , 부광약품, 대한민국)를 음용 수에 적용하여 임신 15일째부터 출생 후 49일까지 경구로 투여하였다. PTU를 투여하지 않은 군 (PTU ( - ))을 정상대조군 으로 삼았다.
- PTU를 투여하지 않은 군 (PTU ( - ))을 정상대조군 으로 삼았다. 출생 후 28일에 수컷 새끼를 다시 PTU를 지속적으로 투여한 군 (PTU (+))과 PTU를 중단한 군 (PTU (+/ - )) 으로 구분하였다.
- 군을 구분한 후 각각 2주, 3주째 되는 날각 개체는 마취상태에서 혈액을 채취하여 혈청 DHT 및 테스토스테론 농도를 측정하였다. 혈청 내 스테로이드의 측정은 메탄올로 추출하고 이를 모두 증발시킨 시험관에 gelatin phosphate-bufferd saline (GPBS, NaH2PO4/L; 2.35 g, Na2HPO4/L; 14.54 g, NaCl/L; 8.8 g, Thiomersal/L; 0.1 g, Gelatin/L; 1.0 g, pH 7.4)으로 재조성하여 방사성면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 행하였다. 스테로이드 recovery 는 스테로이드 모두에서 85% 이상이었다.
대상 데이터
- RIA에 사용된 testosterone-3-CMO- BSA과 5α dihydro -testosterone-1 BSA를 토끼에 면역 주사하여 항혈청을 얻은 것을 사용하였다.
- 22) 각 시료의 방사선 양은 Packard Tri-Carb 1500 liquid scintilla tion analyzer를 사용하여 측정하였으며, 스테로이드 농도는 SecuRIA program (Packard)에 의해 결정하였다. 실험 간(inter assay)과 실험 내 (intraassay)의 변이 계수는 P 4 가 각 9.2%와 8.5%, 테스토스테론이 각 9.4%와 7.4%이었고, DHT가 각 8.7%와 6.5%이었으며, 전남대학교 호르몬연구센터에 의뢰하여 측정하였다.
- 임신 9일 Sprague-Dawley 흰쥐를 다물사이언스(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 12시간 주기로 명암을 조절한 환경에서 물과 음식을 자유롭게 먹을 수 있게 하였다.
- 테스토스테론 및 DHT의 RIA21) 는 추적자로 테스토스테론([1,2,6,7- 3H]testosterone, 98Ci/mmol) 및 DHT (5-α dihydro [1,2,4,5,6,7- 3H]testosterone, 129Ci/mmol)을 Amersham (Buckinghamshire, England)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 검사 시간별로 대조군 (PTU ( - ))과 실험군 (PTU (+), PTU ( +/- )) 사이의 통계적 차이는 t 분석법 (t test; Microsoft Excel)으로 유의성을 조사하였다. p값이 0.
- 결과는 평균±표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 주산기 갑상샘기능저하증 모델은 Chang 등18) 의 방법을 따랐다. 즉, 0.
성능/효과
- 28) 설치류에서 생식이 가능할 정도로 고환이 성장하는 시기를 출생 후 약 7주로 예상하고 갑상샘기능저하증 실험에 적용하고 있다.18) 본 실험에서도 주산기 갑상샘기능저하증 모델에서 PTU 처리군은 정상 대조군에 비해 유의하게 체중이 적은 상태였다. PTU 투여를 중단하면 통상 ‘따라잡기 성장 (catch-up growth)’이 관찰된다고 알려졌고,29) 본 실험에서도 PTU를 중단하고 2주까지는 큰 변화가 없었지만 3주째에는 유의한 증가가 관찰되었다(Fig.
- 4,5) 갑상샘 호르몬이 고환에서 비생식세포의 증식과 분화, 스테로이드 생합성, 정자 운동성 조절에 관여하기 때문에 갑상선 기능장애, 즉 갑상샘기능항진증 (thyrotoxicosis) 및 갑상샘기능저하증 (hypothyroidism)은 남성 불임의 상당 부분에 해당할 수 있다.23) 갑상샘기능저하증이 있는 사춘기 이전 환자에서 고환 용적이 증가하였지만 정세관 (seminiferous tubule) 속 성숙 정자는 감소하였다.5,24) 갑상샘기능저하증은 발기력과 사정에 영향을 주었고, 환자는 성적 욕구의 저하를 호소하였다.
- 4,5) 갑상샘 호르몬이 고환에서 비생식세포의 증식과 분화, 스테로이드 생합성, 정자 운동성 조절에 관여하기 때문에 갑상선 기능장애, 즉 갑상샘기능항진증 (thyrotoxicosis) 및 갑상샘기능저하증 (hypothyroidism)은 남성 불임의 상당 부분에 해당할 수 있다.23) 갑상샘기능저하증이 있는 사춘기 이전 환자에서 고환 용적이 증가하였지만 정세관 (seminiferous tubule) 속 성숙 정자는 감소하였다.
- 그러나 동물뿐만 아니라 사람에서도 고환 세포에 갑상샘 호르몬 수용체가 존재한다는 것이 증명됨에 따라 고환이 갑상샘호르몬의 표적 기관 중 하나임이 밝혀졌다.4,5) 갑상샘호르몬은 버팀세포 (supporting cell, Sertoli cell)의 증식을 억제하고,6) 분화를 촉진하며,7) 버팀세포와 정조세포(spermatogonia) 사이의 치밀이음 (tight junction) 합성을 억제한다.8) 사춘기 이후 버팀세포는 증식을 멈추고 분화를 시작한다.
- At the end of experiment, testosterone significantly decreased in PTU (++++) group when compared with NC (**p<0.01) and with a previous week ( #p<0.05), but restored in PTU (+/ - ) group.
- 남성 생식샘 호르몬 중 최종 산물인 테스토스테론과 그 대사산물인 DHT는 갑상샘기능저하증 기간이 길어짐에 따라 지속적으로 감소하였다. PTU 를 중단한 군에서도 중단하고 2주까지는 감소된 상태가 유지 되었지만, 3주째에는 두 호르몬이 모두 유의하게 증가하였다 (Fig. 3 and Fig. 4). 결과적으로 갑상샘기능저하증에 의해 유발된 생식샘기능저하증은 남성호르몬은 PTU를 중단하고 도약 2주간 유지되었지만, 3주가 되면 호르몬 수치도 증가하고 새끼들의 전반적인 상태도 개선된 것으로 판단할 수 있었다.
- PTU 투여를 중단하면 통상 ‘따라잡기 성장 (catch-up growth)’이 관찰된다고 알려졌고,29) 본 실험에서도 PTU를 중단하고 2주까지는 큰 변화가 없었지만 3주째에는 유의한 증가가 관찰되었다(Fig. 2).
- 임신 중인 태아부터 갑상샘기능저하증을 유도한 모델에서 부고환 중량이 감소하고, 정자의 운동성이 감소하며, 생물학적 활성을 지닌 남성호르몬(테스토스테론, DHT, 17β-estradiol)과 그 수용체의 활성이 감소하였다. 결과적으로 갑상샘기능저하증 모델에서 혈청 테스토스테론은 유의하게 감소하였고, 사정을 포함한 성행동이 감소하였으며, 정낭 (seminal vesicle)과 전립샘 (prostate)의 무게가 감소하였다.14,20) 임신성 갑상샘기능저하증은 수컷 새끼들에 정자 활동성 이상, 남성호르몬 생물학적 이용도 (bioavailability) 감소, 남성호르몬 수용체 발현 및 기능 감소, 부고환의 분비능 감소와 같은 이상을 초래하였다.
- 4). 결과적으로 갑상샘기능저하증에 의해 유발된 생식샘기능저하증은 남성호르몬은 PTU를 중단하고 도약 2주간 유지되었지만, 3주가 되면 호르몬 수치도 증가하고 새끼들의 전반적인 상태도 개선된 것으로 판단할 수 있었다.
- 2). 남성 생식샘 호르몬 중 최종 산물인 테스토스테론과 그 대사산물인 DHT는 갑상샘기능저하증 기간이 길어짐에 따라 지속적으로 감소하였다. PTU 를 중단한 군에서도 중단하고 2주까지는 감소된 상태가 유지 되었지만, 3주째에는 두 호르몬이 모두 유의하게 증가하였다 (Fig.
- 은 흰쥐 모델에서 정세관의 성숙과 정자발생이 출생 후 7주면 완성되지만, 주산기 갑상샘기능저하증에서는 출생 후 7주까지 정세관의 성숙이 완성되지 못함을 보고하였다. 더불어 스테로이드 생합성에 관여하는 steroidogenic acute regulatory-related lipid transfer (START) domain-containing 6(StarD6)가 정상 정세관의 정자발생 세포에 주로 발현되지만, 주산기 갑상샘기능저하증 새끼에서는 사이질세포에서 발현됨을 보고하여 갑상샘호르몬이 고환세포의 발생에 영향을 준다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구에서 임신 중인 흰쥐에 PTU를 이용하여 주산기 갑상샘기능저하증을 유도한 후 생식샘기능저하증 모델을 정립할 수 있는 근거를 생식샘호르몬 측정을 통해 제시하고자 하였다.
- 둘째, 장기간 관찰이 불가능해지면서 출생 후 7주에 생존한 새끼의 수가 줄어 통계처리에 필요한 최소한의 새끼를 확보하지 못하였다. 따라서 제시된 검사 결과의 경향을 통해 PTU 중단 후 2주까지 생식샘기능저하증이 유지되고, 3주부터는 따라잡기 성장 등 회복이 나타난다고 언급하였다. 이상의 결과는 추가 실험을 통해 충분한 개체 수를 확보하여 통계적 유의성을 다시 확인할 필요가 있다.
- 임신 중인 태아부터 갑상샘기능저하증을 유도한 모델에서 부고환 중량이 감소하고, 정자의 운동성이 감소하며, 생물학적 활성을 지닌 남성호르몬(테스토스테론, DHT, 17β-estradiol)과 그 수용체의 활성이 감소하였다.
- 정상 대조군 (PTU ( - ))의 체중은 출생 후 28일에 약 65± 3.3 g이었고, 매주 약 30g이 늘어 출생 후 7주에는 약 149.9± 18.9 g을 보였다.
- 첫째, 주산기 갑상샘기능저하증 흰쥐에서 정상 구조가 완성되는 시점을 제시할 수 없었다. 주산기 갑상샘기능저하증을 유발한 새끼들은 출생 후 4주 이후에 정상적인 체중 증가를 보이지 않았다. 출생 후 7주에도 정상적인 고환 구조가 관찰되지 않았다는 보고18)가 있었기 때문에 더 긴 기간을 관찰하고자 계획하였으나 출생 후 6주부터 사망하는 흰쥐가 나타나 정세관의 정상 구조가 나타나는 기간을 특정할 수 없었다.
- 이 연구는 다음과 같은 한계를 갖는다. 첫째, 주산기 갑상샘기능저하증 흰쥐에서 정상 구조가 완성되는 시점을 제시할 수 없었다. 주산기 갑상샘기능저하증을 유발한 새끼들은 출생 후 4주 이후에 정상적인 체중 증가를 보이지 않았다.
- 이 현상은 출생 후 4 주에 PTU 투여를 중단한 군에서도 유사하게 관찰되었다. 특히 따라잡기 성장이 나타나는 출생 후 6주와 7주 사이에 개체 간 차이가 심하게 관찰되면서 성장이 늦은 새끼들이 도태되는 양상을 보였다. 둘째, 장기간 관찰이 불가능해지면서 출생 후 7주에 생존한 새끼의 수가 줄어 통계처리에 필요한 최소한의 새끼를 확보하지 못하였다.
후속연구
- 특히 따라잡기 성장이 나타나는 출생 후 6주와 7주 사이에 개체 간 차이가 심하게 관찰되면서 성장이 늦은 새끼들이 도태되는 양상을 보였다. 둘째, 장기간 관찰이 불가능해지면서 출생 후 7주에 생존한 새끼의 수가 줄어 통계처리에 필요한 최소한의 새끼를 확보하지 못하였다. 따라서 제시된 검사 결과의 경향을 통해 PTU 중단 후 2주까지 생식샘기능저하증이 유지되고, 3주부터는 따라잡기 성장 등 회복이 나타난다고 언급하였다.
- 따라서 제시된 검사 결과의 경향을 통해 PTU 중단 후 2주까지 생식샘기능저하증이 유지되고, 3주부터는 따라잡기 성장 등 회복이 나타난다고 언급하였다. 이상의 결과는 추가 실험을 통해 충분한 개체 수를 확보하여 통계적 유의성을 다시 확인할 필요가 있다.
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