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문제 정의
- S. typhimurium을 대상으로 광회복 또는 암회복이 발생하는지의 여부를 확인하기 위해 추가적으로 실험을 진행하였다.
- 따라서, 본 연구는 크게 세 가지 관점에서 free chlorine/UV 결합 시스템의 효용성을 검토하기 위한 연구를 수행하였다.
- 본 연구는 전해수 발생장치를 통해 생성된 free chlorine을 전 처리로 실시하고, 후 처리로 UV 조사를 실시하는 free chlorine/UV 결합 시스템을 하수처리공정의 소독 단계에 적용 가능성을 평가하기 위해 다양한 미생물을 대상으로 불활성화 효율을 정량적으로 살펴보았다.
제안 방법
- 1시간 경과 후 접종물을 제거하였고, SeaPlaque agarose를 함유한 minimal essential medium (MEM, Gibco, USA)을 보충하였으며, 응고 과정을 거친 후, plaque가 보일 때까지 배양을 실시하였다.
- 2) 전 처리로 free chlorine을 1.5 log (96.84%) 불활성화 한 뒤, 후 처리로 UV를 조사하여 총 4 log 불활성화 되었을 때, 광회복 또는 암회복을 관찰하였다.
- 회분식 반응기 내에서 일정하게 교반하기위해 stirrer와 magnetic bar를 사용하였고, 직류 전원 공급기(TOYOTECH, 30 V, 3 A)를 이용하여 전극에 전원을 공급하였다. 제작된 전해수 발생장치의 효율 평가는 free chlorine의 생성량으로 평가하였으며, 1) 전류 인가 시간, 2) 인가된 전류량, 3) chloride ion의 농도, 4) chloride ion의 source (NaCl, HCl, raw water (wastewater)), 그리고 5) 수온(5, 15, 25, 35℃)에 따른 영향을 살펴보았다. Free chlorine의 농도는 N,N-Diethyl-p-phenylene diamine (DPD, HACH Co.
- E. coli C3000의 culture broth는 100 mL의 DI water 기준으로 tryptone 1 g, glucose 0.1 g, yeast extract 0.1 g, NaCl 0.8 g, CaCl2 0.022 g을 각각 첨가하였고, top agar와 bottom agar는 culture broth의 조성에 7 g/L와 15 g/L의 agar powder를 각각 첨가하였다.
- Plaque assay에서는 MEM 대신 RPMI medium 1640 (Gibco, USA)을 사용하였고, 나머지 과정은 norovirus(murine)와 동일하게 진행하였으며, 마지막 단계인 염색 과정에서 crystal violet을 첨가하여 plaque를 계수하였다.
- typhimurium을 넣은 시료에 불활성화를 시키지 않고, 광회복 또는 암회복과 동일한 조건(positive control)에서도 실험을 진행하였다.
- 7 세포 위에 접종하여 3~4일 동안 CO2 incubator (37℃, 5%)에서 배양을 실시하였다. 감염된 세포는 virus를 방출하기 위해 3번의 동결과 해동 과정을 거쳤다. 세포 파편은 원심분리(2,000 x g, 10분)를 통해 제거하였고, virus가 포함된 상층액을 농축하기 위해 ultrafiltration (Amicon Ultra-15, Merck Millipore, USA)을 이용하여 원심분리(5,000 x g, 10분)를 하였으며, 불활성화 실험에 사용하기 전까지 -80℃ deep freezer에 보관하였다.
- 결합 소독 공정에 의한 미생물(S. typhimurium, rotavirus, norovirus)의 불활성화 실험은 전 처리로 free chlorine 소독, 후 처리로 UV 소독을 진행하였다.
- 광회복은 형광등 (Philips Co., 8 W, Netherland)을 사용하였고, 형광등과 시료의 높이는 약 5 cm로 조절하였으며, 23±1℃의 온도를 유지할 수 있는 incubator에서 실험을 진행하였다.
- 둘째, 병원성 미생물(pathogenic bacteria: S. typhimurium; pathogenic virus: rotavirus, norovirus)을 대상으로 결합소독 공정의 효율을 검토하였다.
- 따라서 본 연구에서는 pathogenic virus (rotavirus and norovirus (murine))와 bacteria (S. typhimurium)을 대상으로 상대적으로 낮은 농도의 free chlorine을 주입하고 (전처리: free chlorine 소독), UV (후처리: UV 소독)처리하여 불활성화 효율을 평가하였다.
- 마지막 단계에서 bacteria를 수확(harvest) 후, 30 mL의 PBS를 이용하여 re-suspending을 실시하였고, ‘stock solution’으로 명명하여 불활성화 실험에 사용하기 위해 냉장보관을 하였다.
- 모든 불활성화 실험은 pyrex 반응기에 10 mM의 phosphate buffer (pH 7.1)와 각각의 미생물이 포함된 30 mL에서 진행하였고, 3회 반복 수행하였다.
- 반응기는 아크릴 재질의 회분식 반응기를 사용하였고, 3개의 DSA 전극을 병렬 구조로 배열하였다.
- 반응이 종료됨에 따라 1 mL씩 sampling을 실시하였고, sampling tube에 미리 sodium thiosulfate를 첨가하여 시료 내 존재하는 잔류 염소를 quenching하였으며, 미생물의 불활성화 정도에 따라 1/1~1/10,000까지 PBS로 희석하여 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서 free chlorine를 생성하기 위해 사용된 전해수 발생 장치의 모식도는 Fig. 1b와 같으며, 일반적으로 염소 발생용으로 흔히 사용되는 전극인 dimensionally stable anodes (DSA)을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 모든 시약은 초고순도 시약을 사용하였으며, 모든 용액의 제조는 3차 초순수(deionized water, DI water)를 사용하였다.
- 본 연구에서는 이러한 단점들을 극복하기 위해 연속적인 소독처리 방법으로써 전 처리로 전기분해를 통해 생성된 전해 염소수를 사용하고, 후 처리로 UV를 조사하는 free chlorine/UV 결합 시스템을 제안하였다.
- 빛의 세기는 (light intensity)는 radiometer (UVX radiometer, UVP, USA)를 이용하여 측정하였고, 반응기와 램프 사이의 거리, 램프 개수를 조절하여 0.1~0.3 mW/cm2로 설정하였다.
- 셋째, UV 소독의 단점인 미생물의 광회복(photo re-pair) 또는 암회복(dark re-pair)에 대해서(Sinha and Häder, 2002) S. typhimurium을 대상으로 UV 소독 공정과 결합 소독 공정을 각각 적용한 후, 회복 효율을 평가하였다.
- UV에 의한 미생물의 불활성화 실험에서는 pyrex 반응기가 UV에 조사됨과 동시에 실험이 시작되었다. 시간이 경과함에 따라 1 mL씩 sampling을 실시하였고, 불활성화 정도에 따라 1/1~1/10,000까지 PBS로 희석하여 분석을 실시하였다. 추가적으로 wastewater 조건에서도 동일하게 실험을 진행하였고, phosphate buffer 조건과 비교 분석을 실시하였다.
- 시료는 미생물의 불활성화 정도에 따라 1/1~1/10,000까지 PBS로 희석하여 분석을 실시하였다.
- 암회복은 광회복과 같은 조건에서 실험을 진행하였고 다만, 빛이 투과되는 것을 방지하기 위해 알루미늄 호일을 이용하여 시료에 조사되는 빛을 차단하였다.
- 이 후, 새로운 culture broth에 재 접종하여 약 4~6시간 동안 배양시켜 신선한 상태의 host를 MS-2 bacteriophage 분석에 사용하였다.
- 접촉 시간이 경과함에 따라 1 mL씩 sampling을 실시하였고, sampling tube에 미리 sodium thiosulfate를 첨가하여 시료 내 존재하는 잔류 염소를 quenching 함으로써 잔류 산화제에 의한 불활성화 영향이 미치지 않도록 하였다.
- 7 세포를 plate에 접종하여 CO2 incubator (37℃, 5%)에서 6시간 동안 배양 및 부착 과정을 실시하였다. 정상적으로 성장된 세포를 확인한 뒤, 그 위에 virus 현탁액을 접종하였다. 1시간 경과 후 접종물을 제거하였고, SeaPlaque agarose를 함유한 minimal essential medium (MEM, Gibco, USA)을 보충하였으며, 응고 과정을 거친 후, plaque가 보일 때까지 배양을 실시하였다.
- 첫째, 다양한 미생물(bacteria: E. coli, S. typhimurium; virus: MS-2 bacteriophage, rotavirus, norovirus (murine))을 대상으로 개별 소독 공정 조건 (UV 소독, free chlorine 소독)에서 불활성화 효율을 정량적으로 살펴보았다.
- 추가적으로 wastewater 조건에서도 동일하게 실험을 진행하였고, phosphate buffer 조건과 비교 분석을 실시하였다.
- 회분식 반응기 내에서 일정하게 교반하기위해 stirrer와 magnetic bar를 사용하였고, 직류 전원 공급기(TOYOTECH, 30 V, 3 A)를 이용하여 전극에 전원을 공급하였다.
대상 데이터
- DSA전극의 형태는 메쉬형(mesh)을 사용하였고, size는 50 x 100 mm (두께: 1 mm)로 조절하였다.
- Norovirus(murine)는 RAW 264.7 세포를 숙주로 사용하였으며, plaque assay를 이용하여 분석하였다 (Lee et al., 2008; Lee and Ko, 2013).
- RAW 264.7 세포 배양용 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco, USA)이며, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA)를 보강하여 이용하였다.
- 광원은 3개의 low pressure UV lamp (germicidal lamp (253.7 nm), 4 W, Philips Co., Netherland)를 사용하였고, 빛이 수직으로 조사되게끔 조절하였다.
- 본 연구에서는 bacteria(E. coli, S. typhimurium)와 virus (MS-2 bacteriophage, rotavirus and norovirus (murine))를 대상으로 실험을 수행하였고, 각각의 미생물에 대한 배양 및 분석방법은 다음과 같다.
- 실험에 사용된 유리 초자(glassware)는 121℃에서 15분간 멸균(autoclaving)과 건조 과정을 거친 후 사용하였다.
이론/모형
- 초기 bacteria의 농도와 불활성화 실험 후 살아있는 bacteria의 농도는 spread plate method를 이용하여 분석하였고, 결과를 colony forming units (CFU)/mL로 나타내었다.
- Free chlorine의 농도는 N,N-Diethyl-p-phenylene diamine (DPD, HACH Co., USA) 시약을 사용한 발색방법으로 Pocket Colorimeter II (HACH Co., USA)를 이용하여 측정하였다.
- MS-2 bacteriophage는 soft agar overlay (double-agar layer) method (Cho et al., 2005; Sjogren and Sierka, 1994)를 이용하여 분석하였고, host로 E. coli C3000을 사용하였다.
- Rotavirus는 숙주 세포로 MA-104를 사용하였으며, plaque assay를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 1) UV 조사에 의한 미생물의 불활성화에서는 bacteria를 매우 효과적으로 불활성화 시킬 수 있었고, virus는 bacteria 보다 약 6배 높은 UV dose를 요구하는 것으로 나타났다.
- 2) 병원성 미생물을 대상으로 free chlorine/UV의 결합 시스템을 적용한 결과, 미량의 free chlorine이 첨가됨에 따라 낮은 UV dose 임에도 불구하고, bacteria를 제어하기 위한 수준의 UV dose를 조사하더라도 virus를 효과적으로 제어할 수 있다는 것을 확인하였다.
- 3) UV 소독에서의 가장 큰 단점은 광회복 또는 암회복에 의해 DNA의 손상이 회복된다는 것이다. 본 연구에서는 UV에 의한 S.
- Bacteria에 비해 virus에서 상대적으로 높은 CT값을 보였고, 2log (99%) 불활성화를 위한 CT 값은 약 0.17 (E. coli), 0.20 (S. typhimurium), 0.23 (MS-2 bacteriophage), 0.27(rotavirus), 0.32 (norovirus (murine)) mg/L.min으로 확인되었으며, 특히 norovirus (murine)에서 상대적으로 높은 CT 값을 요구하는 것으로 나타났다.
- Fig. 2b의 wastewater 조건의 결과에서 나타난 것처럼 (UVT: 76%) phosphate buffer와 동일한 수준의 불활성화 효율을 달성하기 위해서는 20% 이상 더 높은 수준의 UV dose를 필요로 하는 것을 확인할 수 있다.
- Fig. 5a에 나타난 것처럼, 약 3.7 log (99.98%)의 rotavirus 불활성화를 위해서는 60 mJ/cm2의 UV dose를 요구하는데 반해 0.8 mg/L의 free chlorine을 전처리로 실시할 경우 절반인 30 mJ/cm2의 UV dose 만으로 약 4.3 log (99.995%)의 불활성화 효율이 확인되었다.
- UV 또는 free chlorine/UV 복합 시스템을 처리하였을 때, 모든 시료에서 암회복은 관찰되지 않았지만 흥미롭게도 광회복이 관찰되는 것으로 나타났다.
- UV을 단독 처리하게 되면, 1시간 후에 약 2.77 log (99.83%)만큼 회복이 일어나는 것으로 나타났고, 3시간만에 약 3.88 log (99.987%)로 거의 모두 회복이 가능한 것으로 나타났다.
- 또한, 1분 동안 전류를 인가할 경우, 인가된 전류량이 증가할수록 free chlorine의 농도가 증가하는 것으로 나타났고 (Fig. 3b), 이에 반해, chloride ion의 농도 (Fig. 3c), chloride ion의 다양한 소스 (Fig. 3d), 그리고 수온 (Fig. 3e)에 의한 영향은 관찰되지 않았다.
- 마지막으로 S. typhimurium의 경우, free chlorine과 UV 소독의 각각에 의해서도 손쉽게 불활성화 되는 특성에 의해, 0.5 mg/L의 free chlorine만을 주입하고 15 mJ/cm2의 UV dose로 처리하였을 때에도 약 5.7 log (99.9998%)의 높은 수준의 불활성화가 확인되었다 (Fig. 5c).
- 본 연구에서 사용된 조건은 0.5 A의 전류 인가 시, 10분 만에 약 40 mg/L의 free chlorine이 생성됨을 확인하였고 (최대 생성량: 약 54 mg/L, 15분), 동일 전류량에서 시간이 증가함에 따라 free chlorine의 농도가 선형적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3a).
- 본 연구에서는 UV에 의한 S. typhimurium의 불활성화 후 회복 실험에서 암회복은 관찰되지 않았지만 광회복은 발생하는 것을 확인하였으며, free chlorine/UV 결합 시스템을 적용하게 되면 광회복 효과를 저감시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
- 이상의 결과들은 free chlorine/UV 복합 시스템의 탁월한 병원성 미생물의 불활성화 효율을 확인해준다.
- 이와 유사하게 norovirus의 경우에도 1.3 mg/L의 free chlorine을 처리한 경우 bacteria를 처리하기 위한 처리 수준인 20 mJ/cm2의 UV dose에서도 약 4.3 log (99.995%)의 불활성화가 확인되었다 (Fig. 5b).
- 전해수 발생장치를 통해 생성된 free chlorine으로 단독 처리한 경우, bacteria와 virus 모두 효과적으로 불활성화 되는 것을 확인하였으며, wastewater로도 충분히 전해 염소수의 생성이 가능하다는 것을 확인하였다.
- 하지만, free chlorine/UV의 복합 시스템을 적용할 경우, 1시간 후에 약 2 log (99%) 수준으로 회복되는 것을 확인하였으며, 5시간까지 살펴본 결과, 더 이상의 큰 변화가 관찰되지 않았다.
후속연구
- 이처럼, free chlorine/UV 결합 시스템은 free chlorine을 미량으로 사용한다는 경제적인 측면과 소독부산물의 생성 가능성을 낮춤과 동시에 free chlorine의 광분해로 잔류 염소의 영향력을 낮춰 하천 및 해양 생태계의 안전성 측면의 확보가 가능하다는 강점이 있다. 또한, 반응에 의해 OH radical과 chlorine radical이 생성되므로 수중에 존재하는 즉, 하수처리공정에 의해 처리되지 않은 미량오염물질들까지 제어가 가능하기 때문에 후속 연구의 가치는 매우 높을 것으로 판단된다.
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